一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体及其应用

本发明涉及生物检测，尤其是指一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体及其应用。

背景技术：

1、阿洛西林(azl)是一种β-内酰胺类抗生素，对多种革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和厌氧菌具有显著的抗菌活性。作为最常用的抗生素之一，它在畜牧业中被广泛用于预防和治疗牛的各种疾病(如乳腺炎)，也常用作牲畜的生长促进剂。azl的不当使用往往会造成食品的残留污染。值得注意的是，只有10-20％的抗生素可以被代谢掉，其余的抗生素会以牛奶和尿液的形式从奶牛体内排出。此外，β-内酰胺是一种持久性化合物，无法通过传统的热处理方法从牛奶中清除。因此，微量的azl可通过食物链在人体内蓄积，对人类健康构成威胁。因此，建立一种准确、高灵敏度的痕量azl检测方法对确保食品安全和人类健康具有重要意义。

2、目前，检测azl的常用方法有高效液相色谱法、分光光度法和反碘滴定法。高效液相色谱法需要昂贵的设备和训练有素的技术人员，而分光光度法和反碘滴定法都比较耗时。因此，迫切需要建立一种快速、灵敏、高效的方法来检测食品样品中的阿洛西林。

3、适配体是一种通过配体指数富集系统进化技术(selex)获得的单链寡核苷酸序列。由于具有成本低、稳定性高、特异性强、易于修饰、体外筛选能力强、无批次间差异等诸多优点，适配体被广泛认为是生物传感器的理想识别元件。通过selex筛选得到的适配体通常包含70到130个碱基(nt)。然而，并非所有碱基都能与靶标分子结合。冗长的碱基序列会导致适配体三维构象的不确定性，增加立体阻碍，阻碍适配体与靶标分子的相互作用，而且冗余碱基也会提高合成成本。因此，保留关键区域和去除冗余碱基的优化设计方法可以增强适配体的亲和性和稳定性，从而进一步优化适配体的性能。而现有技术中仍然缺乏一种对阿洛西林具有高亲和性的核酸适配体。

技术实现思路

1、为此，本发明所要解决的技术问题在于克服现有技术中缺乏一种对阿洛西林具有高亲和性的核酸适配体。

2、为解决上述技术问题，本发明提供了一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体及其应用。首先，本发明通过优化设计方法获得了对azl具有高特异性和高亲和力的核酸适配体。除此以外，本发明基于优化设计的核酸适配体构建了一种简单、灵敏的阿洛西林检测方法。本发明的核酸适配体能够通过静电作用与聚二烯丙基二甲基氯化铵(pdda)结合，使aunps保持良好的分散性，从而淬灭mapbbr3@zif-8的荧光。当样品中不存在azl时，核酸适配体与pdda通过静电作用结合，则aunps呈现分散状态，此时aunps会淬灭mapbbr3@zif-8的荧光；当样本中存在azl时，在azl的作用下，核酸适配体优先与azl结合，游离的pdda会导致aunps的聚集，从而降低aunps对mapbbr3@zif-8的荧光淬灭效果，因此阿洛西林的浓度越高，mapbbr3@zif-8的荧光信号越强。该方法利用mapbbr3@zif-8作为荧光源，将新型钙钛矿纳米材料引入食品安全检测领域，建立了一种简单、灵敏、快速的azl检测方法，能够高效检测azl的含量。

3、本发明的第一个目的是提供了一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体，所述核酸适配体通过对seq id no.1所示的核苷酸序列进行截短优化后得到，所述核酸适配体的基因序列如seq id no.2或seq id no.3所示。

4、进一步地，seq id no.2的基因序列如下所示：

5、attcaattcaggaagacaactccgactagaattgataatcaagaa ttcgtctggggggaatgtgcgagatagtaagtgcaatct

6、seq id no.3的基因序列如下所示：

7、caggaagacaactccgactagaattgataatcaagaattcgtctggggggaatgtgcg

8、本发明的第二个目的是提供了一种上述核酸适配体在制备阿洛西林检测产品中的应用。

9、本发明的第三个目的是提供了一种上述核酸适配体在制备阿洛西林捕获产品中的应用。

10、本发明的第四个目的是提供了一种检测阿洛西林的方法，包括以下步骤：

11、s1、将zif-8与甲胺溴基钙钛矿在有机溶剂存在的条件下反应，得到复合荧光材料；

12、s2、将不同浓度的阿洛西林与上述核酸适配体共孵育，然后加入含有pdda的金纳米颗粒进行二次孵育，最后加入复合荧光材料静置并检测复合荧光材料的荧光信号强度，建立建立阿洛西林浓度与荧光信号强度的标准曲线；

13、s3、将待测样品按照s2的操作，检测荧光信号强度，根据s2中的标准曲线，计算得到待测样品中阿洛西林的浓度。

14、进一步地，步骤s1中所述有机溶剂包括甲苯。

15、进一步地，步骤s1中所述zif-8与甲胺溴基钙钛矿的质量比为(0.5：3)：1。

16、进一步地，步骤s2中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵与所述金纳米颗粒的浓度比为(0.125-5)：5。

17、进一步地，步骤s2中所述共孵育的温度为20-30℃。

18、进一步地，所述甲胺溴基钙钛矿通过将溴化铅、甲基溴化铵与油胺在第二有机溶剂存在的条件下进行混合反应制备得到。

19、进一步地，所述第二有机溶剂包括n,n-二甲基甲酰胺。

20、进一步地，所述油胺的体积与所述溴化铅的质量的比值为(100-400)μl：367mg。

21、进一步地，所述油胺的体积与所述甲基溴化铵的质量的比值为(100-400)μl：112mg。

22、本发明的有益效果：

23、本发明提供了一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体及其应用。本发明通过对核苷酸序列如seq id no.1所示的适配体进行截短优化，得到了对阿洛西林具有高特异性和高灵敏性的核酸适配体。在此基础上，利用优先结合阿洛西林的核酸适配体无法与pdda结合而使pdda呈游离态，游离的pdda会导致aunps聚集，而aunps聚集会导致aunps对mapbbr3@zif-8的荧光淬灭效果降低的原理，将阿洛西林与mapbbr3@zif-8的荧光信号相偶联，构建了一种简单、灵敏的阿洛西林检测方法。本发明的核酸适配体是阿洛西林的新型识别元件，具有灵敏度高、特异性好等优势，将其应用于多种检测方法的构建，能够实现阿洛西林的快速检测。

技术特征：

1.一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体，其特征在于，所述核酸适配体的基因序列如seq id no.2或seq id no.3所示。

2.权利要求1所述的核酸适配体在制备阿洛西林检测产品中的应用。

3.权利要求1所述的核酸适配体在制备阿洛西林捕获产品中的应用。

4.一种检测阿洛西林的方法，其特征在于，包括以下步骤：

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述有机溶剂包括甲苯。

6.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s1中所述zif-8与甲胺溴基钙钛矿的质量比为(0.5：3)：1。

7.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2中所述聚二烯丙基二甲基氯化铵与所述金纳米颗粒的浓度比为(0.125-5)：5。

8.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，步骤s2中所述共孵育的温度为20-30℃。

9.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述甲胺溴基钙钛矿通过将溴化铅、甲基溴化铵与油胺混合反应制备得到。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述油胺的体积与所述溴化铅的质量的比值为(100-400)μl：367mg。

技术总结
本发明涉及一种特异性识别阿洛西林的核酸适配体及其应用，属于生物检测技术领域。本发明对核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的适配体进行截短优化，得到了对阿洛西林具有高特异性和高灵敏性的核酸适配体。在此基础上，利用优先结合阿洛西林的核酸适配体无法与PDDA结合而使PDDA呈游离态，游离的PDDA会导致AuNPs聚集，而AuNPs聚集会导致AuNPs对MAPbBr<subgt;3</subgt;@ZIF‑8的荧光淬灭效果降低的原理，将阿洛西林与MAPbBr<subgt;3</subgt;@ZIF‑8的荧光信号相偶联，构建了一种简单、灵敏的阿洛西林检测方法。本发明的核酸适配体是阿洛西林的新型识别元件，具有灵敏度高、特异性好等优势，将其应用于多种检测方法的构建，能够实现阿洛西林的快速检测。

技术研发人员：王周平,孙安琪,齐硕,李玉,吴羿瑶
受保护的技术使用者：江南大学
技术研发日：
技术公布日：2025/3/18