抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体3B11及其制备与应用方法

本发明涉及生物，特别是涉及一种抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体3b11及其制备与应用方法。

背景技术：

1、猪瘟是由猪瘟病毒(classical swine fever virus,csfv)引起的一种高度致死性、高度传染性的烈性传染病，主要危害家猪和野猪，给世界范围内的养猪业造成了巨大的经济损失。该病被世界动物卫生组织(oie)列为a类传染病，在我国，猪瘟也被列一类动物传染病。

2、猪瘟病毒的毒株主要分为三个基因型。每个基因型又分为多个亚型，如：1.1～1.4型、2.1～2.3型和3.1～3.4型。随着鉴定的基因2.1亚型毒株的增加，该亚型可进一步划分为10个亚亚型。基因2型仍在世界范围内占主导地位，其中基因2.1型毒株则主要在中国以及其他亚洲和欧洲国家流行。

3、csfv是一种属于黄病毒科(flaviridae)、瘟病毒属(pestivirus)成员的单股正链的rna病毒。其基因组包含一个大的开放阅读框(orf)，其两侧是两个非翻译区(5’和3’utr)。其中orf则可编码一个含3898个氨基酸残基的多聚蛋白前体。该多聚蛋白在宿主细胞和病毒自身的特异性蛋白酶的作用下切割成12种成熟的蛋白，包括4种结构蛋白(c、erns、e1、e2)和8种非结构蛋白(npro、p7、ns2、ns3、ns4a、ns4b、ns5a、ns5b)，其中erns、e1和e2为csfv的囊膜蛋白。每个成熟蛋白在猪瘟病毒的生命周期与感染过程中发挥不同的功能。e2蛋白可诱导机体产生大量的中和抗体来抵抗致死量病毒的攻击，是猪瘟病毒的主要免疫原性蛋白。其同时也是建立猪瘟病毒检测方法的首要抗原，还是研究猪瘟病毒抗原变异的主要区域。目前已发现多种抗csfv e2的单克隆抗体及其识别的抗原表位，但绝大部分仅可识别单一基因型的猪瘟病毒；目前尚未能获得与已知基因型的猪瘟病毒均可产生特异性反应的特异性抗体，以用于鉴别诊断csfv病毒感染。

4、此外，根据现有研究成果报道，制备csfv e2单抗的抗原主要通过原核表达体系获得，与天然蛋白结构差异较大，缺乏蛋白的翻译后修饰；在其基础上制备的单克隆抗体，存在与csfv毒株亲和力低、反应性差、灵敏性低等问题。

5、因此，本申请拟提出一种全新单克隆抗体，以解决上述技术问题。

技术实现思路

1、本发明要解决的技术问题是，克服现有技术中的不足，提供一种抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体3b11及其制备与应用方法。

2、为解决技术问题，本发明的解决方案是：

3、提供一种抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体3b11，所述单克隆抗体包含抗体重链的ig结构域vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及抗体轻链的ig结构域vl cdr1、vl cdr2和vlcdr3；其中，所述vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1～3所示；所述vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:4～6所示。

4、作为本发明的优选方案，所述单克隆抗体为全长抗体、fab抗体或f(ab’)2抗体。

5、作为本发明的优选方案，所述单克隆抗体中，轻链可变区的氨基酸序列如seq idno.7所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

6、本发明还提供了编码前述单克隆抗体的基因，其中编码轻链可变区的基因序列如seq id no.9所示，编码重链可变区的基因序列如seq id no.10所示。

7、本发明进一步提供了前述单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

8、(1)基于seq id no：11所示的e2蛋白基因序列，使用seq id no.12和seq idno.13所示的引物构建含e2蛋白序列的重组质粒；

9、(2)利用昆虫表达系统表达并纯化重组csfv e2蛋白；

10、(3)动物免疫重组csfv e2蛋白；

11、(4)通过杂交瘤单克隆抗体技术，筛选获得抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体3b11。本发明还提供了前述任意一种单克隆抗体的应用方法，是以所述单克隆抗体制备用于检测猪瘟病毒的试剂盒。

12、本发明还提供了用于检测猪瘟病毒的试剂盒，该试剂盒包括前述的任意一种单克隆抗体。

13、作为本发明的优选方案，该试剂盒是免疫层析诊断试剂盒或免疫组化试剂盒，使用试剂盒时的检测方式为病原学检测。

14、与现有技术相比，本发明的技术效果是：

15、1、本发明提供的抗猪瘟病毒的单克隆抗体为igg1亚型，该抗体具有效价高、特异性强、亲和力高等优点。

16、2、本发明提供的单克隆抗体灵敏度高、特异性强，与目前已知基因型的猪瘟病毒均可产生特异性反应。

17、3、本发明提供的单克隆抗体可进一步用于猪瘟病毒诊断试剂盒的开发，能够有效进行猪瘟病毒的诊断和净化。

技术特征：

1.一种抗猪瘟病毒e2蛋白的单克隆抗体3b11，其特征在于，所述单克隆抗体包含抗体重链的ig结构域vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3，以及抗体轻链的ig结构域vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3；其中，所述vh cdr1、vh cdr2和vh cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:1～3所示；所述vl cdr1、vl cdr2和vl cdr3的氨基酸序列分别如seq id no:4～6所示。

2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体为全长抗体、fab抗体或f(ab’)2抗体。

3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体中，轻链可变区的氨基酸序列如seq id no.7所示，重链可变区的氨基酸序列如seq id no.8所示。

4.编码权利要求3所述单克隆抗体的基因，其特征在于，其中编码轻链可变区的基因序列如seq id no.9所示，编码重链可变区的基因序列如seq id no.10所示。

5.权利要求1所述的单克隆抗体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

6.权利要求1或2所述任意一种单克隆抗体的应用方法，其特征在于，是以所述单克隆抗体制备用于检测猪瘟病毒的试剂盒。

7.一种用于检测猪瘟病毒的试剂盒，其特征在于，该试剂盒包括权利要求1或2所述的任意一种单克隆抗体。

8.根据权利要求7所述的试剂盒，其特征在于，该试剂盒是免疫层析诊断试剂盒或免疫组化试剂盒，使用试剂盒时的检测方式为病原学检测。

技术总结
本发明涉及生物技术领域，旨在提供一种抗猪瘟病毒E2蛋白的单克隆抗体3B11及其制备与应用方法。该单克隆抗体包含抗体重链的Ig结构域V<subgt;H</subgt; CDR1、V<subgt;H</subgt; CDR2和V<subgt;H</subgt; CDR3，以及抗体轻链的Ig结构域V<subgt;L</subgt; CDR1、V<subgt;L</subgt; CDR2和V<subgt;L</subgt; CDR3；其中，所述V<subgt;H</subgt; CDR1、V<subgt;H</subgt; CDR2和V<subgt;H</subgt; CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:1～3所示；所述V<subgt;L</subgt; CDR1、V<subgt;L</subgt; CDR2和V<subgt;L</subgt; CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO:4～6所示。本发明提供的单克隆抗体为IgG1亚型，该抗体具有效价高、特异性强、亲和力高等优点；灵敏度高、特异性强，与目前已知基因型的猪瘟病毒均可产生特异性反应；可进一步用于猪瘟病毒诊断试剂盒的开发，能够有效进行猪瘟病毒的诊断和净化。

技术研发人员：徐计东,何放,徐慧玲,李肖梁,孙仁杰
受保护的技术使用者：浙江大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/6