一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法

本发明涉及甘蔗病害防控，具体涉及一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法。

背景技术：

1、甘蔗黑穗病是我国蔗区威胁最大的病害，我国蔗区甘蔗主栽品种gt42号和05-136宿根蔗的黑穗病平均发病率已达到50％，个别田块高达90％以上，严重影响甘蔗品质和产量。目前，由于对甘蔗黑穗病缺乏监测预警体系，不能对该病害进行及时监测和发出预警，造成该病害防治难；加之我国蔗区甘蔗品种比较单一，缺乏抗病品种，连年种植，菌源长年积累，使得甘蔗黑穗病特别是宿根蔗甘蔗黑穗病逐年加重。甘蔗黑穗病的监测预警是甘蔗黑穗病特别是宿根蔗甘蔗黑穗病防控的前提条件和关键环节，目前甘蔗黑穗病监测预警体系未见报道。因此有必要建立甘蔗黑穗病监测预警体系，对甘蔗黑穗病进行监测和发出预警，为宿根蔗甘蔗黑穗病防控提供科学依据。

技术实现思路

1、本发明的目的是为了解决现有技术存在的上述问题，提供一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法。本发明根据蔗田土壤中甘蔗黑穗病菌数量和甘蔗黑穗病发病率之间的关系对甘蔗黑穗病进行严重度等级划分，从而达到对宿根蔗甘蔗黑穗病监测和发出预警的目的，为宿根蔗甘蔗黑穗病防控提供科学依据。

2、为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

3、一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，包括如下步骤：

4、(1)甘蔗黑穗病菌土壤检测

5、采集甘蔗地土壤，利用土壤dna提取试剂盒提取土壤dna，再利用引物对seq idno.2即上游引物ssbe-2f：cctcgcaaccttggacagt和seq id no.3即下游引物ssbe-2r：gttgatgaaccagagcgtgag进行荧光定量pcr检测，获得样品的ct值，通过标准曲线计算，获得土壤中甘蔗黑穗病菌拷贝数；

6、(2)基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警体系构建

7、依据步骤(1)测得的甘蔗黑穗病菌拷贝数判断甘蔗黑穗病严重度，将甘蔗黑穗病严重度由低至高划分为如下4个等级预警：按0.500g土壤检测统计，1级预警：小于等于1000拷贝数；2级预警：大于1000小于等于10000拷贝数；3级预警：大于10000小于等于15000拷贝数；4级预警：大于15000拷贝数。

8、进一步的，步骤(1)中，所述采集甘蔗地土壤是依据5点取样法进行采集，然后分3个重复，利用土壤dna提取试剂盒分别提取dna。

9、进一步的，步骤(1)中，所述土壤dna提取试剂盒为biofast土壤基因组dna提取试剂盒。

10、进一步的，步骤(1)中，所述标准曲线构建具体步骤如下：利用引物对seq id no.2和seq id no.3对土壤dna进行pcr扩增，获得大小在148bp的特异性片段即甘蔗黑穗病菌(sporisorium scitamineum)be基因dna扩增后的序列片段seq id no.1：cctcgcaaccttggacagtccttacccctcccaacaagacaaagaagcgctactgcgg atcacgaatgattcatgtgccggcacagatggatcttcccaaggccgtccgcctctgg acgctcaccagctcacgctctggttcatcaac，提取质粒，并经梯度稀释成标准质粒，作为模板，进行荧光定量pcr实验后，获得标准曲线：ct值＝-3.8167×log10(拷贝数)+35.848；利用引物对seq id no.2和seq id no.3进行荧光定量pcr检测，获得样品的ct值，将ct值代入标准曲线公式，获得土壤中甘蔗黑穗病菌拷贝数。

11、进一步的，步骤(1)中，pcr反应体系如下：总体积20μl，其中2×master mix 10μl，上游引物10μmol/l 0.4μl，下游引物10μmol/l 0.4μl，dna模板1μl，蒸馏水8.2μl；pcr反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s；重复变性至延伸的步骤，共进行40个循环。

12、进一步的，步骤(1)中，所述荧光定量pcr检测使用的荧光定量pcr仪为analytikjena qtowere3荧光定量pcr仪。

13、进一步的，步骤(2)中，所述1级预警：小于等于1000拷贝数对应的黑穗病发病率为0-10.00％；所述2级预警：大于1000小于等于10000拷贝数对应的黑穗病发病率为10.01-20.00％；所述3级预警：大于10000小于等于15000拷贝数对应的黑穗病发病率为20.01-30.00％；4级预警：大于15000拷贝数对应的黑穗病发病率为大于30.00％。

14、本发明还提供上述不同预警等级的甘蔗黑穗病的处理方法，具体如下：

15、在检测拷贝数并确定甘蔗黑穗病预警等级后，按照如下措施进行处理：

16、1级预警：新植蔗不做处理或者是种植前蔗种采用吡唑嘧菌酯1500倍液浸泡蔗种15分钟；宿根蔗用吡唑嘧菌酯1500倍液在甘蔗苗期喷淋以上药剂1次。

17、2级预警：新植蔗种植前蔗种采用吡唑嘧菌酯1500倍液浸泡蔗种15分钟；宿根蔗用吡唑嘧菌酯1500倍液在甘蔗苗期喷淋以上药剂1-2次。

18、3级预警：新植蔗种植前蔗种采用吡唑嘧菌酯1500倍液浸泡蔗种15分钟；宿根蔗不再留下一年宿根转为新植，种植前蔗种采用吡唑嘧菌酯1500倍液浸泡蔗种15分钟。

19、4级预警：宿根蔗不再留宿根转为新植，种植前蔗种采用吡唑嘧菌酯1500倍液浸泡蔗种15分钟；或者与其他作物轮作。

20、本发明的有益效果：

21、甘蔗黑穗病的监测预警是病害防控的前提条件和关键环节，本发明建立基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警体系，根据蔗田土壤中甘蔗黑穗病菌数量和甘蔗黑穗病发病率之间的关系对甘蔗黑穗病进行严重度等级划分，通过荧光定量pcr对土壤中甘蔗黑穗病菌拷贝数进行检测即可确定黑穗病发病率范围以及预警等级，从而达到对宿根蔗甘蔗黑穗病监测和发出预警的目的，为宿根蔗甘蔗黑穗病防控提供科学依据。

技术特征：

1.一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于，包括如下步骤：

2.如权利要求1所述的一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于：步骤(1)中，所述土壤dna提取试剂盒为biofast土壤基因组dna提取试剂盒。

3.如权利要求1所述的一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于：步骤(1)中，所述标准曲线构建步骤如下：利用引物对seq id no.2和seq id no.3对土壤dna进行pcr扩增，获得大小在148bp的特异性片段即甘蔗黑穗病菌be基因dna扩增后的序列片段seq id no.1，提取质粒，并经梯度稀释成标准质粒，作为模板，进行荧光定量pcr反应后，获得标准曲线：ct值＝-3.8167×log10(拷贝数)+35.848。

4.如权利要求1所述的一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于：步骤(1)中，pcr反应体系如下：总体积20μl，其中2×master mix 10μl，上游引物10μmol/l0.4μl，下游引物10μmol/l 0.4μl，dna模板1μl，蒸馏水8.2μl；pcr反应程序如下：95℃预变性3min，95℃变性15s，58℃退火15s，72℃延伸20s；重复变性至延伸的步骤，共进行40个循环。

5.如权利要求1所述的一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于：步骤(1)中，使用analytikjena qtowere3荧光定量pcr仪进行荧光定量pcr检测。

6.如权利要求1所述的一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，其特征在于：步骤(2)中，所述1级预警：小于等于1000拷贝数对应的黑穗病发病率为0-10.00％；所述2级预警：大于1000小于等于10000拷贝数对应的黑穗病发病率为10.01-20.00％；所述3级预警：大于10000小于等于15000拷贝数对应的黑穗病发病率为20.01-30.00％；4级预警：大于15000拷贝数对应的黑穗病发病率为大于30.00％。

技术总结
本发明公开了一种基于土壤菌源检测的甘蔗黑穗病监测预警方法，涉及甘蔗病害防控技术领域。本发明包括如下步骤：(1)采集甘蔗地土壤，利用土壤DNA提取试剂盒提取土壤DNA，再利用引物对SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3进行荧光定量PCR检测，获得土壤中甘蔗黑穗病菌拷贝数；(2)依据甘蔗黑穗病菌拷贝数判断甘蔗黑穗病严重度，将甘蔗黑穗病严重度由低至高划分为4个等级预警。本发明根据蔗田土壤中甘蔗黑穗病菌数量对甘蔗黑穗病进行严重度等级划分，从而达到对宿根蔗甘蔗黑穗病监测和发出预警的目的，为宿根蔗甘蔗黑穗病防控提供科学依据。

技术研发人员：颜梅新,宋修鹏,张小秋,雷敬超,陈潇航,黄冬梅,李秋芳,覃刘东,韦周泽
受保护的技术使用者：广西壮族自治区农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2025/4/6