一种快速鉴定蓟马科昆虫品种的多重PCR引物及方法

本发明属于昆虫分子鉴定，具体涉及一种快速鉴定蓟马科昆虫品种的多重pcr引物及方法。

背景技术：

1、蓟马是一类体型微小、隐蔽能力强的害虫，属于昆虫纲(insecta)，缨翅目(thysanoptera)，蓟马科(thripidae)，广泛分布于全球热带和亚热带地区，在我国各地均较为常见，蓟马主要栖息于葫芦科、豆科、十字花科、茄科作物上，因其成虫怕强光，所以多在背光场所集中为害，在阴天、清晨、傍晚等光照强度较弱的时间段才会在寄主植物的表面活动。蓟马体型较小，通常长度在1至2毫米之间，前胸后缘有缘鬃，翅细长透明，周缘有许多细长毛，口器为锉吸式，通过锉破植物表皮组织吮吸其汁液，危害嫩梢嫩叶造成嫩梢嫩叶卷曲变硬，心叶不能正常展开，形成畸形；危害幼果后取食部位随着果实膨大产生疤痕，疤痕会随果实的膨大而不断扩展，呈现出不同形状和程度的木栓化，严重时甚至会导致落果，严重影响品质。蓟马除了直接危害作物以外，还会间接传播病毒病。由于蓟马种类多、体积小且易产生抗药性的特点，使其已迅速发展成为制约海南地区瓜菜生产的瓶颈难题。

2、传统的蓟马科昆虫物种鉴定主要依赖于形态学鉴定，主要通过观察其体型、颜色、触角、翅膀形状、口器结构以及腿部特征等方面进行判断，但在形态学鉴定经验较为薄弱，环境条件恶劣等情况下，形态学鉴定并不能很好的对其进行区分，且有分辨错误的风险，导致对蓟马种类的判断失误，进而影响到田间瓜菜害虫防治的效果和进展。因此，需要一种基于分子生物学技术的能够快速、准确鉴定三种蓟马科昆虫以及其混合物的方法。

技术实现思路

1、本发明第一方面的目的，在于提供一种用于检测蓟马的多重pcr检测引物。

2、本发明第二方面的目的，在于提供本发明第一方面的多重pcr检测引物的应用。

3、本发明第三方面的目的，在于提供一种用于检测蓟马的试剂盒。

4、本发明第四方面的目的，在于提供一种用于鉴定蓟马的方法。

5、本发明第五方面的目的，在于提供一种用于检测蓟马的通用引物。

6、为了实现本发明上述的目的，本发明采取的技术方案是：

7、本发明的第一个方面，提供一种用于检测蓟马的多重pcr检测引物。

8、在本发明的一些实施方式中，所述蓟马包括烟蓟马(thrips tabaci)、梳缺花蓟马(frankliniella schultzei)和普通大蓟马(megalurothrips usitatus)。

9、在本发明的一些实施方式中，所述多重pcr检测引物包括用于检测烟蓟马、梳缺花蓟马和普通大蓟马的特异性引物；

10、在本发明的一些实施方式中，所述检测烟蓟马的特异性引物序列如seq id no：3、4所示。

11、在本发明的一些实施方式中，所述检测梳缺花蓟马的特异性引物序列如seq idno：5、6所示。

12、在本发明的一些实施方式中，所述检测普通大蓟马的特异性引物序列如seq idno：7、8所示。

13、本发明的第二个方面，提供本发明第一个方面所述的多重pcr检测引物在(a1)～(a6)中至少一种中的应用：

14、(a1)鉴定烟蓟马；

15、(a2)制备鉴定烟蓟马的产品；

16、(a3)鉴定梳缺花蓟马；

17、(a4)制备鉴定梳缺花蓟马的产品；

18、(a5)鉴定普通大蓟马；

19、(a6)制备鉴定普通大蓟马的产品。

20、在本发明的一些实施方式中，所述产品包括试剂、试剂盒、试纸、芯片、系统中的至少一种。

21、本发明的第三个方面，提供一种用于检测蓟马的试剂盒，所述试剂盒包括本发明第一个方面所述的多重pcr检测引物。

22、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括taq dna聚合酶、dntp、pcr缓冲液、mg2+中的至少一种。

23、在本发明的一些实施方式中，所述试剂盒还包括阴性对照标准品和阳性对照标准品。

24、本发明的第四个方面，提供一种用于鉴定蓟马的方法，其特征在于，包括以下步骤：

25、1)使用权本发明第一个方面所述的多重pcr检测引物、或本发明第三个方面所述的试剂盒对待测样品进行pcr扩增；

26、2)分析扩增产物大小，根据扩增产物条带大小鉴别样本种类。

27、在本发明的一些实施方式中，所述待测样品包括昆虫样本的基因组dna。

28、在本发明的一些实施方式中，所述pcr扩增的反应条件为：以20μl的反应体系计，包括dna模板10～100ng、多重pcr引物浓度均为10μm,用量均为0.4μl、2×pcr buffer 10μl，余下为ddh2o。

29、在本发明的一些实施方式中，所述pcr反应条件为：95℃预变形8～12min；95℃变形20～40s；55～57℃退火50～70s，71～73℃延伸20～40s，共30～40个循环；71～73℃延伸6～10min。

30、具体地，所述pcr反应条件为：95℃预变形10min；95℃变形30s；56℃退火1min，72℃延伸30s，共35个循环；72℃延伸8min。

31、在本发明的一些实施方式中，所述检测方式为琼脂糖凝胶电泳(2％)。

32、在本发明的一些实施方式中，所述蓟马包括烟蓟马、梳缺花蓟马和普通大蓟马。

33、在本发明的一些实施方式中，当扩增产物存在104bp条带时，判断样品中含有烟蓟马；

34、当扩增产物存在237bp条带时，判断样品中含有梳缺花蓟马；

35、当扩增产物存在439bp条带时，判断样品中含有普通大蓟马。

36、本发明的第五个方面，提供一种用于检测蓟马的通用引物，所述引物的序列如seqid no：1、2所示。

37、本发明的有益效果是：

38、本发明利用来自蓟马科昆虫的线粒体基因组coi基因序列设计合成了3对针对不同蓟马科昆虫品种的特异性pcr引物，并利用此引物建立了一个准确、快捷、经济的多重pcr反应，实现了利用分子生物学方法快速鉴定三种蓟马科昆虫品种的新方法，在田间蓟马检测方面具备很高的价值，该发明可以广泛应用于植物保护等领域。

技术特征：

1.一种用于检测蓟马的多重pcr检测引物，其特征在于：

2.权利要求1所述的多重pcr检测引物在(a1)～(a6)中至少一种中的应用：

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：

4.一种用于检测蓟马的试剂盒，其特征在于：

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于：

6.一种用于鉴定蓟马的方法，其特征在于，包括以下步骤：

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于：

技术总结
本发明属于昆虫分子鉴定技术领域，具体涉及一种快速鉴定蓟马科昆虫品种的多重PCR引物及方法。本发明公开了一种快速鉴定蓟马科昆虫品种的多重PCR引物以及方法，该鉴定引物以及多重PCR体系可以对这三种蓟马进行快速、有效、准确的鉴定，烟蓟马、梳缺花蓟马、普通大蓟马的PCR产物条带大小分别为104bp、237bp和439bp。灵敏度烟蓟马的检出限为500拷贝，梳缺花蓟马和普通大蓟马检出限度均为100拷贝。相较于普通PCR单次只能鉴定一种蓟马的种类，该多重PCR体系可以单次完成多种蓟马的种类鉴定，具有操作简单、成本低廉、节约时间等优点，在田间蓟马检测方面具备很高的价值，可以广泛应用于植物保护等领域。

技术研发人员：吴少英,闫文乾,席羽,邢诚,魏思诺,李芬
受保护的技术使用者：海南大学三亚南繁研究院
技术研发日：
技术公布日：2025/3/24