一种基于qPCR鉴定苹果边腐病菌的引物组、组合物、试剂盒及方法

本发明属于病菌检测，尤其涉及一种鉴定苹果边腐病菌的pcr扩增引物组、组合物、试剂盒及方法。

背景技术：

1、目前，世界各国苹果产业已成为一个重要的产业，但病害的发生严重制约了其发展。苹果边腐病菌是一种重要的植物病原真菌，被世界各国列为检疫对象。

2、苹果边腐病菌(cadophora malorum)的分类地位：fungi，ascomycota，pezizomycotina，leotiomycetes，helotiales，cadophora，苹果边腐病菌病原为苹果背芽突霉(cadophora malorum，异名phialophora malorum、sporotrichum malorum)，主分布于美国、英国、荷兰和意大利等国家。苹果边腐病菌引起的苹果边腐病会造成储藏期苹果和梨大量果实腐烂，使其产量遭受巨大损失。该病菌是一种土传真菌，不仅能在表层土壤中存活越冬，还能在树皮上越冬，其传播主要是依靠人类活动。

3、传统方法鉴定该病原菌比较困难，而荧光定量pcr方法具有快速、灵敏、特异、准确等特点，因此利用荧光定量pcr方法检测苹果边腐病菌具有较高的实用价值。

4、中国发明cn200910236111.1说明书中记载了检测苹果边腐病菌的引物和探针及其检测方法，所述引物的核苷酸序列如seq id no.1&2所示，所述探针的核苷酸序列如seqid no.3所示；该发明中方法以样品总dna为模板，利用上述引物和探针进行实时荧光pcr扩增，每个循环结束采集数据，反应结束后根据扩增曲线判定结果，其探针特异性好，检测方法快速简单，准确性高，灵敏度高，为进出口安全提供了保证。

5、但该专利及已有研究中欠缺完备的分类体系为依据，以数量有限的物种序列为基础完成特异性引物设计及验证工作，筛选范围有限，可能会存在特异性或覆盖度不足的技术问题。

技术实现思路

1、为了解决以上技术问题，本发明提供一种基于qpcr鉴定苹果边腐病菌的pcr扩增引物组及特异性探针、组合物、试剂盒及方法，克服现有技术中存在的上述不足，检测方法具有良好的可重复性和稳定性，相比较其他检测技术，荧光定量pcr具有检测时间短，检测灵敏度更高、特异性更强、所需模板微量、有效解决pcr污染问题、自动化程度高等特点；且特别的是，单个样品的检测时间可缩短为1小时，可同时进行大批量样本分析，具有良好的特异性、重复性和稳定性，适用于苹果边腐病菌定性检测，也可定量检测。

2、解决以上技术问题的一组鉴定苹果边腐病菌的pcr扩增引物组，其正向引物phma-f核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物phma-r核苷酸序列如seq id no.2所示。

3、具体的，phma-f核苷酸序列为atacacgaacgcgacacaaagaat。

4、phma-r核苷酸序列为accgtgctctcctgagattgtt。

5、一种鉴定苹果边腐病菌的组合物，包括检测用的引物探针，所述引物探针由权利要求1所述的引物组及特异探针组成，引物组正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示。

6、优化方案中，探针phma-fam核苷酸序列如seq id no.3所示。

7、具体的，探针phma-fam核苷酸序列为agtactgataaacatgcaggc。

8、本发明中所述的pcr引物组，可在制备检测或辅助检测苹果边腐病菌的产品、在制备鉴定或辅助鉴定苹果边腐病菌的产品、在制备定量检测苹果边腐病菌的产品、在制备预测植物感染苹果边腐病菌的产品、在检测或辅助检测苹果边腐病菌、在鉴定或辅助鉴定苹果边腐病菌、在定量检测苹果边腐病菌、或在预测植物感染苹果边腐病菌中的应用。

9、本发明中一种基于qpcr技术检测苹果边腐病菌的试剂盒，包括上述所述的鉴定苹果边腐病菌的组合物。

10、本发明中鉴定苹果边腐病菌的试剂盒，所述试剂盒还包括qpcr探针法专用mix(2×)、权利要求2及3中所述的特异性引物对及其探针、去离子水组成。。

11、进一步，所述的试剂盒在鉴定苹果边腐病菌中的应用。

12、本发明中一种基于qpcr技术鉴定苹果边腐病菌的方法，包括以下步骤：

13、(1)利用苹果边腐病菌提取获得dna系列稀释后为模板，采用权利要求1和权利要求2中所述引物探针进行荧光定量pcr，建立边腐病菌dna与ct值的标准曲线；

14、(2)提取待测样本总dna或微生物dna；

15、(3)以待测样品dna为模板，采用权利要求1和权利要求2中所述引物探针进行荧光定量pcr，获得ct值；

16、(4)检测得到的ct值与步骤(1)所建立的标准曲线ct最大值进行比较，若样品检测ct大于在最小检测模板浓度所对应的ct，即样品ct大于标曲最大ct时，该样品可判断为未检出；若样品检测ct小于在最小检测模板浓度所对应的ct，即样品ct小于标曲最大ct时，该样品可判断为检出，检出ct可代入所建立的标准曲线计算样品中苹果边腐病菌浓度(ng/μl)。

17、优化方案中，所述标准曲线为y＝-3.4027x+28.407，其中，y为ct值，x为lgdna浓度ng/μl。qpcr中的标准曲线为基于模板及ct拟合而成。

18、所述步骤(2)中qpcr反应体系及条件：采用两步法taqman荧光探针的方法进行实时荧光定量pcr反应，总体系为20μl，其中pro taq hs probe premix(2x)10μl，特异性引物phma-f/phma-r(均10μm)各0.5μl，荧光探针phma-fam(10um)0.5μl，ddh2o7.5μl，dna模板1μl。

19、本发明中组合物对待测样品进行qpcr检测，根据qpcr检测结果判断或辅助判断待测样品是否为苹果边腐病菌，或待测样品是否含有苹果边腐病菌，或待测样品是否感染苹果边腐病菌。

20、本发明采用荧光定量pcr方法可对苹果边腐病进行特异性检测，特异性良好，只需少量dna即可快速的检测；检测成功率高。

技术特征：

1.一组鉴定苹果边腐病菌的pcr扩增引物组，其特征在于，其正向引物phma-f核苷酸序列如seq id no.1所示，反向引物phma-r核苷酸序列如seq id no.2所示。

2.一种鉴定苹果边腐病菌的组合物，其特征在于：包括检测用的引物探针，所述引物探针由权利要求1所述的引物组及特异探针组成，引物组正向引物序列如seq id no.1所示，反向引物序列如seq id no.2所示。

3.根据权利要求2所述的一种鉴定苹果边腐病菌的组合物，其特征在于：探针phma-fam核苷酸序列如seq id no.3所示。

4.权利要求1所述的pcr引物组，在制备检测或辅助检测苹果边腐病菌的产品、在制备鉴定或辅助鉴定苹果边腐病菌的产品、在制备定量检测苹果边腐病菌的产品、在制备预测植物感染苹果边腐病菌的产品、在检测或辅助检测苹果边腐病菌、在鉴定或辅助鉴定苹果边腐病菌、在定量检测苹果边腐病菌、或在预测植物感染苹果边腐病菌中的应用。

5.一种基于qpcr技术检测苹果边腐病菌的试剂盒，其特征在于：包括权利要求2及3所述的组合物。

6.根据权利要求2所述的苹果边腐病菌试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括qpcr探针法专用mix(2×)、权利要求2及3中所述的特异性引物对及其探针、去离子水组成。

7.权利要求5或6所述的试剂盒在鉴定苹果边腐病菌中的应用。

8.一种基于qpcr技术鉴定苹果边腐病菌的方法，其特征在于：包括以下步骤：

9.根据权利要求8所述的一种基于qpcr技术鉴定苹果边腐病菌的方法，其特征在于：所述标准曲线为y＝-3.4027x+28.407，其中，y为ct值，x为lgdna浓度ng/μl。

10.根据权利要求8所述的一种基于qpcr技术鉴定苹果边腐病菌的方法，其特征在于：所述步骤(2)中qpcr反应体系及条件：采用两步法taqman荧光探针的方法进行实时荧光定量pcr反应，总体系为20μl，其中pro taq hs probe premix(2x)10μl，特异性引物phma-f/phma-r(均10μm)各0.5μl，荧光探针phma-fam(10um)0.5μl，ddh2o 7.5μl，dna模板1μl。

技术总结
本发明属于病菌检测技术领域，尤其涉及一种基于qPCR鉴定苹果边腐病菌的引物组、组合物、试剂盒及方法，包括构建基于ITS‑LSU‑TEF‑TUB序列的多基因系统发育树、苹果边腐病菌样品及引物探针设计、标准曲线的构建、苹果边腐病菌PCR扩增检测和反应结束后根据扩增曲线判定结果步骤。本发明中检测方法具有良好的可重复性和稳定性，相比较其他检测技术，荧光定量PCR具有检测时间短，检测灵敏度更高、特异性更强、所需模板微量、有效解决PCR污染问题、自动化程度高等特点。

技术研发人员：蔡磊,赵鹏,巩文峰,刘芳,李善魁,次仁央金
受保护的技术使用者：中国科学院微生物研究所
技术研发日：
技术公布日：2025/4/7