一种结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体及其应用

本发明属于分子生物学领域和生物催化，具体涉及一种来源于结核分支杆菌的酪氨酸酚裂解酶突变体及其应用。

背景技术：

1、左旋多巴（l-dopa，全名3,4-二羟苯丙氨酸）是一种多巴胺的前体药物，本身没有直接的药理活性。它能够通过血脑屏障进入中枢神经系统，在多巴脱羧酶的作用下转化为多巴胺，从而发挥治疗作用，因此被广泛应用于帕金森病的药物治疗。

2、目前，左旋多巴的传统制备方法主要包括植物提取和有机化学合成。然而，植物提取（如从猫豆或藜豆中提取）受季节和原料供应限制，产量较低，无法满足市场需求。有机化学合成通常以香草醛和乙内酰脲为原料，经过多步反应制得左旋多巴，但这一方法需要大量金属催化剂，反应效率和产物旋光活性较低，且会带来严重的环境污染，因此在现代工业中逐渐受到限制。

3、相比之下，生物酶催化法因其催化效率高、绿色环保的特点，已成为左旋多巴工业化生产的重要方向。酪氨酸酶可以将l-酪氨酸催化生成左旋多巴，但会进一步将产物氧化为多巴醌，增加后续分离难度；转氨酶以l-天冬氨酸或l-谷氨酸和3,4-二羟基苯丙酮酸为底物生产左旋多巴，但其催化活性较低，尚未实现工业化；而酪氨酸酚裂解酶（tpl）通过催化邻苯二酚、丙酮酸和氨合成左旋多巴，具有更高的催化活性和反应速度，且需要辅酶磷酸吡哆醛。基于其显著优势，tpl在左旋多巴工业化生产中展现出巨大的应用潜力。

4、目前已知的合成左旋多巴的tpl广泛存在于各种微生物中，尤其是肠道微生物，具体包括草生欧文氏菌（ erwinia herbicola）、氟氏柠檬酸杆菌（ citrobacter frenudii）、具核梭杆菌（ fusobacterium nucleatum）、克吕沃尔氏菌（ kluyvera intermedia）等，但在目前的应用场景中，已有的tpl仍然受到酶活性不足的限制，因此仍然需要能够有效提高合成左旋多巴活性的tpl突变体，来提高其生产效率。

技术实现思路

1、为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的目的在于提供一种结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体及其应用。该突变体能提高合成左旋多巴活性。

2、本发明通过克隆来源于结核分支杆菌的酪氨酸酚裂解酶基因，以及对酪氨酸酚裂解酶基因进行理性设计，并将突变的基因嵌入表达质粒pet-28a（+）两酶切位点 ndei和 xhoi之间，转入 e.colibl21（de3）获得表达菌株 e.colibl21（de3）/pet28a-i384v，经纯化表达得到酪氨酸酚裂解酶突变体i384v。i384v与野生型酪氨酸酚裂解酶具有相似的最适温度、最适ph，但i384v显示比野生型酪氨酸酚裂解酶更高的比酶活和催化效率。酪氨酸酚裂解酶突变体i384v对合成左旋多巴比野生型高40%左右。

3、本发明的目的通过下述技术方案实现：

4、一种结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体，该酪氨酸酚裂解酶突变体是将来源于结核分支杆菌（ mycobacterium tuberculosis）的酪氨酸酚裂解酶的第384位异亮氨酸（ile，i）突变为缬氨酸（val，v），其氨基酸序列如seq id no：3所示。

5、一种所述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的编码基因。

6、优选的，所述编码基因的核苷酸序列如seq id no：2所示。

7、上述突变体相关的生物材料，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

8、（a）含有上述编码基因的表达盒；

9、（b）含有上述编码基因的重组表达载体；

10、（c）含有（a）中所述表达盒的重组表达载体；

11、（d）含有上述编码基因的重组微生物；

12、（e）含有（a）中所述表达盒的重组微生物；

13、（f）含有（b）或（c）中所述重组表达载体的重组微生物。

14、进一步的，（b）、（c）中所述重组表达载体的出发载体为pet系列的载体等；优选为pet-28a(+)载体。

15、进一步的，（d）、（e）、（f）中所述重组微生物对应的宿主微生物选自原核生物等；所述原核生物包括埃希氏菌属（ escherichia）等细菌。更具体而言，所述原核生物是大肠杆菌（ escherichia coli， e. coli），具体可为大肠杆菌bl21（de3）。

16、上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在制备提高合成左旋多巴活性的酪氨酸酚裂解酶突变体中的应用。

17、上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料在合成左旋多巴中的应用。具体为：以上述突变体、编码基因或突变体相关的生物材料为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸、乙酸铵为底物，以亚硫酸钠和edta为助剂，以磷酸吡哆醛为辅因子，反应得到左旋多巴。

18、一种获得上述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的方法，包括如下步骤：将编码结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的基因进行表达，得到结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体。

19、进一步的，将编码结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的基因转化至大肠杆菌bl21(de3)中进行表达，得到结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体。

20、本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

21、（1）本发明的酪氨酸酚裂解酶突变体保留了野生型酪氨酸酚裂解酶原有的最适温度和ph，表明突变后仍然适合左旋多巴的合成。

22、（2）本发明的酪氨酸酚裂解酶突变体i384v具有更高的比酶活、更好的催化效率，且比酶活提高了40.5%。

23、（3）本发明的酪氨酸酚裂解酶突变体对左旋多巴和酪氨酸的合成具有更高的合成效率。与野生型相比，该突变体对左旋多巴的合成效率提高了38.4%，具有大规模应用的广泛前景。

技术特征：

1.一种结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体，其特征在于，所述突变体的氨基酸序列如seq id no：3所示。

2.编码权利要求1所述的结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的基因。

3.根据权利要求2所述的基因，其特征在于：

4.权利要求1所述的结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体相关的生物材料，其特征在于，为下述生物材料中的任意一种或多种组合：

5.根据权利要求4所述的生物材料，其特征在于：

6.根据权利要求5所述的生物材料，其特征在于：

7.权利要求1所述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～6任一项所述生物材料在制备提高合成左旋多巴活性的酪氨酸酚裂解酶突变体中的应用。

8.权利要求1所述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～6任一项所述生物材料在合成左旋多巴中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于：以权利要求1所述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体、权利要求2～3任一项所述基因或权利要求4～6任一项所述生物材料为催化剂，以邻苯二酚、丙酮酸、乙酸铵为底物，以亚硫酸钠和edta为助剂，以磷酸吡哆醛为辅因子，反应得到左旋多巴。

10.一种获得权利要求1所述结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：将编码氨基酸序列如seq id no：3所示的结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体的基因进行表达，得到权利要求1所述的结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体。

技术总结
本发明公开一种结核分支杆菌酪氨酸酚裂解酶突变体及其应用，属于分子生物学领域和生物催化技术领域。该突变体是将来源于结核分支杆菌的酪氨酸酚裂解酶的第384位异亮氨酸突变为缬氨酸而得到，记为突变体I384V。I384V与野生型酪氨酸酚裂解酶具有相似的最适温度、最适pH，但I384V显示比野生型酪氨酸酚裂解酶更高的比酶活和催化效率。与野生型相比，酪氨酸酚裂解酶突变体I384V对合成左旋多巴的合成效率提高了38.4%，具有大规模工业应用的广泛前景。

技术研发人员：杨小蓉,刘恒瑞
受保护的技术使用者：华南理工大学
技术研发日：
技术公布日：2025/4/21