一种肝纤维化标志物circRNA及其应用

本发明属于生物医药领域，尤其涉及一种肝纤维化标志物circrna及其应用。

背景技术：

1、肝纤维化是慢性肝损伤的一种常见的伤口愈合反应，其特征是在活化的肝星状细胞(hscs)中，过量的细胞外基质(ecm)的积累。肝星状细胞激活为增殖的肌成纤维细胞已被确定为实验性和人肝损伤中纤维化的核心驱动因素。因此，了解肝星状细胞激活的调控机制是推进肝纤维化治疗策略的先决条件。

2、有氧糖酵解是活化的肝星状细胞的一种代谢表型，而乳酸是糖酵解代谢途径的必然产物。一旦肝星状细胞进入激活状态，乳酸水平迅速升高，阻断细胞内乳酸的积累可抑制细胞增殖，抑制肌成纤维细胞特征相关基因的表达，促进活化肝星状细胞向静态表型转移。越来越多的证据表明抑制乳酸积累是逆转肝星状细胞表型转化和缓解肝纤维化的有效策略。然而，代谢重构产生的乳酸在调节肝星状细胞表型和功能中的具体作用和精确机制仍不清楚。

3、环状rna(circrna)属于长ncrna家族，不容易被核酸酶降解。它可以在细胞中长期稳定存在，作为临床诊断、疾病预防和治疗的靶点和预后标志物具有潜在的应用价值。环状rna的失调在多种疾病的病理生理过程中被报道，包括癌症、肝纤维化、糖尿病和其他疾病。尽管观察到在肝星状细胞激活过程中乳酸产量增加，但乳酸与环状rna的表达谱和生物学功能相关的潜在机制尚未完全阐明。

技术实现思路

1、本发明所要解决的技术问题在于如何探究环状rna在肝纤维化疾病发生发展中的作用，肝星状细胞乳酸产生与环状rna的表达谱和生物学功能相关的潜在机制尚未完全阐明，提供环状rna在作为肝纤维化标志物及治疗靶点中的应用。

2、本发明通过以下技术手段实现解决上述技术问题的：

3、本发明的第一方面提出circrna作为分子标志物在制备用于诊断、检测、监测或预测肝纤维化进展的产品中的应用，所述circrna为circsmad2；所述circsmad2的核苷酸序列如seq id no.1所示。

4、本发明的第二方面提出一种用于治疗肝纤维化的病毒包装质粒，所述病毒包装质粒为腺相关病毒aav包装的含上述circsmad2的质粒。

5、aav腺相关病毒表达质粒为aav2/8-sh-circsmad2。腺相关病毒aav具有表达滴度高、安全性高、宿主免疫反应轻微等优势，近年来成为基因治疗领域应用广泛的病毒载体之一。

6、优选的，所述病毒包装质粒的构建方法是：将circsmad2的序列插入到上述aav腺相关病毒表达质粒的多克隆位点以构建得到。构建的病毒包装质粒，依次包含aav2/8、α-sma肝星状细胞启动子、circsmad2序列和luc荧光标签。其能够有效实现circsmad2的在肝星状细胞的敲低。

7、本发明的第三方面提出一种肝纤维化相关的标志物环状rna(circsmad2)，所述circsmad2的核苷酸序列如seq id no.1所示。

8、本发明的第四方面提出一种抑制circsmad2表达和/或使其活性降低的物质，包括针对抑制circsmad2的rna干扰分子、反义寡核苷酸、小分子抑制剂、shrna，实施慢病毒感染或基因敲减的物质。

9、优选的，所述抑制circsmad2表达和/或使其活性降低的物质包括sirna。

10、更优选的，所述sirna的核酸序列如seq id no.2所示或如seq id no.3所示。

11、优选的，所述sirna可以以核酸片段的形式发挥抑制功能，也可以质粒的形式发挥抑制功能，也可以直接连接到aav载体上发挥抑制功能或通过转染脂质体发挥功能，还可以能够表达sirna的宿主细胞发挥抑制功能。

12、本发明的第五方面提出一种核酸片段、重组载体或宿主细胞，所述核酸片段、重组载体或宿主细胞包含和/或表达如seq id no.2或seq id no.3所示的sirna。

13、本发明的第六方面一种抗肝纤维化的药物，所述药物包含上述所述的核酸片段、重组载体或宿主细胞。

14、本发明的第七方面提出上述病毒包装质粒、抑制circsmad2表达和/或使其活性降低的物质在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

15、本发明的有益效果在于：

16、1、本发明首次揭示了环状rna circsmad2结构稳定及其在肝纤维化中的应用，提出了circsmad2在肝纤维化进展中的关键作用，为肝纤维化的临床诊断评估提供分子标志物新指标，并为肝纤维化的药物研发提供新靶点。

17、2、本发明提供了一种新的环状rna，命名为circsmad2，其为根据seq id no.1所示核苷酸序列，经反向剪切形成的环形rna分子结构。该环状rna circsmad2由宿主基因smad2第2和第11外显子环化形成，基因组定位为chr18:76422093-76464430，长度为1502nt。

18、3、circrna在制备治疗肝纤维化的药物中的应用，通过circrna敲低，能够显著改善小鼠肝纤维化，因此circrna可以作为肝纤维化的潜在治疗靶点。我们通过筛选鉴定了差异表达的环状rna，发现circsmad2在乳酸激活的肝星状细胞中表达上调，沉默circsmad2可抑制星状细胞的活化，并减轻小鼠肝纤维损伤。

19、4、本发明发现circsmad2在肝纤维化患者中表达显著上调，提示该环状rna可作为肝纤维化临床诊断新的生物标志物。经实验验证，抑制circsmad2的表达能明显降低肝纤维化标志物产生，提示以本环状rna为靶点的药物可抑制肝纤维化中糖酵解水平，可作为抗肝纤维化药物应用。

技术特征：

1.circrna作为分子标志物在制备用于诊断、检测、监测或预测肝纤维化进展的产品中的应用，其特征在于，所述circrna为circsmad2；所述circsmad2的核苷酸序列如seq idno.1所示。

2.一种用于治疗肝纤维化的病毒包装质粒，其特征在于，所述病毒包装质粒为腺相关病毒aav包装的含上述circsmad2的质粒。

3.根据权利要求2所述的病毒包装质粒，其特征在于，其通过将circsmad2的序列插入到aav腺相关病毒表达质粒的多克隆位点以构建得到；构建的病毒包装质粒，依次包含aav2/8、gfap肝星状细胞启动子、circsmad2序列和luc荧光标签。

4.一种肝纤维化相关的标志物circsmad2，其特征在于，所述circsmad2的核苷酸序列如seq id no.1所示。

5.一种抑制circsmad2表达和/或使其活性降低的物质，其特征在于，包括针对抑制circsmad2的rna干扰分子、反义寡核苷酸、小分子抑制剂、shrna，实施慢病毒感染或基因敲减的物质。

6.根据权利要求5所述的物质，其特征在于，包括sirna。

7.根据权利要求6所述的物质，其特征在于，所述sirna的核酸序列如seq id no.2所示或如seq id no.3所示。

8.一种核酸片段、重组载体或宿主细胞，其特征在于，所述核酸片段、重组载体或宿主细胞包含和/或表达如seq id no.2或seq id no.3所示的sirna。

9.一种抗肝纤维化的药物，其特征在于，所述药物包含权利要求7所述的核酸片段、重组载体或宿主细胞。

10.权利要求2-3任一项所述的病毒包装质粒、权利要求5-7任一项所述的物质在制备治疗肝纤维化的药物中的应用。

技术总结
本发明提出了一种肝纤维化标志物circRNA及其应用，属于生物医药领域。circRNA为circSMAD2，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明通过试验发现，circSMAD2在人肝癌，肝硬化血清和肝纤维化小鼠原代肝星状细胞中均显著高表达，因此可将circSMAD2作为肝纤维化临床诊断的依据。本发明进一步利用circSMAD2构建腺相关病毒AAV敲低载体，经体内验证发现circSMAD2能显著改善小鼠肝纤维化。因此，circSMAD2可作为肝纤维化临床治疗的新型靶点和潜在药物，为肝纤维化的治疗药物研发提供了新方向。

技术研发人员：张磊,王啸,吴宝明,张国栋,赵明玉,杨荣全
受保护的技术使用者：安徽医科大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/7