专利名称:取代的氧代丁烷的立体有择还原的制作方法
相关申请的交叉引用本申请要求美国临时申请系列号60/277,531(2001年3月21日申请)和60/225,695(2000年8月16日申请)的利益。
发明领域本发明涉及一种新的方法，即以立体有择还原相应的氧代化合物来制备(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷。本发明所述方法产生的取代的丁烷是羟乙胺电子等排物亚单位的前体，此亚单位存在于许多具有治疗效果的血管紧张肽转化酶、肾素和HIV蛋白酶的抑制剂分子中。
发明背景Bing-nan Zhou等J.Am Chem.Soc.，105，5926-5928页，1983描述了化学微生物法合成L-肉碱，L-肉碱在人类新陈代谢和转运长链脂肪酸中扮演重要角色。尤其此文描述了用面包酵母即啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)还原K-氯代乙酰乙酸乙酯为(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯.
Kazutoshi Ushio等Tetrahedron Letters，27卷，23期，2657-2660页，1986，公开了用甲醇生长酵母还原β-酮酸酯的方法。此文描述了该反应导致产物中过多的对映异构体急剧转化为D-异构体。当反应过程中使用在甲醇中生长的酵母时这种现象会产生，原因在于此类培养基中生长的酵母所具有的特征性酶。
Markus Christen等J.Chem.Soc.，Chem.Commun.264-266页，1988，公开了甲基-6-(对氯苯基硫代)-3，4-二氢己酸酯的四种立体异构体的合成，其中手性的关键引入在于使用适当的酵母还原。文中称尽管对用酵母还原β-酮酸酯已有广泛研究，仍然难以预测产物的绝对构型，或者特别是可能形成的对映异构体过量。
Antonio Trincone等Biotechnology and Bioengineering，35卷，559-564页，1990描述了用硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobussolfataricus)的静止细胞对酮的不对称还原。文中声称这种有机体的静止细胞的还原能力强烈依赖于细胞的生长阶段。
Ramesh Patel等Enzyme Microb.Technol.，13卷，906-912页，1991描述了4，5-二氢-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基-1H-1)-苯并氮杂环庚三烯(benzazepin)-2-酮的立体有择微生物还原。特别公开了关键性的中间物(3R-顺式)-1，3，4，5-四氢-3-羟基-4-(4-甲氧基苯基)-6-(三氟甲基)-2H-1-苯并氮杂环庚三烯-2-酮产生于母体酮的立体有择微生物还原。文中宣称通过选择特定的条件有可能从四种已知的可能产物中获得单一的异构体。
Ramesh Patel等，Enzyme Microb.Technol.，15卷，1014-1021页，1993，描述了二酮化合物，3，5-二氧代-6-(苄氧基)己酸甲酯的立体有择还原，形成得到的双羟基化合物的单一对映异构体。
Ramesh Patel等，Enzyme Microb.Technol.，14卷，731-738页，1992，描述了一种方法，即热处理白地霉(Geotrichumcandidum)从而提高还原β-酮酸酯获得的羟基产物的光学纯度。
Kometani等，Journal of Fermentation andBioengineering，80卷，第2期，208-210页，1995，教授了利用乙醇为能源的酵母介导的生物还原。检测了面包酵母中乙醇消耗率与前手性酮的还原率之间的关系，得到结论为乙醇可适用于从前手性酮来大规模生产手性醇。
Ramesh Patel等，美国专利第5,391,495号，公布于1995年2月21日，公开了使用可催化还原反应的微生物或酶，立体有择还原某些含酮基的磺酰胺化合物为相应的含羟基的化合物。这类酶为氧化还原酶或脱氢酶，此类微生物优选选自汉逊氏酵母属、红球菌属和诺卡氏菌属(Norcardia)物种。
发明概述本发明涉及一种新的立体有择方法，即使用红球菌属和短杆菌属的某些种将相应的含酮基的化合物还原来制备(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷。获得的产物有高的产量和极好的非对映异构体纯度。
发明详述本发明的方法提供了一种有利的合成法以制备(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷，分子式为 I其中Hal是卤素，优选为氯，R选自烷基、取代烷基、芳基和取代芳基，并且R1是氨基官能团的保护基团。
分子式I表示的取代丁烷是合成ACE、肾素和HIV蛋白酶的抑制剂分子的有效的中间物。这类分子的抗HIV蛋白酶活性使得它们在逆转录病毒的感染疾病例如AIDS的治疗上非常有价值。这些化合物以及它们的运用被公开于，例如，美国专利第5,849,911号中，公开内容在此并入参考文献。美国专利第5,849,911号公开的一种特别重要的AIDS化合物是[3S-(3R*，8R*，9R*，12R*)]-3，12-双(1，1-二甲基乙基)-8-羟基-4，11-二氧代-9-(苯基甲基)-6{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-2，3，6，10，13-pentaazaretetradecanedioic acid二甲酯。这个化合物可以直接由分子式I表示的(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷合成。用本发明方法能制造出很高产率的分子式I代表的取代丁烷的反式(1S，2S)对映异构体这一事实对于上述治疗性化合物合成的最终效率是非常重要的。
运用于此处，下列的名词给出以下定义。名词“烷基”指任意取代的直链或支链饱和烃类基团，有1-7个碳原子，优选有1-4个碳原子。表达方式“低级烷基”指有1-4个碳原子的任意取代的烷基。
名词“取代烷基”指被例如1-4个取代基取代的烷基基团，这些取代基如有卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧、氧代、烷酰基、芳基、芳氧基、芳烷基、烷酰氧基、氨基、烷基氨基、芳氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、杂环氨基和双取代氨基。在此给出的烷基和取代烷基的定义同样也适用于烷氧基基团的烷基部分。
名词“芳基”指单环或双环的芳香烃基团，在环的部分有6-12个碳原子，例如苯基、萘基、联苯和二苯基基团，每个都可以被取代。
名词“芳烷基”指通过烷基基团连接在更大实体上的芳基基团，例如苄基基团。
名词“取代芳基”指被例如1-4个取代基取代的芳基基团，此类取代基如烷基、取代烷基、卤素、三氟甲基、三氟甲氧基、羟基、烷氧基、环烷氧基、杂环氧、烷酰基、烷酰氧基、氨基、烷基氨基、二烷基氨基、芳烷基氨基、环烷基氨基、杂环氨基、烷酰基氨基、硫羟、烷硫基、环烷硫基、杂环硫、脲基、硝基、氰基、羧基、羧基烷基、氨基甲酰、烷氧基羰基、烷基硫羰、芳基硫羰、烷基磺酰基、亚磺酰氨基、芳氧基等等此类。取代基还可被其它一个或多个成员取代，这些成员来自卤素、羟基、烷基、烷氧基、芳基、取代烷基、取代芳基和芳烷基。
名词“卤素”或“Hal”指氯、溴、氟和碘，其中氯为优选。
名词“氨基官能团保护基团”指本领域内熟知的基团，并且其可以连接在氨基基团上，使氨基基团不参与某一反应，而该反应在保护基团所连分子的其它部位发生。这类基团中优选的是叔丁氧基羰基(BOC)，但是本领域熟知的氨基官能团保护基团，通常为烷氧基羰基基团例如苄氧基羰基也同样可以使用。
本方法中制备分子式I表示的(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷的起始物质是相应的含酮基化合物，表示为分子式 II其中Hal，R和R1前面已有定义。分子式II表示的化合物的制备技术，文献中已有描述且为本领域普通技术人员所熟知。合成分子式II表示的化合物的优选方法已公开于共同未决的专利申请DocketGY55，其公开内容在此引入作为参考。在此方法中，一个分子式为 的芳基酯(其中R和R1同前面所定义，R2是氢或硝基，可取代于苯环的邻位或对位)与硫叶立德反应，也就是一种具分子式为 的官能团的化合物，产生反应中间物酮叶立德(keto ylide)化合物，分子式为 其中R和R1同上定义，R3和R4选自烷基、取代烷基和芳基。上面的分子式表示的酮叶立德化合物然后与氯化物源以及有机酸如甲磺酸反应转变为分子式II所表示的含酮基化合物，此氯化物源优选碱性氯化物源，最优选为氯化锂，。
分子式I所示(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷是合成ACE、肾素和HIV蛋白酶的抑制剂分子的很重要的中间物。这类分子的抗HIV蛋白酶活性使得它们在逆转录病毒的感染疾病例如AIDS的治疗上非常有价值。特别是分子式I所示(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷与合适的碱反应会转换为相应的环氧衍生物，如下面分子式所示
此分子式所示环氧化合物是一种中间物，可转化为重要的AIDS化合物[3S-(3R*，8R*，9R*，12R*)]-3，12-双(1，1-二甲基乙基)-8-羟基-4，11-二氧代-9-(苯基甲基)-6{[4-(2-吡啶基)苯基]甲基}-2，3，6，10，13-pentaazaretetradecanedioic acid二甲酯，美国专利第5,849,911号公开，在此引入作为参考。
要立体有择还原分子式II所示的(1S)-1-卤代-2-氧代-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷，形成分子式I所示(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷，依照本发明需和氧化还原酶，或者优选的为微生物进行反应，此微生物可以提供能够催化分子式II所示的酮的酶促还原反应的氧化还原酶。微生物的细胞可以是完整的湿细胞或者如冻干、喷雾干燥或热干的干的细胞形式，或者是处理过的细胞物质，例如破碎的细胞或细胞抽提物。尽管有大量的微生物都可以提供某种类型的氧化还原酶，但是本发明发现仅有所选定的几种红球菌属和短杆菌属物种可以催化分子式II的化合物的还原反应形成需要的高产量和高对映异构体产率的(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷。这些物种是红串红球菌(Rhodococcuserythropolis)ATCC 4277、红串红球菌DSM 6971和红球菌属物种ATCC 21227、红串红球菌ATCC 27854和短杆菌属物种ATCC 19653。此处术语“ATCC”用来表示特定有机体的储藏处的目录号，也就是美国典型培养物保藏中心，12301 Parklawn Drive，Rockville，Maryland 20825。术语“DSM”指德意志微生物保藏中心，Branschweig，Germany。
本发明中的酶促还原反应可以在所用微生物发酵后进行，也就是两段式发酵与还原反应，或者也可以同时进行，即一段式或原位发酵与还原反应。在后者中，微生物可以生长在适当的介质中，尤其要有氮和碳源，直到达到足够的生长，再加入选自分子式II所示化合物的化合物。酶促还原反应会持续直到反应中分子式II所示化合物几乎完全转化。
在两段式方法中，微生物最初在上述适当的介质中生长直到达到预期的酶活性浓度，此时用传统的分离技术收获细胞，并制备包括适当的缓冲试剂等的微生物细胞悬液。适当的缓冲试剂包括磷酸缓冲液，尤其是磷酸钾缓冲液，tris-HCl，乙酸钠等等。水也可以用来配制微生物细胞悬液。接着加入分子式II所示化合物，酶促还原反应持续到转化基本完全。这两种情况下，适当的生长介质包括，如前所述，碳源和氮源和微量元素。诱导物也可加入。本领域中普通技术人员都很明白，术语“诱导物”指任何可以启动或增强所需酶即氧化还原酶在细胞内的活性来制造所需产物的化合物。分子式II所示的(1S)-1-卤代-2-氧代-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷可看作是一种诱导物，特别是当在微生物生长时加入少许。
介质中适当的碳源包括糖类，例如麦芽糖、乳糖、葡萄糖、果糖、甘油、山梨糖醇、蔗糖、淀粉、甘露糖醇、丙二醇等，有机酸及其盐类例如乙酸钠、柠檬酸钠等，氨基酸及其盐类例如谷氨酸钠等，和醇类如乙醇、丙醇等。适当的氮源包括N-Z胺A，玉米浆，大豆粉、牛肉抽提物、酵母抽提物、糖浆、面包酵母、胰蛋白胨、nutrisoy、蛋白胨、yeastamin、硝酸钠、硫酸铵等。合适的微量元素包括磷酸盐以及镁、锰、钙、钴、镍、铁、钠和钾的盐类。本发明中合适的培养基包括从任意几个类群中选择出的多组分。有代表性的优选培养基包括(并不限于)含有下列成分的培养基水溶液，以重量百分比计成分 重量百分比No.1 麦芽汁 1％PH7.0 酵母抽提物 1％蛋白胨 1％
葡萄糖 2％No.2 麦芽汁 1％PH7.0 酵母抽提物 1％蛋白胨 0.3％葡萄糖 4％No.3 麦芽汁 1％PH7.0 酵母抽提物 1％蛋白胨 0.3％葡萄糖 2％No.4 麦芽汁 1％PH7.0 酵母抽提物 1％蛋白胨 0.3％琥珀酸钠 2％上述培养基中给出的pH值是灭菌后的。灭菌前pH优选先调到大约6～8，最好是约6.5。然后培养基灭菌，例如，通过加热到大约121℃维持30分钟。灭菌后培养基pH值调到6.5～7.5，优选在约pH7.0。在微生物生长和还原过程中，pH维持在约4.0～9.0，优选在约pH6.0～8.0。适当的上述成分中的碱性或酸性盐可以方便地用来调节pH值。
反应混和物的温度是还原反应所得到的热能的度量，因此，要维持适合的温度以保证有足够的能量让反应完成。本发明方法中合适的温度范围在大约15℃～60℃，优选在大约25℃～40℃。在本发明的方法中无法知道压力值是否重要，为方便起见，通常维持在大气压力附近。
本发明方法优选在有氧条件下进行。反应混和物的搅拌和通气对反应有益，因为这影响到生物转化所获得的氧的量。例如，在前面所述的一段式或两段式方法的微生物生长时期，在摇动的烧瓶培养或发酵罐中，方法会更有利地进行。搅拌速度在约50～1000RPM为优选，50～500RPM最优选。通气量约在0.1～10空气体积每培养基体积每分钟(v/Vt.)为优选，约5体积空气每培养基体积每分钟为特别优选。
从加入分子式II所示化合物到培养基中开始测量，完全转化按照分子式II所给化合物需要例如约4～48小时，通常是约4～24小时。优选培养基为水溶液，尽管有机液体或可混或不可混的(也就是两相的)有机液/水混和物也同样可用。
本发明的立体有择酶促还原反应的进行可能需要加入辅助因子例如烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NADH)，尤其是当使用提纯的酶时。NADH，举例来说，此后可以再生和再利用。另外可以原位再生NADH的酶也可使用，例如甲酸脱氢酶或葡萄糖脱氢酶。适合的氢供体包括分子氢、甲酸盐(举例来说碱金属的甲酸盐或甲酸铵)、葡萄糖、次磷酸盐或viologen如甲基viologen存在时的电化学反应。使用例如乙醇或甲酸盐也可以再生NADH而不需要再加酶。
分子式II表示的化合物加入反应溶液中的量最好控制在占起始化合物和培养基的合计重量的重量百分比约0.2％～5％。经过上述时间，接种微生物相对于初始物质的量能足够提供分子式II所给化合物的酶促还原反应，通常为约5～30wt.％的细胞浓度。使用优化的上述反应参数及给定的微生物，反应产率会高于70％，甚至超过99％，出乎意料的是，所需的分子式I表示的化合物的非对映体纯度大于93％，甚至大于99％。本发明的还原方法所得产物，即分子式I所示化合物可以用任何适当的用来分离和/或提纯的方法回收，例如方法有抽提、蒸馏、结晶、柱层析等。
应当理解，在本发明的实施中，许多其它实施方案和修改对本领域普通技术人员来说是很明显的，并且这些方案和修改也可以很容易地由他们来作，同时又不超出如上所述的本发明的范围和精神。因此，所附的权利要求
的范围并不限于上述描述，而是包含了本发明中所有具有专利新颖性的特征，包括会被相关领域技术人员作为其等价物的所有特征和实施方案。通过参考下述实验，对本发明进行进一步描述。
实施例1立体有择酶促还原用完整细胞-一段式方法红串红球菌ATCC 4277细胞(1mL)接种到100mL前述培养基1中，在500mL烧瓶里温育于28℃，以200RPM在摇床上摇动22小时。以1M的磷酸钾缓冲液调节50细胞的培养液至pH7.0。细胞培养液中加入葡萄糖至浓度为25mg/mL，加入50mg的(1S)-[N-(1-苄基-2-氧代-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁酯(底物)。生物转化(还原)在摇床里在28℃，200RPM条件下进行。在预定时间反应混和液中加入两倍体积的以60∶40的比例混和的叔丁基甲基醚和甲苯混合物以使反应淬灭，分离出的有机相以0.2微米的滤器过滤收集。2mL有机相在氮气流中蒸发至干，残留物以1mL乙腈吸收、过滤并做HPLC分析(1S，2S)-[N-(1-苄基-2-羟基-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁酯(产物)。结果概述于表1。
表1
实施例2用完整细胞-二段式方法此实施例中反应的底物与产物同实施例1。红串红球菌ATCC4277和红串红球菌DSM 6971的细胞(1mL)分别接种于100mL前述培养基1中，在500mL烧瓶里温育于25℃，在摇床上280RPM摇动48小时。100mL每一培养液接种于发酵罐里的15mL培养基1中。发酵罐中生长条件为25℃，15LPM(升/分钟)通气率和500RPM的搅动，持续36小时。细胞由发酵罐中收获后用于酶促转化(生物转化)(1S)-[N-(1-苄基-2-氧代-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁酯(底物)成为(1S，2S)-[N-(1-苄基-2-羟基-3-氯)丙基]氨基甲酸叔丁酯(产物)。将20克细胞悬浮于100mL 64mM的磷酸钾缓冲液(pH7.0)，从而制得细胞悬液。每个悬液中加入25mg/mL的葡萄糖和预定浓度的底物。底物生成产物的生物转化反应于28℃，160RPM在摇床中进行。在预定时间淬灭反应混合物，产物收获和分析方法同实施例1。结果概述于表2。
表2
表1和表2结果说明所需产物用此发明的方法可以得到高产率和极高的非对映体纯度。
实施例3使用不同微生物株进行生物转化完整细胞将一系列的微生物用于生物转化，试验方法同实施例1。结果示于表3。
表3
表3显示的结果说明发明中使用的微生物明确产生了可接受产率的产物，即高于70％和可接受的非对映体纯度，即高于90％。
实施例4
使用细胞抽提物和辅助因子本方法的底物和产物同前例。红串红球菌ATCC 4277细胞生长于前述培养基1中。细胞(150克)悬浮于100mL磷酸钾缓冲液中，pH7.0。细胞悬液在4℃用微流体器(microfluidizer)于13,000psi压力下分解。破碎细胞悬液以12,000RPM离心30分钟。澄清的上清液(“细胞抽提液”)用于生物转化底物到产物。
向部分(10mL)细胞抽提液加入10mg底物、葡萄糖脱氢酶(35个单位)、0.7mM NAD+(烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)和200mg葡萄糖。反应在pH台(pH stat)上进行，条件为pH6.0，150RPM搅动和30℃。样品周期性地由反应液中取出分析。产物得率为95％且非对映体纯度＞98％。此实施例中辅助因子NADH用葡萄糖脱氢酶、NAD+和葡萄糖再生，如下所示。
权利要求
1.一种制备用分子式I表示的(1S，2S)-1-卤代-2-羟基-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷的立体有择方法， I其中Hal是卤素，R选自烷基、取代烷基、芳基和取代芳基，并且R1是氨基官能团的保护基团，该方法包含使分子式II表示的(1S)-1-卤代-2-氧代-3-(保护的)氨基-4-取代的丁烷 II与可以催化分子式II所示化合物的立体有择还原反应的微生物在所述还原反应能发生的条件下接触，并回收分子式I表示的所述化合物，其中分子式II中的Halo、R和R1的定义如上，所述微生物选自红串红球菌ATCC4277、红串红球菌DSM6971和红球菌属物种ATCC21227、红串红球菌ATCC27854和短杆菌属物种ATCC19653。
2.根据权利要求
1的方法，其中Hal是氯，R是苯基，和R1是叔丁氧基羰基。
3.根据权利要求
1的方法，其中所述微生物是红串红球菌ATCC4277。
4.根据权利要求
1的方法，其中所述微生物是红串红球菌DSM6971。
5.根据权利要求
1的方法，其中所述微生物是红球菌属物种ATCC 21227。
6.根据权利要求
1的方法，其中所述微生物是红球菌属物种ATCC 27854。
7.根据权利要求
1的方法，其中所述微生物是短杆菌属物种ATCC19653。
8.根据权利要求
1的方法，以一段式发酵法进行。
9.根据权利要求
1的方法，以二段式发酵法进行。
10.根据权利要求
1的方法，在有诱导物时进行。
11.根据权利要求
10的方法，其中诱导物是分子式I所示化合物，其在所述微生物生长时加入。
12.根据权利要求
1的方法，其中分子式I所示化合物以至少70％的产率和至少93％的非对映体纯度得到。
13.根据权利要求
10的方法，其中分子式I所示化合物以至少95％的产率和至少99％的非对映体纯度得到。
14.一种制备如下分子式所示环氧化合物的方法， 其中R选自烷基、取代烷基、芳基和取代芳基，并且R1是氨基官能团的保护基团，该方法包含将如下分子式所示的芳基酯 其中R和R1的定义如前，R2是氢或硝基并可取代于苯环的邻位或对位，与含有下面分子式所示的官能团的硫叶立德化合物反应， 其中R3和R4选自烷基、取代烷基和芳基，以产生一种下面分子式所示的酮叶立德化合物， 其中R、R1、R3和R4的定义如上，用氯化物源和有机酸处理分子式III表示的所述化合物以形成下面分子式所示的1-取代的-2-氨基-3-氧代-4-氯丁烷化合物， 其中R和R1的定义如上，还原所述化合物以形成下面分子式表示的1-氯-2-羟基-3-氨基-4-取代的丁烷， 其中R和R1的定义如上，将所述羟基化合物和碱反应形成所述环氧化合物，改进之处在于还原所述1-氯-2-氧代-3-氨基-4-取代的丁烷是根据权利要求
1进行的，从而以至少70％的产率和至少93％的非对映体纯度产生所述的1-氯-2-羟基-3-氨基-4-取代的丁烷化合物。
15.根据权利要求
14的方法，其中分子式I所示化合物以至少95％的产率和至少99％的非对映体纯度得到。
专利摘要
本发明涉及一种方法，即利用红球菌属和短杆菌属的某些种类进行1－卤代－2－氧代－3－(保护的)氨基－4－取代的－丁烷的立体有择酶还原。此方法可以获得高产率尤其是很高非对映体纯度的1－卤代－2－氧代－3－(保护的)氨基－4－取代的－丁烷产物，此产物是合成一些化合物(即ACE、肾素和HIV蛋白酶的抑制剂)的有用的中间物。这种方法对产物的1S，2S对映异构体具有有利的高选择性。
文档编号C12S99/00GKCN1492932SQ01814196
公开日2004年4月28日 申请日期2001年7月20日
发明者R·N·派特尔, L·丘, R N 派特尔 申请人:布里斯托尔-米尔斯·斯奎布公司, 布里斯托尔-米尔斯 斯奎布公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan