专利名称:高效表达人血清白蛋白酵母菌株的构建及发酵纯化工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及高效表达重组人血清白蛋白的酵母菌株的构建和发酵纯化工艺的建立，可用于重组人血清白蛋白的大规模生产。利用这一技术生产的人血清白蛋白可作为试剂、添加剂、稳定剂等应用于科研或/和临床医疗目的。
背景技术：
人血清白蛋白(HSA)，简称白蛋白，或清蛋白，是一种可溶性单体蛋白质，占构成血液中蛋白总量的一半。血清白蛋白作为一种基本载体，携带传递脂肪酸、类固醇和激素分子等，其稳定的惰性特性是维持血压的一个重要因素。血清白蛋白是一种球状非糖基化的、分子量为65千道尔顿的血清蛋白质。人血清白蛋白基因位于4号染色体上，有16961个碱基对，分为15个间隔区。经RNA加工拼接后形成的mRNA可编码一个具有609个氨基酸的前体蛋白质。这一蛋白(白蛋白前体)再通过高尔基体的转化加工，去除引导多肽，而分泌到细胞外。含有585个氨基酸的血清白蛋白有35个半胱氨酸，在血液中，血清白蛋白是一个有17个二硫键的单体(参见Brown JR，“白蛋白的结构、功能和应用”Pergamon，纽约，1977)。当没有分泌多肽时，在酵母细胞内的白蛋白产物是错配状态，将失去90％的抗原性(与血浆中自然状态白蛋白相比)，并且形成不溶性的白蛋白聚合体。现在用于临床的白蛋白均是从人血浆中提取的。利用微生物特别是酵母菌重组表达白蛋白(rHSA)的生产已在专利EP330451、EP361991、US5962649、US5440018以及US5369020中公开。
血清白蛋白具有多种多态体及30种不同的遗传杂分子(Weikamp，CR等，人类遗传年报，37219-226，1973)。血清白蛋白分子的三维结构已经由X-光衍射法测定(Carter，科学，244，1195-1198，1989)。白蛋白是血液中的主要成分，在人体内含量为每升血液含40克，半衰期寿命为14-20天。血清白蛋白因为在稳定和长的半衰期，具有极大的优势使之可抵御生物体内酶的作用，并可使治疗性蛋白质以较高剂量使用。例如，Yu和Fu公开了长效重组蛋白药物研发技术平台的发明(美国专利公开号20040063635；中国专利公开号CN1467224A)。
有多种表达系统可用于外源重组蛋白的表达和生产。在各种表达体系中，属于真核系统的酵母菌包括酿酒酵母、汉森酵母和毕氏酵母已成功地用于重组蛋白的表达。与细菌和脊椎动物的表达系统相比酵母菌优点是表达水平高，对于糖基化修饰要求不高的重组蛋白，酵母系统可以直接给出可溶性，分泌到细胞体外的表达方式。这样方式表达的重组蛋白特点是维持了重组蛋白正确空间结构和具有生物学活性，其纯化方法就相对简单的多，整个系统适合进行工业化大规模生产。多种重组蛋白也可使用胞内表达方式，并获得了较高的表达水平。利用酵母菌表达重组蛋白的优势为，酵母菌系统允许产生高质量成熟的外源重组蛋白，并分泌到培养液中便于纯化。Watanabe等(Pharm Res.Dec18(12)1775，2001)描述了一种省时的纯化方法获得的由毕氏酵母表达的人血清白蛋白在生物体内外的特性。Kobayashi等(Ther Apher，Nov2(4)257-62.1998)讨论了重组人血清白蛋白的研究进展。
发明内容
本发明使用从人的肝细胞基因文库中分离出了人血清白蛋白基因，经DNA测序表明其含有位点在1494C位和第1509A位点的两个单核苷酸多肽性(Single NucleotidePolymorphoresis)。利用这个基因所构建的重组毕氏酵母菌株，意外获得了人血清白蛋白的高效表达。使用这一人血清白蛋白基因DNA序列与其它治疗性蛋白质基因，如人GCSF，或各种干扰素形成的融合基因，在酵母菌中也得到了高效表达。研制具有长效性的，人血清白蛋白基因融合的重组蛋白药物时，优选的是使用Seq No 1的人血清白蛋白基因的DNA序列。这一DNA序列已提交位于美国马里兰州的美国国家健康总署下设的GenBank核苷酸序列资料库，DNA序列编号(GenBank Accession Number)为AY728024。将在提交本发明申请之后公开(设定
公开日2004年9月1日)，这两个核苷酸的区别可用作为表达菌株的鉴定标志。
在本发明中提到的重组人血清白蛋白的表达，优选的使用基因工程技术构建来表达。获得重组蛋白的优选方法是利用载体质粒，通过转化和转染或感染的方式来表达重组蛋白。特别是利用可转化酵母的表达载体，来转化毕氏酵母，并使重组人血清白蛋白分泌到培养液中，优选的采用了专有的发酵工艺和纯化程序，而构建了具有高效表达重组人血清白蛋白的技术平台。在构建中，对分离鉴定的人血清白蛋白基因进行DNA序列分析发现，其中有两个碱基与已发表的人血清白蛋白DNA序列不同，并且在通过酵母菌作异源蛋白质表达时，意外获得了高效、高产表达，极具生产价值的人血清白蛋白菌株。
酵母菌遗传工程的进展使外源基因可以在酵母菌中得到表达并分泌蛋白产品到细胞外。利用酵母菌表达分泌型蛋白的优点为，但不局限于，高表达产量、重组蛋白质为可溶性，正确的折叠和易于大规模生产和纯化。
在毕氏酵母系统中，AOX1基因启动子是十分强劲的启动子。特别是在毕氏酵母菌中，在毕氏酵母里共编码两种乙醇氧化酶，AOX1和AOX2。AOX1是负责在细胞中产生合成巨量的乙醇氧化酶(AOX1)活性。AOX1基因的表达是受到紧密控制并由甲醇诱导而达到极高的水平。典型地当用甲醇做为唯一碳源时，在所有的可溶性蛋白中AOX1基因的产物就达30％。AOX1基因已分离得到。AOX1基因启动子也用于本发明中载体质粒中用以驱动编码有目的基因的外源蛋白的表达(Ellis等，1985；Koutz等，1989，Tschopp等，1987a)。而AOX2和AOX1基因有97％的同源性。在甲醇中的生长速度比AOX1基因为慢。这种缓慢生长状态，可以分离到Mut+(AOX1)株。除了AOX1基因启动子外，在酵母菌中其它启动子也可用于驱动HSA，HSA融合蛋白或重组蛋白。这些启动子包括，但不局限于GAPDH(GAP)、PGK1、Gal1、Cal10、Cyc1、PH05、TRP1、ADH1或ADH2基因启动子。
GAPDH基因(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase Gene)启动子(GAP)是另外一个可用于外源基因在酵母菌中进行高效、持续表达的启动子(Waterham，HR etal.，基因.18637-44，1997)。当使用AOX1基因启动子表达外源蛋白时，甲醇作为唯一碳源大量使用，带来一些生产上的不安全因素。从石油中分离而来的甲醇易燃、易爆，对人体又有较强烈的毒性作用，不适于用做食品或食品添加剂的生产和制造中。甲醇的潜在危险使得GAP启动子成为另一个适于大规模重组蛋白药物生产的启动子。本发明在实施案例中，主要以此启动子为核心来构建重组蛋白高效表达公共技术平台，以实现技术平台的通用性和高效性。优选的启动子是AOX1基因启动子，优选的启动子是GAPDH基因启动子。
外源重组蛋白质可以直接在酵母菌中表达也可以通过分泌肽将其表达并可以分泌到酵母菌体外成为可溶性蛋白质。分泌肽可以是人血清白蛋白的分泌肽，也可以是酿酒酵母菌的α-因子或重组蛋白质自身的分泌多肽。
本发明中的人血清白蛋白基因可以在多种表达体系中得到表达，重组工程细胞可以持续地或在有或无诱导剂的存在状态下表达HAS。重组工程细胞形式包括，但不局限于脊椎动物，(即人，猴、鼠、兔等)鱼、鸡、昆虫、植物、酵母、真菌和细菌等细胞。
优选的用于表达HSA的酵母属宿主包括，但不局限于，酿酒酵母属(Saccharomyces)，毕氏酵母属(Phichia)，克鲁维酵母属(Kluyveromyces)，念珠菌属(Candida)，孢园酵母属(Tarulaspora)和裂殖酵母属等。更优选地，宿主系统可为毕氏酵母属巴斯德菌种。
酵母表达的白蛋白是可溶性的并且显示出与血浆中分离的白蛋白有相同的二硫健结构。当作为药物使用时，白蛋白的用量为克级，因而重组白蛋白须与天然的白蛋白结构一致。由酵母分泌到培养液中的HSA/IFN是通过与白蛋白表达一致的途径来加工的，并避免了由酵母细胞抽提物中分离纯化蛋白的难题，因为酵母细胞是难于裂解的。另外，分泌出的蛋白质纯度也易于提高，因为由酵母分泌出的蛋白仅占全部酵母蛋白的0.5-1％，而且酵母无毒性蛋白伴随。
优选实例为，应用巴斯德酵母菌系统来表达本发明中提及的HSA。巴斯德酵母菌是由SALK生物技术工业研究所与菲力蒲石油工业研究所协作发展出的一个高效重组蛋白表达系统。有关毕氏酵母菌的应用技术已在有关美国专利中详细阐述了(4,683,293；4,808,537；4,857,467)。
毕氏酵母菌与酿酒酵母菌相比，毕氏酵母菌在对分泌的蛋白质进行糖基化的程度上有着更大的优点。即毕氏酵母不会有过度糖基化现象。酿酒酵母和毕氏酵母均有N-联接糖基甘露糖修饰。然而寡糖化物链加在表达的重组蛋白上，在毕氏酵母菌中只有8-14个甘露糖基，而远短于在酿酒酵母中的50-150甘露糖链。在毕氏酵母菌中N-联接糖基化较少发生。酿酒酵母的核心糖化带有α-1，3联接末端物。而在毕氏酵母菌则没有。研究表明由酿酒酵母产生的糖基化蛋白具有较强的抗原反应，而使得这些蛋白不适于用在特别是治疗目的上的使用。当然也表明这又减少了一个对毕氏酵母菌用来表达蛋白在糖基化问题上的担忧。
多种酵母转移载体质粒可以应用于构建重组人血清白蛋白表达菌株，例如，Invitrogen公司的使用AOX启动子、可使表达组件插入到酵母菌染色体中的HIS基因位点载体转移质粒pPIC3.5K和pAO815，选择压力是重组酵母菌可在无组氨酸的存在下生长；使用Zeocin抗生素作为选择压力，则可用AOX或GAPDH启动子的pPICZ或pGAPZ转移载体质粒。含有人血清白蛋白的转移载体质粒，优选的是含有AOX启动子的pAO815-HSA和pPIC3.5K-HSA以及含有GAPDH启动子的pYHA和pYHKA转移载体质粒。。
本发明还给出了酵母菌高效表达重组蛋白时，在生物反应器中使用的发酵工艺基本条件，以完成大规模高密度发酵工作。其主要条件是利用无机盐和葡萄糖或甘油(甲醇作为诱导剂)培养。表达产物发酵时的适于温度可控制在20-30℃，优选的是30℃，更优选地是20℃。
经大规模高密度发酵后，可采用通用的重组蛋白分离纯化程序，20-100毫摩尔半胱氨酸流注加入含重组蛋白的上清液中，优选的是40毫摩尔。上清液加热到42-75℃，优选的是加热到68℃。
上清液中所含有的人血清白蛋白可通过进一步的分离纯化方法获得具有一定纯度的人血清白蛋白。多种分离纯化层析体系可以应用，例如，Pharmacia公司的“Streamline”蛋白反向纯化柱。洗脱液经过另外两个不同的离子交换分离柱后，重组蛋白的纯度可达95％以上。重组蛋白的纯度可满足动物试验及临床试验对蛋白质纯度的要求。
本发明所制备的人血清白蛋白可适于用在试剂、药物添加剂和临床治疗应用。
在此还需提及的是，本发明中所提到HAS DNA序列，可以作为技术平台用于与HSA发生融合形成的重组蛋白的表达。包括，但不局限于，HSA，治疗性蛋白质基因与HSA基因融合后所表达的重组蛋白质(YU and FU，美国专利公开US20040063635)，如HSA/GCSF、HSA/TPO、HSA/EPO、HSA/GM-CSF、HSA/IL、HSA/SCF以及或具长效性的干扰素类似物(FU and YU，美国专利申请US60/483,984；中国专利2004100428148)等。
描述图1.实际用于构建人血清白蛋白的毕氏酵母转导载体质粒。A)，使用AOX启动子的载体质粒；B)，使用GAPDH启动子的载体质粒。
图2.发酵工艺流程具体实施例实施例1 分子克隆技术简述常规分子克隆技术包括DNA、RNA的提取，琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶电泳，DNA片段的联接，限制性内切酶酶切反应均参照文献(Maniatis，et al.，“分子克隆实验手册”冷泉港实验室出版，冷泉港，纽约，1982)。质粒DNA的纯化，DNA片段的回收等均采用商品纯化柱制备。DNA聚合酶链反应(PCR)(参照文献Saikietal.，科学，2301350，1985)所用的酶及反应所需PCR仪均为Perkin Elmer产品。并参照厂家操作程序。DNA测序和DNA扩增所需用的寡聚核苷酸引物由专门机构完成。转受态E.coli细菌由GIBCO/BRL公司购得。本发明所使用的酵母菌菌种均购自Invitrogen公司。转化酵母菌是由电脉冲方式进行，并参照厂家(Bio-Rad)操作程序。
实施例2 人血清白蛋白(HSA)基因克隆以人体肝中提取的总RNA为模板，利用反转录多聚酶链聚合反应来合成、扩增HSA基因。5微克总RNA在反转录酶(购自GIBCO/BRL公司)的作用下，合成相对应的DNA链，寡聚核苷酸引物为18个T+1N(N为随机核苷酸)。反应条件为45℃20分钟，而后升温至55℃，继续保温40分钟。用于扩增HSA的寡聚核苷酸引物是按GenBank中V00494的DNA序列所设计。
其寡聚核苷酸引物序列为Seq.ID NO.35’-GAATTCATGAAGTGGGTAACCTTTATTTCC-3’，和Seq.ID NO.45’-GAATTCTTATAAGCCTAAGGCAGCTTGACTTGC-3’两个EcoR I识别位点分别加在HSA基因的两端以用于DNA片段插入适当的载体。PCR反应条件为94℃4分钟以灭活反转录酶并变性DNA。然后进入如下35个循环反应94C30秒，58℃30秒，72℃扩增2分30秒。循环反应结束时，再给予72℃10分钟的延长反应。凝胶电泳显示PCR扩增产物长约1850碱基对。PCR产物利用TA克隆的方法插入PCRII载体(Invitrogen公司)。所得质粒命名为pGR-HSA。DNA测序结果表明其与发表的人血清白蛋白DNA序列相似，但含有二个单核苷酸多肽性，位於基因DNA序列的第1494C位和第1509A位。序列表中Seq ID NO.1为人血清白蛋白基因DNA序列。下划线显示单核苷酸多肽性(SNP)位点。Seq ID NO.2为人血清白蛋白的蛋白质氨基酸序列。
实施例3 表达载体质粒pYHA，pYHKA的构建含有GAPDH基因启动子的pGAPZ-A载体来自Invitrogen公司。使用Bgl II和EcoR I限制性内切酶酶切后，0.5Kb的含有GAPDH启动子的DNA片断经过琼脂糖电泳分离回收后。与含有AOX I基因启动子的pAO815和pPIC 3.5K(Invitrogen公司)质粒经过启动子替换而形成两个含有GAPDH基因启动子的pYHA和pYHKA新的载体质粒。它们均含有GAPDH基因启动子(GAP)和组氨酸脱氢酶基因(H)。pYHA载体仅含有在质粒复制时所必需的抗生素基因Amp。pYHKA载体则含有一个卡那霉素基因，其可以在有G418抗生素的存在下，用于压力选择而获得具有多拷贝表达组件插入的重组酵母菌。表达载体质粒pYHA和pYHKA与其它来自Invitrogen公司的酵母菌表达质粒一起用于本发明的实施例中的重组蛋白表达系统。
实施例4 人血清白蛋白基因的表达质粒的构建以人血清白蛋白基因在毕氏酵母菌中的表达为例。使用EcoR I酶酶切质粒pCR-HSA，然后经电泳分离纯化HSA的DNA片段，再分别克隆到如pYHKA酵母菌转移载体质粒以及Invitrogen公司的其它酵母菌转移载体质粒的EcoRI位点，如pGAP-A，pPIC3.5K，pPICZ-A等。经转染DH5α感受态细菌，在含有相对应的抗生素的LB-琼脂平板上选择出细菌克隆，其经检定有HSA基因插入的质粒，则基因插入方向经酶切来决定。例如使GAPDH启动子的pYHKA-HSA载体质粒和使用AOX启动子的pPIC3.5K-HAS载体质粒的物理图谱列于附图1。
实施例5 酵母菌的转化将毕氏酵母菌菌株X33或GS115菌落接种于含5ml YPD培养液的50ml培养基中，以250转/分的速度于30C下培养过夜。次日取0.2ml过夜培养物再转接入500ml YPD的培养液中，置于2升的三角培养瓶中。在30℃下旋转培养2-3小时，使细胞密度达到OD600＝1.3-1.5。酵母菌经离心方法收集，再重悬于500ml冰预冷的无菌水中洗涤两次。然后酵母菌悬于20ml冰预冷的1M Sortbitol溶液洗涤一次。
实例4中构建的质粒pYHA-HSA，pYHKA-HSA均经限制性内切酶SalI(HIS)，BspEI(HIS)，Pme I(AOX1)，或(GAPDH)处理后，形成线性质粒分子。重组表达组件插入酵母染色体位点在括号内表述。取5ug线性质粒DNA与80ul处理后的酵母菌相混合并置于0.2厘米厚的电极杯内，置于点脉冲仪上。电脉冲条件为电压7500V/CM，电极间隔时间为5-10(ms)。电击处理后，立即加入1ml冰预冷的1MSorbitol溶液于酵母菌中，然后转入15ml试管中。转化的酵母菌置于30℃培养箱中放置2小时，然后接种涂布在不含组氨酸，或含有Zeocin抗生素，或含有G418抗生素的MD平板培养基上。经抗性选择而生长出的克隆，再用分子生物学方法鉴定其基因的插入。蛋白质的表达与分泌则以SDS-PAGE或用特异抗体做蛋白质免疫印迹检测。不同的毕氏酵母菌菌株，如X-33，KM71、GS115以及蛋白酶缺陷型酵母菌株，如SMD1168和P101均可用来表达和分泌重组蛋白。表达并分泌重组蛋白的酵母菌可以被再次电击处理，使得重组蛋白表达组件可以插入在同一酵母菌染色体不同的位点。例如，第一次表达组件插入在HIS基因位点处，使用的是GAPDH启动子，第二次，可以使用pGAPZ载体，重组表达组件插入在酵母菌染色体的GAPDH启动子位点处，使用Zeocin抗生素作为选择重组酵母菌的标志。
实施例6 特异抗体的蛋白质免疫印迹检测典型的蛋白质免疫印迹实验是将变性(SDS)凝胶电泳分离的蛋白质，经电泳仪将蛋白质转移到尼龙或醋酸纤维膜上，再以特异抗体(第一抗体)识别相对应的蛋白质。然后带有荧光功能基因的第二抗体，识别并结合于第一抗体，经荧光显色整个特异性结合的复合物，即特异蛋白质在X光片上留下印记。标准蛋白分子量用于决定未知蛋白的分子量。第一抗体是使用sigma公司出品的人血清白蛋白特异抗体。
实施例7 应用发酵工艺大规模表达和纯化重组蛋白质实验中表明应用毕氏酵母表达和规模化生产重组融合蛋白比起其它任何系统都要容易的多。重组株分离到后，重组蛋白表达株可有Mut+和Muts两种形式。从小规模培养开始(10ml)，使用AOX1启动子的重组酵母菌，则在甘油消耗后，添加甲醇诱导；使用GAPDH启动子则，使用葡萄糖为碳源，在不同培养时间段取样测试蛋白质的表达。发酵中维持pH、氮、氧、温度的最佳条件，培养体积可在数升—数千升之间，生产过程的培养时间可在72-600小时之间，以获得最佳质量和最大的表达量。对于分泌型蛋白在培养液中的含量均用SDS-PAGE或HPLC方法进行分析，对表达产物的生物活性，表达水平和纯度在每一步中均进行监测。结果表明两株使用不同的启动子的重组酵母菌在摇瓶中人血清白蛋白的表达，均可达到1-2克/升的蛋白表达水平。附图2展示了发酵工艺的流程图。人血清白蛋白的表达水平也与发酵体积、发酵时间、发酵温度等因素相关。例如在15升或150升发酵罐中，血清白蛋白的产量可达6-12克/升以上。在2吨发酵罐中所进行的发酵试验表明，使用AOX1启动子的重组人血清白蛋白酵母菌株(X33)，发酵液中重组人血清白蛋白表达可达20克/升水平(华北某制药集团独立测试结果)。
在发酵终止时加入乙酰色氨酸、半胱氨酸溶液至40毫摩尔于含重组蛋白的上清液中。上清液加热到68℃，保温30分钟。上清液过滤后，通过Pharmacia公司的“Streamline”反向蛋白纯化柱。洗脱液经过疏水柱、不同的离子交换柱层析及化学沉淀处理后，重组人血清白蛋白的纯度达95％以上。
序列列表(SEQUENCE LISTING)<110>Fu，YanYu，Zailin<120>高效表达人血清白蛋白酵母菌株的构建及发酵纯化工艺<130>zyu-04<160>l<170>PatentIn version 3.2<210>1<211>1830<212>DNA<213>Homosapiens<400>1atgaagtggg taacctttat ttcccttctt tttctcttta gctcggctta ttccaggggt 60gtgtttcgtc gagatgcaca caagagtgag gttgctcatc ggtttaaaga tttgggagaa 120gaaaatttca aagccttggt gttgattgcc tttgctcagt atcttcagca gtgtccattt 180gaagatcatg taaaattagt gaatgaagta actgaatttg caaaaacatg tgttgctgat 240gagtcagctg aaaattgtga caaatcactt catacccttt ttggagacaa attatgcaca 300gttgcaactc ttcgtgaaac ctatggtgaa atggctgact gctgtgcaaa acaagaacct 360gagagaaatg aatgcttctt gcaacacaaa gatgacaacc caaacctccc ccgattggtg 420agaccagagg ttgatgtgat gtgcactgct tttcatgaca atgaagagac atttttgaaa 480aaatacttat atgaaattgc cagaagacat ccttactttt atgccccgga actccttttc 540tttgctaaaa ggtataaagc tgcttttaca gaatgttgcc aagctgctga taaagctgcc 600tgcctgttgc caaagctcga tgaacttcgg gatgaaggga aggcttcgtc tgccaaacag 660agactcaagt gtgccagtct ccaaaaattt ggagaaagag ctttcaaagc atgggcagta 720gctcgcctga gccagagatt tcccaaagct gagtttgcag aagtttccaa gttagtgaca 780gatcttacca aagtccacac ggaatgctgc catggagatc tgcttgaatg tgctgatgac 840agggcggacc ttgccaagta tatctgtgaa aatcaagatt cgatctccag taaactgaag 900gaatgctgtg aaaaacctct gttggaaaaa tcccactgca ttgccgaagt ggaaaatgat 960gagatgcctg ctgacttgcc ttcattagct gctgattttg ttgaaagtaa ggatgtttgc 1020aaaaactatg ctgaggcaaa ggatgtcttc ctgggcatgt ttttgtatga atatgcaaga 1080aggcatcctg attactctgt cgtgctgctg ctgagacttg ccaagacata tgaaaccact 1140ctagagaagt gctgtgccgc tgcagatcct catgaatgct atgccaaagt gttcgatgaa 1200tttaaacctc ttgtggaaga gcctcagaat ttaatcaaac aaaattgtga gctttttgag 1260cagcttggag agtacaaatt ccagaatgcg ctattagttc gttaeaccaa gaaagtaccc 1320caagtgtcaa ctccaactct tgtagaggtc tcaagaaacc taggaaaagt gggcagcaaa 1380tgttgtaaac atcctgaagc aaaaagaatg ccctgtgcag aagactatct atccgtggtc 1440ctgaaccagt tatgtgtgtt gcatgagaaa acgccagtaa gtgacagagt caccaaatgc 1500tgcacagaat ccttggtgaa caggcgacca tgcttttcag ctctggaagt cgatgaaaca 1560tacgttccca aagagtttaa tgctgaaaca ttcaccttcc atgcagatat atgcacactt 1620
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权利要求
1.由多核苷酸序列SEQ ID NO.1所编码的人血清白蛋白基因，其氨基酸多肽序列为SEQ ID NO.2。
2.如权利要求
1所述人血清白蛋白基因序列，其在GenBank的检索编号为AY728024；其含有两个核苷酸多肽性(SNP)的位点，分别位于该基因核苷酸序列的第1494C和1509A位。
3.携带有如权利要求
1所述的人血清白蛋白基因序列的载体质粒。
4.含有如权利要求
3所述的载体的宿主系统，其经权利要求
3所述的载体转化、转染或转导得到，并用于表达人血清白蛋白。
5.如权利要求
4所述的宿主系统，其包括脊椎动物、昆虫、植物的细胞、酵母菌、细菌或病毒；其中所述的酵母菌是酿酒酵母、毕氏酵母、念珠菌属酵母、汉逊酵母、克鲁维亚酵母、孢圆母属酵母或裂殖酵母，优选的是毕氏酵母。
6.表达权利要求
1所述人血清白蛋白基因的毕氏酵母菌，通过发酵纯化工艺来进行规模化表达和生产。
7.如权利要求
1所述的人血清白蛋白基因，在酵母菌中表达后，获得的蛋白质是分泌型的。
8.如权利要求
7所述的蛋白质，该蛋白质可与特异性识别抗人血清白蛋白的抗体相结合。
9.权利要求
1所述的人血清白蛋白基因的多核苷酸序列用于形成融合蛋白。
10.可高效表达权利要求
1中所描述的人血清白蛋白基因的毕氏酵母菌，经大规模发酵工艺生产和纯化程序获得的人血清白蛋白可作为试剂、添加剂、稳定剂或在临床上使用。
专利摘要
本发明公开了两株分别含有不同启动子、可以高效表达人血清白蛋白的毕氏酵母菌的构建及其发酵纯化工艺。利用本发明中所首次分离鉴定的含有两个单核苷酸多肽性(SNP)的人血清白蛋白基因(GenBank检索编号AY728024)所构建的酵母菌株，意外地发现人血清白蛋白表达产量可达20g/L左右。菌株及其发酵纯化程序可用于大规模生产重组人血清白蛋白。这一特定的人血清白蛋白基因将可用在以治疗性蛋白质与人血清白蛋白融合而形成的长效重组蛋白质药物生产技术平台中，以获得长效蛋白质药物的高效表达。
文档编号C12N7/01GKCN1618967SQ200410057313
公开日2005年5月25日 申请日期2004年8月27日
发明者于在林, 富岩 申请人:富岩, 于在林导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan