一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组、试剂盒及检测方法

本发明涉及分子生物学，特别是涉及一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、蘑菇中毒是严重的食品安全问题之一。条盖盔孢伞含有鹅膏肽类毒素，可以造成急性肝损害型中毒，死亡率仅次于鹅膏属的剧毒蘑菇。条盖盔孢伞生长在腐木上、锯末堆上或者腐殖质高的地上，其最大的特征是“小个子，黄褐色，有条纹，长树上”，是最常见的剧毒蘑菇之一。误食条盖盔孢伞中毒后会立即出现呕吐腹泻症状，多数患者在第二天好转，进入1-2天“假愈期”，随后出现明显肝功能损伤并有神经系统症状、凝血功能障碍等并发症。在毒蘑菇中毒事件发生时，中毒者往往不知道自己食用的是哪种毒蘑菇，还极有可能提供不了未煮熟的样品，这就大大提高了后续鉴定与治疗的难度。为了对症治疗就需要准确检测出毒蘑菇的种类，医护人员只能通过中毒者提供的餐后剩余物以及患者的呕吐物来进行检测。但目前，条盖盔孢伞的识别和鉴定主要基于形态特征和dna分子序列，需要专业的分类学知识和分子生物鉴定条件，而且耗时长，不利于基层医疗单位对中毒患者的及时诊断与治疗。并且呕吐物中的目标样本经过胃液消化，其dna发生了不同程度的降解，现有的检测方法很难准确检出。因此，快速、准确、低成本的检测技术能够为毒蘑菇中毒患者和中毒事件处置提供重要的技术支撑。

2、实时荧光pcr通过对荧光基团信号的采集达到检测目的，分为染料法和探针法两种。duan等人在2024年基于分子身份证技术、实时荧光pcr技术和稳定的碱基差异位点设计了taqman-mgb探针和特异性引物，建立了鹅膏属檐托鹅膏组中致死类鹅膏菌的快速检测技术。探针法通过探针可以增加反应收集信号的特异性，只有探针结合的片段上发生扩增才能收集到信号，但是合成探针的成本较高；而染料法经济实惠，但其特异性不如探针法。因此，开发一种经济实惠、适用性强、特异性高、灵敏度高的条盖盔孢伞快速鉴定技术，对于蘑菇中毒事件中蘑菇物种鉴定和对症治疗具有重要作用。

技术实现思路

1、本发明的目的是提供一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组、试剂盒及检测方法，以解决上述现有技术存在的问题。本发明开创性地将分子身份证技术与实时荧光pcr染料法相结合，将条盖盔孢伞的分子身份证作为正向引物来设计特异性引物，利用荧光染料sybr green i检测pcr过程中积累的扩增产物，实现了45min内完成对条盖盔孢伞的检测与鉴定。该方法方便快捷，特异性强，灵敏度高，具有很好的适用性，能够为毒蘑菇的快速检测提供技术支持。

2、为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

3、本发明提供一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组，所述引物组包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。

4、本发明还提供上述引物组在制备快速检测条盖盔孢伞的试剂或试剂盒中的应用。

5、本发明还提供一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的试剂，所述试剂中包含上述引物组。

6、本发明还提供一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的试剂盒，所述试剂盒包括上述引物组。

7、进一步地，所述试剂盒还包括sybr green qpcrmix。

8、本发明还提供上述引物组、上述试剂或上述试剂盒在快速检测条盖盔孢伞中的应用。

9、本发明还提供一种快速检测条盖盔孢伞的方法，包括如下步骤：

10、提取待测样本的dna；

11、以所述nda为模板，采用上述引物组进行实时荧光pcr扩增；

12、若扩增曲线图出现荧光信号和扩增曲线，说明待测样本中含有条盖盔孢伞；若未出现荧光信号或扩增曲线，说明待测样本中不含有条盖盔孢伞。

13、进一步地，所述实时荧光pcr扩增的反应体系为：2×sybr green qpcr mix 5μl，10μmol/l上下游引物各0.5μl，dna模板1μl，rnase-free water 3μl。

14、进一步地，所述实时荧光pcr扩增的反应程序为：95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。

15、本发明公开了以下技术效果：

16、本发明自条盖盔孢伞its序列中筛选出一段22bp的短序列作为条盖盔孢伞的分子身份证，根据该分子身份证设计特异性引物，并开创性地将分子身份证技术与实时荧光pcr染料法结合，利用荧光染料sybr green i检测pcr过程中积累的扩增产物，实现了45min内完成对条盖盔孢伞的鉴定，检出限可达到10-5ng。sybr green i作为一种广泛应用的荧光标记物，能够以非特异的方式和双链dna中的小沟相互作用并融合其中，然而并不影响其对单链dna的作用。若未被溶液表面上的双链dna所吸附，sybr green i仅产生很少的荧光；相反，一旦与其发生结合，就发射出很强的荧光信号，使得检测结果更直观。

17、与染料法相比，本发明的检测方法特异性更强；与探针法相比，本发明的检测方法成本更低；同时具有特异性强、灵敏度高的特点，检测结果不受样本水煮和胃液消化的影响，适用于蘑菇中毒事件中的餐后残留物和呕吐物的检测，为毒蘑菇的快速检测提供了技术支持。

技术特征：

1.一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组，其特征在于，所述引物组包括如seq id no.1所示的上游引物和如seq id no.2所示的下游引物。

2.权利要求1所述的引物组在制备快速检测条盖盔孢伞的试剂或试剂盒中的应用。

3.一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的试剂，其特征在于，所述试剂中包含权利要求1所述的引物组。

4.一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括权利要求1所述的引物组。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括sybr green qpcrmix。

6.权利要求1所述的引物组、权利要求3所述的试剂或权利要求4或5所述的试剂盒在快速检测条盖盔孢伞中的应用。

7.一种快速检测条盖盔孢伞的方法，其特征在于，包括如下步骤：

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光pcr扩增的反应体系为：2×sybr green qpcr mix 5μl，10μmol/l上下游引物各0.5μl，dna模板1μl，rnase-free water3μl。

9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述实时荧光pcr扩增的反应程序为：95℃2min，95℃15s，60℃30s，40个循环。

技术总结
本发明公开了一种基于分子身份证快速检测条盖盔孢伞的引物组、试剂盒及检测方法，属于分子生物学技术领域。本发明的引物组包括如SEQ ID NO.1所示的上游引物和如SEQ ID NO.2所示的下游引物。本发明自条盖盔孢伞ITS序列中筛选出一段22bp的短序列作为条盖盔孢伞的分子身份证，根据该分子身份证设计特异性引物，并开创性地将分子身份证技术与实时荧光PCR染料法结合，利用荧光染料SYBR Green I检测PCR过程中积累的扩增产物，实现了45min内完成对条盖盔孢伞的鉴定。该方法方便快捷，特异性强，灵敏度高，具有很好的适用性，能够为毒蘑菇的快速检测提供技术支持。

技术研发人员：田恩静,张东含
受保护的技术使用者：吉林农业大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/17