结核杆菌抗原组合物及其应用、结核杆菌感染诊断试剂盒的制作方法

本发明涉及生物，尤其是涉及一种结核杆菌抗原组合物及其应用、结核杆菌感染诊断试剂盒。

背景技术：

1、结核病是一种严重危害人类健康的慢性呼吸道传染病，其病原体是结核分枝杆菌（mycobacterium tuberculosis）。结核分枝杆菌主要通过呼吸道传播，亦可通过消化道进入人体。结核分枝杆菌对外界的抵抗力强，在阴湿处能生存5个月以上，因此带菌的痰液是结核分枝杆菌主要的传染源。健康人吸入病人咳嗽或打喷嚏喷出的飞沫，即可引起肺部结核分枝杆菌感染。

2、控制结核病的传播与发展，最有效的方案便是早发现、早治疗。现有的结核诊断按方法分类可分为病原学、分子生物学、影像学及免疫学大致四类。其中病原学及分子生物学是有效的确诊手段，影像学与免疫学作为辅助诊断手段进行补充。

3、病原学包含痰涂片及痰培养两种手段。其中痰涂片即将病人的痰液制成玻片，借助显微镜直接寻找结核分枝杆菌。该方法成本低廉、但灵敏度极低，大约仅能检出约20%左右的结核病人。痰培养则是使用选择培养基培养病人的痰液，观察是否有结核杆菌生长。该方法较痰涂片灵敏度更高，但依然仅有40%左右，且培养时间长达4周，因此仍然存在大量无法检出的结核病人。

4、随着分子生物学的发展，出现了结核菌的核酸检测方法。该方法不要求痰液中的结核菌存活，因此较痰涂片灵敏度进一步提升至50%左右，且极大的缩短了培养时间。此灵敏度已是结核确诊手段的极限。依然存在接近一半的患者无法靠确诊手段检出，以及部分病人感染部位不为肺部（即肺外结核），不产生痰液因此无法检测。

5、作为辅助诊断方法，影像学需结核病灶相对较大才可被影像设备观测到。同时，单纯依靠影像学无法区分结核与其他肺部疾病如肺炎、肺癌。因此，无法确诊的病人一般需要主治医生根据经验综合影像学、免疫学及临床表现等各方面证据下诊断。

6、由于结核菌基本不诱发人免疫系统的体液免疫，因此常规的免疫学抗体检测效果较差。且结核菌几乎不进入血液循环系统，因此免疫学抗原检测也没有效果。近年来，结核的免疫学检测主要围绕免疫系统的细胞免疫开展，即干扰素释放试验（igra）。其原理为将结核菌携带的抗原与淋巴细胞共培养，结核患者的淋巴细胞由于已有初次免疫会产生强烈的再次免疫反应、而健康人的淋巴细胞由于未接触过结核菌携带的抗原仅触发初次免疫反应，其免疫强度弱于再次免疫且激活时间长于再次免疫。

7、igra（interferon-gamma release assay，γ-干扰素释放试验）经过持续的技术发展，现主流的应用方案为使用结核菌特有的esat-6与cfp-10两种抗原，经共培养后检测淋巴细胞释放的γ-干扰素水平来判断样本的感染状态。其灵敏度与特异度均能达到80%~85%左右。然而此性能水平使igra仅能作为辅助诊断存在，其灵敏度与特异性均有需要提升的需求。进一步提升灵敏度可使其检出率极高，可作为有效的筛查手段控制结核病的传播，实现早发现；由于其较分子生物学手段有更高的灵敏度，因此进一步提升特异性则可使其确诊的正确率接近病原学及分子生物学手段，有望为结核病的诊断金标准做出一份贡献。

8、有鉴于此，特提出本发明。

技术实现思路

1、本发明的目的在于提供结核杆菌抗原组合物，以提升结核杆菌感染诊断的灵敏度。

2、为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

3、第一方面，提供了一种结核杆菌抗原组合物，该结核杆菌抗原组合物包含esat-6多肽碎片混合物、cfp10多肽碎片混合物和rv2003c多肽碎片混合物；

4、每种所述多肽碎片混合物分别独立的包含若干多肽，同一所述多肽碎片混合物的多肽来源于同一目的蛋白中连续的氨基酸残基，且所有多肽的序列总和覆盖目的蛋白序列预期区域；

5、所述esat-6多肽碎片混合物的目的蛋白为esat-6蛋白，预期区域为esat-6蛋白全长的至少80%；所述cfp10多肽碎片混合物的目的蛋白为cfp10蛋白，预期区域为cfp10蛋白全长的至少80%；所述rv2003c多肽碎片混合物的目的蛋白为rv2003c蛋白，预期区域为rv2003c蛋白的第1~（50~60）位的至少80%。

6、第二方面，还提供了第一方面的结核杆菌抗原组合物在非诊断和治疗目的的检测结核杆菌或抗结核杆菌抗体，或制备结核杆菌感染诊断试剂盒中的应用。

7、第三方面，还提供了第一方面结核杆菌感染诊断试剂盒，该试剂盒包含第一方面所述的结核杆菌抗原组合物，和用于检测标志物的物质；所述标志物包括ifn-γ。

8、与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

9、本发明通过改进结核杆菌抗原组合物，利用来源于esat-6蛋白、cfp10蛋白和rv2003c部分蛋白的多肽碎片作为抗原，在以ifn-γ作为igra实验的检测标志物中，在未降低igra特异度的情况下有效的提升了检测灵敏度。在优选的方案中本发明还优化了igra实验的检测标志物，在优选的标志物组合中，使igra的灵敏度提高至近95%，有助于使igra成为现行最有效的结核病筛查手段。

技术特征：

1.一种结核杆菌抗原组合物，其特征在于，包含esat-6多肽碎片混合物、cfp10多肽碎片混合物和rv2003c多肽碎片混合物；

2.根据权利要求1所述的结核杆菌抗原组合物，其特征在于，预期区域是目的蛋白中连续的区域，每种所述多肽碎片混合物分别独立的包含n种多肽，n为正整数；按照每种多肽的序列n端第一个氨基酸残基在预期区域序列中的位置，从n端至c端依次标记为第1种多肽、第2种多肽……第i种多肽……至第n种多肽；1≤i≤n；

3. 根据权利要求2所述的结核杆菌抗原组合物，其特征在于，第1~（n-1）种多肽中，每种多肽的长度均为15 aa；第i-1种多肽的c端和第i种多肽的序列的n端存在5 aa的重复序列。

4.根据权利要求1~3任一项所述的结核杆菌抗原组合物，其特征在于，所述esat-6多肽碎片混合物的预期区域为esat-6蛋白全长；

5.根据权利要求1~3任一项所述的结核杆菌抗原组合物，其特征在于，每种所述多肽碎片混合物中任意两种多肽的质量比为（1~5）：（1~5）。

6.根据权利要求1~3任一项所述的结核杆菌抗原组合物，其特征在于，所述esat-6多肽碎片混合物、所述cfp10多肽碎片混合物和所述rv2003c多肽碎片混合物的质量比为（1~5）：（1~5）：（1~5）。

7.权利要求1~6任一项所述的结核杆菌抗原组合物在非诊断和治疗目的的检测结核杆菌或抗结核杆菌抗体，或制备结核杆菌感染诊断试剂盒中的应用。

8.结核杆菌感染诊断试剂盒，其特征在于，包含权利要求1~6任一项所述的结核杆菌抗原组合物，和用于检测标志物的物质；所述标志物包括ifn-γ。

9.根据权利要求8所述的结核杆菌感染诊断试剂盒，其特征在于，所述标志物还包括il-2、ip-10、il-6和tnf-α中的一种或多种。

10.根据权利要求9所述的结核杆菌感染诊断试剂盒，其特征在于，所述标志物包括ifn-γ和il-2；或，所述标志物包括ifn-γ和tnf-α。

技术总结
本发明提供了一种结核杆菌抗原组合物及其应用、结核杆菌感染诊断试剂盒，涉及生物技术领域。该结核杆菌抗原组合物包括多肽碎片混合物形式的抗原，每种所述多肽碎片混合物分别独立的包含若干多肽，每种多肽分别独立的来源于目的蛋白中连续的氨基酸残基，且所有多肽的序列总和覆盖目的蛋白序列预期区域。目的蛋白包括ESAT‑6蛋白、CFP10蛋白和Rv2003c部分蛋白。该结核杆菌抗原组合物提升了结核杆菌感染诊断的灵敏度。

技术研发人员：葛泰宏,何鑫,杨龙,黄献美,林诗婉
受保护的技术使用者：广州迪澳医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/2/10