一种单链抗体及其应用

本发明属于生物工程，具体涉及一种特异性识别狂犬病毒的单链抗体及其在抗狂犬病毒中的应用。

背景技术：

1、狂犬病是一种由狂犬病毒(rabv)感染引起的致命性人畜共患传染病，俗称疯狗病。一直以来，狂犬病都是150多个国家和地区(主要是亚洲和非洲)的一个严重公共卫生问题，一旦病毒感染中枢神经系统并出现临床症状，致死率几乎100％，每年导致全球约60000人死亡。狂犬病的潜伏期通常为2-3个月，但也可能由一周到一年不等，这取决于病毒进入的地点和病毒载量等因素。狂犬病的最初症状包括发热、疼痛和伤口部位异常或无法解释的刺痛、刺痛或灼烧感等一般症状。随着病毒转移到中枢神经系统，大脑和脊髓会出现进行性和致命的炎症。目前没有世卫组织批准的诊断工具用于在临床发病前检测狂犬病毒感染，同时狂犬病发病后也没有特效治疗药物，人类的临床狂犬病可以得到控制，但几乎不能治愈，死亡是不可避免的，而且会导致严重的神经功能缺陷。目前，狂犬病最有效的是通过暴露后预防(pep)来阻止病毒进入中枢神经系统，但有效的狂犬病人用疫苗和免疫球蛋白往往难以获得或负担不起，因此开发治疗狂犬病的药物势在必行。

2、单链抗体(single-chain-antibody，scfv)是由一段柔性短肽(linker)将抗体重链可变区和轻链可变区偶联而成的一种新型基因工程抗体。相较于传统的完整抗体，它没有恒定区片段，免疫原性低，结构简单，分子量小，易进行分子改造，组织穿透能力强，因此在疾病治疗和研究中具有某些独特优势。迄今为止，scfv可以在大肠杆菌、哺乳动物细胞、酵母、植物、和昆虫细胞等多种表达系统中表达，每种宿主在折叠和表达scfv时都有各自的优缺点。大多数情况下，从噬菌体库中筛选得到的scfv足以在elisa、western blot或免疫荧光等研究中使用。

3、噬菌体展示技术是应用基因工程原理，将编码多肽或蛋白的外源基因插入到编码噬菌体外壳基因的相应载体质粒的合适位置形成重组质粒，在其侵染大肠杆菌进行复制的时候，外源基因就会随着噬菌体外壳蛋白基因一起以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面。而以这种方式被展示的蛋白或多肽可以保持相对独立的空间结构和生物活性，再通过生物淘选，筛选出能与靶分子(如酶类、细胞表面受体、化学药物等)具有亲和力并特异性结合的噬菌体。洗脱未结合的游离噬菌体，再通过竞争受体或酸洗脱下与靶分子特异性结合的噬菌体，用洗脱下来的噬菌体感染宿主细胞进行繁殖扩增，经过3-5轮的“吸附-洗脱-扩增”后，与靶分子特异性结合的噬菌体得到高度富集。噬菌体展示技术已是一种应用十分广泛的蛋白质和多肽筛选技术，常用于微生物诊断和治疗、表位标记和筛选、生物医药和抗体工艺的开发等领域。

技术实现思路

1、本发明提供了一种能特异性识别狂犬病毒的单链抗体，其氨基酸序列如seq idno:1所示，编码单链抗体的核苷酸序列如seq id no:2所示。

2、本发明另一目的是提供上述单链抗体的用途，即将其应用在制备抗狂犬病毒药物中。

3、本发明目的通过如下技术方案实现：

4、1、动物免疫及免疫组织的获取

5、取狂犬病毒标准攻击毒株cvs病毒液免疫小鼠，利用间接免疫荧光实验(ifa)和酶联免疫吸附实验(elisa)包被重组狂犬病毒核蛋白测定血清效价，根据测定结果选取特异性好、血清效价高的免疫小鼠，获取其脾脏，破碎收集，冻存备用；

6、2、单链抗体噬菌体文库的构建

7、从小鼠脾脏组织中提起总rna，反转录得到cdna文库，以cdna为模版，采用鼠源抗体特异性扩增引物，进行两轮pcr反应，扩增抗体重链可变区及轻链可变区序列，进行同源重组反应构建单链抗体噬菌粒克隆载体，转化至tg1感受态细胞，构建抗狂犬病毒单链抗体基因文库，对构建的单链抗体基因文库进行辅助噬菌体拯救，经过三轮富集淘筛，随机挑取第三轮淘选后的噬菌体单克隆菌落，培养至对数生长期，加入辅助噬菌体进行拯救，取上清进行elisa检测，筛选亲和力较高的阳性单克隆，并对其进行测序分析，选择序列完整正确的单克隆，将噬菌体单克隆菌落进行扩大培养，辅助噬菌体拯救并沉淀富集后，透析去除内毒素，测定沉淀的噬菌体含量，取单克隆噬菌体与狂犬病毒混合，涡旋混匀后孵育，孵育完成后的混合液与培养的小鼠脑神经瘤细胞(n2a)细胞进行再次孵育，利用western blot、ifa等实验进行单克隆噬菌体中和活性验证。在全部实验验证完成后，选择中和活性最好的单克隆，并对其测序得到的核苷酸序列(seq id no:2)进行再次比对分析，并以此序列获得单链抗体的氨基酸序列(seq id no:1)。

8、本发明的优点和技术效果：

9、本发明利用噬菌体展示技术从免疫小鼠抗体库中筛选抗狂犬病毒的单链抗体，较传统的细胞融合技术相比，操作简单、成本较低、时间短，提高了抗体的发现和筛选效率；

10、本发明获得的单链抗体分子量和免疫原性很低，抗体特异性强、亲和力较高，具有中和狂犬病毒的活性，为狂犬病毒的基础研究及治疗药物的开发提供新思路。

技术特征：

1.一种单链抗体，其特征在于，氨基酸序列如seq id no:1所示。

2.权利要求1所述的单链抗体在制备抗狂犬病毒药物中的应用。

技术总结
本发明公开了一种单链抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，本发明利用噬菌体展示技术从免疫小鼠抗体库中筛选抗狂犬病毒的单链抗体，较传统的细胞融合技术相比，操作简单、成本较低、时间短，提高了抗体的发现和筛选效率；本发明获得的单链抗体分子量和免疫原性很低，抗体特异性强、亲和力较高，具有中和狂犬病毒的活性，为狂犬病毒的基础研究及治疗药物的开发提供新思路。

技术研发人员：张金阳,龚春林,徐瑞贤,李向红,宋玉竹,韩芹芹,夏雪山
受保护的技术使用者：昆明理工大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/7