一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组

本发明属于农作物育种及应用，具体涉及农作物品种真实性鉴定技术，是一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组。

背景技术：

1、花椰菜（ brassica oleracea l. var.  botrytis）又名菜花、花菜，属于十字花科芸薹属甘蓝的一个亚种，其风味好、营养价值丰富、具有抗癌作用，是世界重要的蔬菜作物之一。花椰菜在我国蔬菜产业中占有重要地位。随着花椰菜产业的发展，种子市场上出现一些杂种以次充好，导致花椰菜品质和产量下降，影响种植户的收入；此外，套牌种子的出现扰乱市场秩序，对品种创新、农业生产的稳定和可持续发展产生不利影响。花椰菜品种鉴定在花椰菜产业中扮演着至关重要的角色，是确保花椰菜种子质量和品种真实性的重要环节，在保障国家粮食安全、保护育种家、育种企业利益以及推广高产优质花椰菜品种等方面具有重要意义。

2、snp标记作为遗传稳定的多态性标记之一，已经广泛应用于花椰菜品种鉴定中。但是，现有的花椰菜品种鉴定技术主要是基于kasp荧光原位扫描平台的竞争性等位基因特异性pcr，每个反应体系只能检测单一样本的1个snp位点，在snp位点数和样本量多的情况下，该方法耗时耗力，无法满足生物育种产业化服务支撑需求。因此，亟需开发一种新的检测方法，能够在一个反应体系中同时检测同一样本多个snp位点，准确高效、特异灵敏、简便快速地完成花椰菜品种鉴定。

3、核酸质谱snp检测技术结合多重pcr技术、iplex单碱基延伸技术和基质辅助激光解吸附电离飞行时间质谱技术（maldi-tof-ms）对snp位点进行基因分型检测，根据延伸产物分子量的不同，经飞行时间质谱将不同分子量的产物区分开，从而达到基因分型的目的。同一个反应管中可同时检测多个snp位点，能满足对snp位点的大规模快速筛查，且具有高灵敏度、高通量、高准确度、成本低、污染小、结果易判读、自动化程度高等特点。由于要在同一反应体系中进行多重扩增，设计的引物组应具有特异性，应避免互相干扰，因此，需要设计出最优的snp标记对应的引物组合进行花椰菜品种鉴定工作。

技术实现思路

1、针对现有花椰菜品种鉴定检测手段检测通量低，不能满足国家生物育种产业需求的现状，本发明的主要目的是建立一种能够同时检测多个snp位点的花椰菜品种鉴定方法和引物组。

2、一种用于花椰菜品种鉴定的30个snp位点的引物组seq id no.1-no.90，其特征在于，所述引物组30对扩增引物对的核苷酸序列如seq id no.1-no.60所示；所述引物组30条延伸引物的核苷酸序列如seq id no.61-no.90所示。

3、

4、

5、

6、

7、

8、本发明所述的扩增引物、延伸引物和/或引物组能用于30个snp位点核酸序列的扩增；所述扩增引物的长度为29bp-30bp，gc含量为46.67-53.33%；所述延伸引物的长度为15bp-28bp，gc含量为38.46-70.59%。

9、上述30个花椰菜snp位点为：chr1:860653[c/g]；chr1:1581568[c/a]；chr1:2022083[a/t]；chr1:9494597[g/t]；chr1:2022902[c/t]；chr1:45449565[t/a]；chr2:3174530[a/g]；chr2:14297682[g/a]；chr2:39230790[t/a]；chr2:65005201[c/t]；chr3:6005226[t/c]；chr4:14063327[c/g]；chr4:52102326[g/a]；chr5:311091[c/t]；chr5:4246754[g/c]；chr5:42917099[g/c]；chr5:42919228[t/c]；chr6:34494441[g/c]；chr6:40582776[g/t]；chr7:6266029[g/a]；chr7:7108476[t/g]；chr7:18611643[c/g]；chr7:49710841[c/t]；chr8:685258[a/g]；chr8:7993815[a/t]；chr8:10333745[c/g]；chr8:10995531[g/a]；chr8:23662826[c/a]；chr8:51980792[t/c]；chr9:2367375[c/t]。

10、本发明所述基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法，该方法以供试花椰菜品种基因组dna为模板，对30个snp位点进行扩增，对花椰菜进行snp分型分析，包括如下步骤：

11、得到花椰菜30个snp位点的核酸序列；设计出引物组seq id no.1-no.90；

12、提取花椰菜样品的基因组dna，以所得基因组dna片段为模板，利用所述引物组为扩增体系进行扩增反应，得到扩增产物；

13、将以上扩增产物进行sap消化，利用所述引物组为延伸体系进行延伸反应，得到延伸产物；

14、将以上延伸产物进行树脂脱盐处理，所得样品上飞行时间质谱仪进行质谱检测，确定花椰菜样品中30个snp位点上的单核苷酸类型。

15、本发明同时也公开了引物基因组在用于对花椰菜品种进行基因型分型检测以及用于花椰菜品种鉴定方面的应用。实验结果显示：本发明涉及的检测方法可实现单管完成30个snp位点的检测，具有高通量、高准确度、高灵敏度等特点。

16、本发明公开的基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组与现有技术相比具有如下优点：

17、本发明公开了一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组。该方法可实现单管检测30个snp位点，具有高准确度、高灵敏度和高特异性，可以解决其它检测技术存在的通量低、单管反应位点过少、成本高和操作繁琐等缺陷，可应用于花椰菜品种鉴定。

18、本发明更加详细的描述如下：

19、一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组：

20、所述的花椰菜30个snp位点检测引物组，引物组核酸序列如seq id no.1-no.90所示。所述引物组30对扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1-no.60所示；所述引物组30条延伸引物的核苷酸序列如seq id no.61-no.90所示。

21、所述引物组包含多重检测引物对；所述引物组包含30对扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1-no.60所示和30条延伸引物的核苷酸序列如seq id no.61-no.90所示。

技术特征：

1.一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定的引物基因组，其特征在于，所述引物基因组包括扩增引物；所述扩增引物的核苷酸序列如seq id no.1-no.60所示。

2.一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定的引物基因组，其特征在于，所述引物组包括延伸引物；所述延伸引物的核苷酸序列如seq id no.61-seq id no.90所示。

3.一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定的引物基因组，其特征在于，所述引物基因组包含权利要求1所述的30对扩增引物seq id no.1-no.60和权利要求2所述的30条延伸引物seq id no.61-no.90：

4.权利要求1所述的扩增引物、权利要求2所述的延伸引物和/或权利要求3所述的引物基因组在用于对花椰菜品种进行基因型检测方面的应用。

5.权利要求1所述的扩增引物、权利要求2所述的延伸引物和/或权利要求3所述的引物基因组在用于花椰菜品种鉴定方面的应用。

6.一种基于核酸质谱技术的鉴定花椰菜品种的方法，其特征在于，所述方法包括：

技术总结
本发明公开了一种基于核酸质谱技术的花椰菜品种鉴定方法和引物组。所述引物组包含30个花椰菜SNP位点的扩增引物对和延伸引物，30对扩增引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1‑NO.60所示；30条延伸引物的核苷酸序列分别如SEQ ID NO.61‑SEQ ID NO.90所示。本发明根据花椰菜30个SNP位点的核酸序列设计检测引物组，利用核酸质谱技术对花椰菜品种进行SNP分型分析，以达到对花椰菜品种鉴定的结果。本发明涉及的检测方法可实现单管完成30个SNP位点的检测，具有高通量、高准确度、高灵敏度等特点。

技术研发人员：王璐,徐石勇,吕明杰,时晓伟,潘静怡,郭融融,杨梦然,王永,兰青阔
受保护的技术使用者：天津市农业科学院
技术研发日：
技术公布日：2025/4/6