一种用于巢式PCR检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的引物和探针组合及其试剂盒的制作方法

本发明涉及生物技术，具体涉及一种用于巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的引物和探针组合及其试剂盒。

背景技术：

1、尿路感染是由病原微生物侵袭人体引起机体发病的疾病。目前，医院对尿路感染的诊断标准是尿培养，具体而言，是以1-3天的微生物培养后菌落计数大于105个/ml为阳性判断标准。然而尿培养，尿路感染治疗方式主要依赖于抗生素，近年来，由于抗生素和免疫抑制剂的广泛应用，革兰阳性菌和真菌尿路感染增多，耐药甚至耐多药现象呈增加趋势。因此，科学的选药不仅要对细菌种类进行鉴定，还有测试抗生素敏感性。然而尿培养存在很多局限性，例如尿液样本容易污染，培养过程耗时长，阳性率过低等。此外，其他的诊断技术，例如尿常规或者尿沉渣镜检等初步的诊断方法能够获取的细菌信息非常有限。因此，临床上医生不得补首先经验性使用广谱性抗生素。一旦选错药，不仅延误治疗，破坏机体菌群平衡，还会增加耐药菌株的感染比例，增加治疗的难度。

2、pcr技术能够将诊断时间从若干天缩短到数个小时，然后仍然存在假阴/阳性情况，灵敏度有待提高。基于合理的预扩增和完全嵌套的分子设计，巢式pcr技术在保证良好的特异性检测的同时，还能有效降低检测限至十几个菌；在分析低丰度样品时，能够明显改善的信噪比，从而保证更好的精准度和可靠性，极大减少漏检。在先申请专利《一种巢式pcr检测尿路感染致病菌的引物和探针组合、试剂盒及应用》中公开了六种尿路感染致病菌的引物和探针序列，检测范围包括大肠杆菌、肺炎克雷伯氏菌、粪肠球菌、屎肠球菌，产气肠杆菌和奇异变形杆菌。然而，该专利的肺炎克雷伯菌引物设计是基于reca基因片段，然而该基因片段同样存在于大肠杆菌中，该引物会引起两种菌的交叉扩增。因此，在先专利肺炎克雷伯菌的引物和探针序列设计无法满足特异性需求。另外，在先专利中还未涉及耐药基因的检测需求，对抗生素的敏感性或者耐药性的情况不够清晰，无法更准确地指导临床用药。

技术实现思路

1、为了解决现有技术存在的缺陷与不足，本发明提供了一种用于巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的引物和探针组合及其试剂盒。

2、本发明采用的技术解决方案是：一种用于巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌的引物和探针组合，所述的引物和探针组合包括检测肺炎克雷伯菌的第一外引物of、第一外引物or、第一内引物if、第一内引物ir以及第一taqman探针。

3、所述的第一外引物of的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的第一外引物or的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述的第一内引物if的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述的第一内引物ir的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述的第一taqman探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

4、一种用于巢式pcr检测泌尿道病原菌耐药基因的引物和探针组合，所述的耐药基因包括碳青霉烯类耐药基因kpc和甲氧西林耐药基因meca，所述的引物和探针组合包括检测的第二外引物of、第二外引物or、第二内引物if、第二内引物ir以及第二taqman探针；检测甲氧西林耐药基因meca的第三外引物of、第三外引物or、第三内引物if、第三内引物ir以及第三taqman探针。

5、所述的第二外引物of的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述的第二外引物or的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述的第二内引物if的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述的第二内引物ir的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述的第二taqman探针的核苷酸序列如seq id no.10所示。

6、所述的第三外引物of的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述的第三外引物or的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述的第三内引物if的核苷酸序列如seq id no.13所示；所述的第三内引物ir的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述的第三taqman探针的核苷酸序列如seq id no.15所示。

7、一种巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌的试剂盒，所述的试剂盒包括所述的引物和探针组合以及巢式pcr扩增用试剂。

8、一种同时检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的试剂盒，所述的试剂盒包括同时检测肺炎克雷伯菌和甲氧西林耐药基因meca的引物和探针组合或同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯类耐药基因kpc的引物和探针组合。

9、所述的引物和探针组合为所述的检测泌尿道肺炎克雷伯菌的引物和探针组合与所述的检测耐药基因的引物和探针组合两两混合得到。

10、本发明的有益效果是：本发明提供了一种用于巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的引物和探针组合及其试剂盒，本发明设计的引物不引起其他泌尿道病原菌的交叉扩增，能满足特异性要求；外源性干扰物庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、左氧氟沙星、哌拉西林、呋喃妥因对实验结果均无影响，制备的试剂盒可同时检测泌尿道病原菌和耐药基因，检测方便、简单、可靠，相对于普通得菌种鉴定，耐药基因检测可以更准确指导临床用药，避免无效治疗。

技术特征：

1.一种用于巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌的引物和探针组合，其特征在于，所述的引物和探针组合包括检测肺炎克雷伯菌的第一外引物of、第一外引物or、第一内引物if、第一内引物ir以及第一taqman探针。

2.根据权利要求1所述的用于巢式pcr检测泌尿道病原菌的引物和探针组合，其特征在于，所述的第一外引物of的核苷酸序列如seq id no.1所示；所述的第一外引物or的核苷酸序列如seq id no.2所示；所述的第一内引物if的核苷酸序列如seq id no.3所示；所述的第一内引物ir的核苷酸序列如seq id no.4所示；所述的第一taqman探针的核苷酸序列如seq id no.5所示。

3.一种用于巢式pcr检测泌尿道病原菌耐药基因的引物和探针组合，其特征在于，所述的耐药基因包括碳青霉烯类耐药基因kpc和甲氧西林耐药基因meca，所述的引物和探针组合包括检测碳青霉烯类耐药基因kpc的第二外引物of、第二外引物or、第二内引物if、第二内引物ir以及第二taqman探针；检测甲氧西林耐药基因meca的第三外引物of、第三外引物or、第三内引物if、第三内引物ir以及第三taqman探针。

4.根据权利要求3所述的用于巢式pcr检测泌尿道病原菌耐药基因的引物和探针组合，其特征在于，所述的第二外引物of的核苷酸序列如seq id no.6所示；所述的第二外引物or的核苷酸序列如seq id no.7所示；所述的第二内引物if的核苷酸序列如seq id no.8所示；所述的第二内引物ir的核苷酸序列如seq id no.9所示；所述的第二taqman探针的核苷酸序列如seq id no.10所示。

5. 根据权利要求3所述的用于巢式pcr检测泌尿道病原菌耐药基因的引物和探针组合，其特征在于，所述的第三外引物of的核苷酸序列如seq id no.11所示；所述的第三外引物or的核苷酸序列如seq id no.12所示；所述的第三内引物if的核苷酸序列如seq idno.13所示；所述的第三内引物ir的核苷酸序列如seq id no.14所示；所述的第三taqman探针的核苷酸序列如seq id no.15所示。

6.一种巢式pcr检测泌尿道肺炎克雷伯菌的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括权利要求1-2任意一项所述的引物和探针组合以及巢式pcr扩增用试剂。

7.一种同时检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括同时检测肺炎克雷伯菌和甲氧西林耐药基因meca的引物和探针组合或同时检测肺炎克雷伯菌和碳青霉烯类耐药基因kpc的引物和探针组合。

8.根据权利要求7所述的同时检测肺炎克雷伯菌和耐药基因的试剂盒，其特征在于，所述的引物和探针组合为权利要求1中所述的引物和探针组合与权利要求3中所述的引物和探针组合两两混合得到。

技术总结
一种用于巢式PCR检测泌尿道肺炎克雷伯菌和耐药基因的引物和探针组合及其试剂盒，本发明设计的引物和探针序列不引起其他泌尿道病原菌的交叉扩增，能满足特异性要求。此外，外源性抗生素干扰物庆大霉素、妥布霉素、头孢他啶、左氧氟沙星、哌拉西林、呋喃妥因对实验结果均无影响，满足抗干扰性要求。制备的试剂盒可同时检测泌尿道肺炎克雷伯菌及耐药基因，检测方便、简单、可靠。相对于普通的菌种鉴定，耐药基因检测可以更准确指导临床用药，避免无效治疗。

技术研发人员：张乐翔,赵远锦,叶小敏
受保护的技术使用者：温州青峰生物医疗科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2025/3/3