一种胞嘧啶脱氨编辑器及编辑系统

本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种胞嘧啶脱氨编辑器及编辑系统。

背景技术：

1、碱基编辑工具的出现显著拓宽了crispr/cas系统的应用，从最初的基因敲除、基因调控拓展到更精确的碱基水平编辑。当前，碱基编辑主要通过脱氨酶、糖基化酶等工具实现，支持碱基的转换或颠换。由于这些酶通常偏好作用于单链dna，并结合cas9在靶向过程中形成的r环结构，现有的碱基编辑器主要针对非靶向链(nts)上的碱基进行编辑，这包括经典的脱氨酶基编辑工具be4max和abe8e，它们分别可实现c-to-t和a-to-g的转换。值得注意的是，ddda脱氨酶作为双链脱氨酶，它在编辑模式上有所不同。

2、此外，糖基化酶类碱基编辑器如ggbe、aybe、cgbe和gtbe，则通过切割非靶向链(nts)中的目标碱基，生成无嘌呤(ap)位点，借助dna修复机制实现碱基的转换或颠换，包括c-to-g、t-to-s、a-to-y以及g-to-y的编辑。然而，现有的碱基编辑工具中仍缺乏一种高效实现非靶向链上g-to-a编辑的工具。

3、此前的研究中发现，基于失活的spcas9(dspcas9)构建的碱基编辑器偶尔会出现罕见的脱靶活性，使其在模板链(ts)上实现c-to-t的编辑，从而间接地导致非靶向链上的g-to-a变化。然而，常规的碱基编辑系统通常使用cas9nickase突变体，在这种条件下dna修复更倾向于以非靶向链为模板，使得这些脱靶编辑在修复后不易被检测到。

技术实现思路

1、针对现有胞嘧啶碱基编辑工具不能实现非靶向链g-to-a编辑的局限性，本发明提供了一种胞嘧啶脱氨编辑器及编辑系统。

2、为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

3、第一方面，本发明提供一种胞嘧啶脱氨编辑器，所述胞嘧啶脱氨编辑器从n端至c端依次由脱氨酶evocda1、xten序列和enun1cas12f1蛋白顺序连接而成，所述脱氨酶evocda1、xten序列和enun1cas12f1蛋白的氨基酸序列依次如seq id no.4和seq id no.5所示，所述enun1cas12f1相较于现有的un1cas12f1蛋白(ncbi登录号为a0a482d308.1)具有8个氨基酸突变，依次为143r，244r，393r，437r，447r，331e，147r，203r。

4、本发明通过组合氨基酸突变，能够有效增加蛋白-核酸复合物的稳定性进而增强其编辑效率，优化后的enun1cas12f1具备双链dna高效切割能力，且该优化的蛋白与具备高效胞嘧啶脱氨能力的evocda1脱氨酶组合后能够实现优先对ts链的c-to-t编辑。

5、作为本发明所述的胞嘧啶脱氨编辑器的优选，所述enun1cas12f1蛋白的473位氨基酸还具有丙氨酸突变，进一步对enun1cas12f1的473位氨基酸进行丙氨酸突变，可以实现目标位点靶向链更高效的c-to-t编辑和非靶向链的g-to-a高效编辑，进而降低非靶向链c-to-t编辑效率的氨基酸突变，以实现编辑产物纯度的提高。

6、作为本发明所述的胞嘧啶脱氨编辑器的进一步的优选，所述胞嘧啶脱氨编辑器的c端还连接一个ugi，其氨基酸序列如seq id no.3所示。该胞嘧啶脱氨编辑器具有针对目标位点靶向链c-to-t的编辑能力以及远离pam端的编辑窗口，有效扩展了现有碱基编辑工具的应用范围。

7、作为本发明所述的胞嘧啶脱氨编辑器的进一步的优选，所述胞嘧啶脱氨编辑器还包含dna结合蛋白，所述dna结合蛋白为hmg-d蛋白，其编码基因序列如seq id no.7所示，所述dna结合蛋白位于所述enun1cas12f1蛋白和所述脱氨酶evocda1之间。

8、通过在胞嘧啶脱氨编辑器中加入hmg-d蛋白可以获得更高的靶向链编辑效率与编辑产物纯度，且编辑窗口范围没有变化。借助于enun1cas12f1在pam区域附近的氨基酸突变，能够将pam识别序列从tttr扩展至nttr。

9、第二方面，本发明提供包含所述胞嘧啶脱氨编辑器的胞嘧啶脱氨编辑系统，所述胞嘧啶脱氨编辑器由sgrna引导至目标编辑位点。

10、第三方面，本发明提供编码所述胞嘧啶脱氨编辑器或所述胞嘧啶脱氨编辑系统的多核苷酸。

11、第四方面，本发明提供包含所述多核苷酸的载体。

12、第五方面，本发明提供包含所述载体的细胞。

13、第六方面，本发明一种基因编辑的药物组合物，包含所述胞嘧啶脱氨编辑器、所述胞嘧啶脱氨编辑系统、所述多核苷酸、所述载体或所述细胞。

14、基于所述胞嘧啶脱氨编辑器在脱氨催化时针对靶向链进行c-to-t编辑、间接引起非靶向链g-to-a变化的基础上，本发明提供的药物组合物有望进一步拓展该领域的应用场景，推动精准基因编辑在疾病治疗、基础研究等领域的广泛应用。

15、本发明具有如下有益效果：

16、本发明提出的胞嘧啶脱氨编辑器与现有的胞嘧啶碱基工具相比较，其靶向对象出现了改变，从针对非靶向链进行编辑转为了针对靶向链进行编辑。原有碱基编辑工具不能实现非靶向链g-to-a的编辑，利用本发明的胞嘧啶脱氨编辑器可以通过靶向链的c-to-t编辑间接实现。本发明的胞嘧啶脱氨编辑器的编辑窗口位于远离pam端的11-25nt处，与现有碱基编辑工具的编辑窗口形成了互补。同时，本发明使用的改进后enun1cas12f1本身即具有相较于现有cas12f工具更高的dna双链切割活性，扩展了cas12f的应用潜力，且由于部分氨基酸突变位于pam序列附近，enun1cas12f1的pam识别范围从tttr扩展至nttr，具有更广阔的靶向范围。综上，本工具的开发扩展了现有胞嘧啶碱基编辑工具的应用范围，具有广阔的应用前景。

技术特征：

1.一种胞嘧啶脱氨编辑器，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨编辑器从n端至c端依次由脱氨酶evocda1、xten序列和enun1cas12f1蛋白顺序连接而成，所述脱氨酶evocda1和enun1cas12f1蛋白的氨基酸序列依次如seq id no.4和seq id no.5所示。

2.根据权利要求1所述的胞嘧啶脱氨编辑器，其特征在于，所述enun1cas12f1蛋白的473位氨基酸还具有丙氨酸突变。

3.根据权利要求2所述的胞嘧啶脱氨编辑器，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨编辑器的c端还连接一个ugi，其氨基酸序列如seq id no.3所示。

4.根据权利要求3所述的胞嘧啶脱氨编辑器，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨编辑器还包含dna结合蛋白，所述dna结合蛋白位于所述enun1cas12f1蛋白和所述脱氨酶evocda1之间。

5.根据权利要求4所述的胞嘧啶脱氨编辑器，其特征在于，所述dna结合蛋白为hmg-d蛋白，其编码基因序列如seq id no.7所示。

6.包含权利要求1～5任一项所述胞嘧啶脱氨编辑器的胞嘧啶脱氨编辑系统，其特征在于，所述胞嘧啶脱氨编辑器由sgrna引导至目标编辑位点。

7.编码权利要求1～5任一项所述胞嘧啶脱氨编辑器或权利要求6所述胞嘧啶脱氨编辑系统的多核苷酸。

8.包含权利要求7所述多核苷酸的载体。

9.包含权利要求8所述载体的细胞。

10.一种基因编辑的药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～5任一项所述胞嘧啶脱氨编辑器、权利要求6所述胞嘧啶脱氨编辑系统、权利要求7所述多核苷酸、权利要求8所述载体或权利要求9所述细胞。

技术总结
本发明涉及基因组编辑领域，具体涉及一种胞嘧啶脱氨编辑器及编辑系统。所述胞嘧啶脱氨编辑器从N端至C端依次由脱氨酶evoCDA1、XTEN序列和enUn1Cas12f1蛋白顺序连接而成，所述脱氨酶evoCDA1和enUn1Cas12f1蛋白的氨基酸序列依次如SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示。相较于目前性能最佳的EnAsCas12f，enUn1Cas12f展现出更高的双链切割活性，可实现靶向链的C‑to‑T编辑，具备远离PAM端的编辑窗口，相较于现有编辑器的编辑窗口，扩大了编辑工具的应用场景。

技术研发人员：王小龙,宋梓虢,郭俊璠,陈炳春,黄行许
受保护的技术使用者：西北农林科技大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/7