一种糖基转移酶突变体及其在合成红景天苷中的应用

本发明属于酶工程领域，涉及一种糖基转移酶突变体及其在合成红景天苷中的应用。

背景技术：

1、红景天苷(salidroside)，又红景天甙，分子式c14h20o7，分子量为300.30，是传统中药红景天中一种重要的活性成分，具有抗氧化、抗炎、抗肿瘤、抗心血管疾病、抗衰老等多种药理活性，具有广泛的应用前景。红景天苷是以酪醇(对羟基苯乙醇，tyrosol)为苷元，葡萄糖为糖基供体合成的糖苷类化合物。

2、目前红景天苷的提取方法主要分为植物提取法和化学合成法。从红景天植物中提取面临含量低，提取成本较高，工艺复杂等问题。化学合成过程需要对底物羟基进行选择性保护，且其中用到的多种试剂会对环境产生污染，不符合环保概念，不利于工业生产。

3、以生物合成的方式制备糖苷类化合物是近些年研究的重点方向之一，酶催化生物合成法因操作简单、条件温和、副产物少、收率高和高效绿色环保等优点备受关注。红景天苷主要由酪醇经糖基转移酶糖基化修饰得到，通过相关科学家不断探索和挖掘，以酪醇为底物合成红景天苷的糖基转移酶(ugt73b6，ugt72b14，ugt85a1)已被挖掘和鉴定，并且通过大肠杆菌等微生物实现这些糖基转移酶的异源表达和红景天苷合成。但植物来源的糖基转移酶表达量低，限制了红景天苷的合成。

技术实现思路

1、为解决上述问题，本发明提供一种糖基转移酶突变体及其在合成红景天苷中的应用，通过对糖基转移酶ugtbs进行基于蛋白质结构的定向进化，成功获得高效突变体，提高其生物酶催化酪醇制备红景天苷的产率，并提供一种生物合成红景天苷的方法，该方法红景天苷转化率高，适用于红景天苷的工业化生产。

2、本实验室从枯草芽孢杆菌168中挖掘到了糖基转移酶ugtbs，该酶在大肠杆菌中可以实现可溶性高表达，并在尿苷二磷酸葡萄糖(udpg)存在情况下具有催化酪醇合成红景天苷的活性。

3、利用定向进化理论对酶分子进行改造，从而获得催化效率高的糖基转移酶突变体。本发明依据糖基转移酶的蛋白结构与配体进行模拟对接实验，得到酶与配体的复合物模型。基于蛋白质结构的理性设计，通过对蛋白质晶体结构分析找出其活性位点，并对其进行突变，获得高效合成红景天苷的糖基转移酶突变体，对于工业化生产红景天苷具有重要意义。

4、本发明以实验室前期挖掘到的枯草芽孢杆菌168来源的糖基转移酶ugtbs为模板(其氨基酸序列如seq id no.1所示)，对其进行定点突变，得到突变体ugtbs-m4。

5、本发明提供了一种糖基转移酶突变体，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no:1所示的糖基转移酶ugtbs的氨基酸序列的基础上，将第62位、129位、168位及316位氨基酸同时突变得到的。

6、本发明的一种实施方案中，所述突变体是在氨基酸序列如seq id no:1所示的糖基转移酶ugtbs的基础上，将第62位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，将第129位的丝氨酸突变为苏氨酸，将第168位的苯丙氨酸突变为色氨酸，同时将第316位的酪氨酸突变为丝氨酸得到的，命名为ugtbs-m4。

7、在本发明的一种实施方式中，所述糖基转移酶突变体ugtbs-m4氨基酸序列如seqid no:2所示。

8、本发明还提供了一种编码上述糖基转移酶突变体ugtbs-m4的基因。

9、本发明还提供了一种携带上述基因的重组载体。

10、在本发明的一种实施方案中，所述重组载体是以pet-28a(+)为表达载体。

11、本发明还提供了一种表达上述糖基转移酶突变体，或含有上述基因，或含有上述重组载体的重组细胞。

12、在本发明的一种实施方式中，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。

13、本发明还提供了一种催化合成红景天苷的方法，所述方法为，向含有酪醇的反应体系中，添加所述糖基转移酶突变体ugtbs-m4，或所述重组细胞，反应制备得到红景天苷。

14、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有1～10mmol/l酪醇，2～20mmol/l udpg，1～10％(v/v)dmso，5-40％(v/v)糖基转移酶突变体粗酶液(反应体系中酶浓度为0.1～1mg/ml)，50～200mmol/l tris-hcl缓冲液。

15、在本发明的一种实施方式中，所述反应体系中含有1～30mmol/l酪醇，0.2～20mmol/l udp，50～200mmol/l tris-hcl缓冲液，400～1000mmol/l蔗糖，30-40％(v/v)糖基转移酶突变体粗酶液和15-30％(v/v)蔗糖合酶粗酶液。

16、在本发明的一种实施方案中，所述反应条件为，30～40℃反应0～50h。

17、本发明还公开一种催化剂，含有前述的糖基转移酶突变体、或前述的基因、或前述的重组细胞。

18、有益效果：

19、本发明挖掘到的微生物红景天苷糖基转移酶和植物来源的红景天苷糖基转移酶相比，本发明的糖基转移酶更容易在大肠杆菌等模式菌株中高效可溶性表达；

20、本发明获得的糖基转移酶突变体对酪醇的糖基化活力显著提高。采用糖基转移酶突变体催化酪醇合成红景天苷的滴度最高可达55.0g/l，底物转化率为97.9％，时空产率为1.3g/l/h。

21、实验结果证实本发明能够促进生物合成红景天苷的工业化生产，成功地解决了红景天苷酶法制备过程中糖基转移酶活力低的关键问题，所得突变体表现出非常大的工业应用前景。

技术特征：

1.一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在seq id no:1所示的糖基转移酶ugtbs氨基酸序列的基础上，将第62位、129位、168位及第316位氨基酸同时突变得到的。

2.如权利要求1所述的一种糖基转移酶突变体，其特征在于，所述突变体是在seq idno:1所示的糖基转移酶ugtbs的基础上，将第62位的异亮氨酸突变为天冬酰胺，将第129位的丝氨酸突变为苏氨酸，将第168位的苯丙氨酸突变为色氨酸，同时将316位酪氨酸突变为丝氨酸得到的。

3.编码权利要求2所述糖基转移酶突变体的基因。

4.携带权利要求3所述的基因的重组载体。

5.表达权利要求2所述的糖基转移酶突变体、或含有权利要求3所述的基因、或含有权利要求4所述的重组载体的重组细胞。

6.如权利要求5所述的重组细胞，其特征在于，所述重组细胞是以细菌或真菌为表达宿主。

7.一种催化合成红景天苷的方法，其特征在于，所述方法为，向含有酪醇的反应体系中，添加权利要求2所述的糖基转移酶突变体，或权利要求5或6所述重组细胞，反应制备得到红景天苷。

8.如权利要求7的催化合成红景天苷的方法，其特征在于，所述反应体系中含有1～10mmol/l酪醇，2～20mmol/l udpg，1～10％v/v dmso，5-40％v/v糖基转移酶突变体粗酶液，50～200mmol/l tris-hcl缓冲液；反应体系中酶浓度为0.1～1mg/ml。

9.权利要求2所述的糖基转移酶突变体、或权利要求3所述的基因、或权利要求5或6所述的重组细胞在催化合成红景天苷中的应用。

10.一种催化剂，其特征在于，含有权利要求2所述的糖基转移酶突变体、或权利要求3所述的基因、或权利要求5或6所述的重组细胞。

技术总结
本发明属于酶工程领域，涉及一种糖基转移酶突变体及其在合成红景天苷中的应用。本发明在如SEQ ID NO:1所示的糖基转移酶氨基酸序列的基础上通过分子改造技术进行迭代饱和突变，改造后的糖基转移酶突变体酶活性和催化效率大大提高。在特定位点的突变可显著地促进酪醇底物糖基化活性。通过对得到的突变体菌株进行诱导表达、蛋白纯化获得突变体酶。改造后的糖基转移酶突变体催化酪醇糖基化反应的底物转化率可达到95％以上，产量达到55.0g/L，为红景天苷的生产提供了一条高效且绿色的新途径。

技术研发人员：朱富成,闫子旭,赵科学,李小利,戴景莉,马静波,臧永军
受保护的技术使用者：皖西学院
技术研发日：
技术公布日：2025/4/10