专利名称：:分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法的制作方法
技术领域：
：本发明涉及一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶蛋白酶(蚓激酶)的方法，特别是涉及一种采用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖树脂，偶联p-氨基苯甲脒的亲和层析柱，从中分离纯化出纤溶酶中有较高纤溶活性的EFE-III组分的技术与方法。
背景技术：
：近年来人们采用盐析、超滤、分子筛、离子交换、高压液相色谱等分离方法(目前国外有文章如文献1Nakajima，N.，Mihara，H.andSumi，N.(1993)Characterizationofpotentfibrinolyticenzymesinearthworm，Lumbricusrubellus.Biosci.Biotech.Biochem.57，1726-1730。文献2Nakajima，N.，Sugimoto，M.，andIshihara，K.(2000)StableearthwormserineproteasesApplicationoftheproteasefunctionandusefulnessoftheearthwormautolysate.JournalofBioscienceandBioengineering90，174-197所介绍的。)，从蚯蚓中分离出六种蛋白同功酶(EFE-I-0，-I-1，-I-2，-II，-III-1和-III-2)，其中EFE-III二种同功酶具有最高的纤溶酶活力。体外平板法说明这些蛋白酶既可以激活纤溶酶原又能够直接降解纤维蛋白，因此被命名为蚯蚓纤溶酶(蚓激酶)。临床实验表明口服蚓激酶对心脑血管栓塞的防治效果明显。但是目前普遍采用的口服蚓激酶制剂是各个组分的混合物，吸收效率低，存在一定的毒副作用，并且对急救栓塞无能为力，新的剂型(针剂等)的研究势在必行。因此，进一步纯化有高纤溶活力的蚓激酶，使其成为单组分，可能是制备蚓激酶新的剂型的可行技术路线。在分离蚓激酶的方法上，又如国内有人利用亲和层析法分离出了糖基化的蚓激酶组分(如文献3赵晓瑜，静天玉(2001)蚯蚓纤溶酶组分的分离纯化和分析。生物化学与生物物理进展，28(2)218-220所介绍的)。他们将样品经大豆胰蛋白酶抑制剂为配基的层析柱后，得到一组非均一的蛋白酶；还要再经过二次离子交换柱后采取梯度洗脱分离出单一蛋白组分。经聚丙烯酰胺凝胶电泳后染色，切出所需条带，置电泳洗脱槽进行电泳洗脱，根据紫外光吸收回收样品。这种方法虽然得到了单一的蚓激酶组分，但成本高，回收率低，仅仅适合于实验室的微量样品制备。国内还有采用亲和层析分离单一组分蚓激酶的工艺(如文献4孙启良(2000)蚓激酶分离工艺，发明专利公开号CN1293245A)，但是，该专利没有设计出制备亲和层析柱的方法，也未能发明出蛋白组分的洗脱工艺流程和实验的结果证据，很难应用于中试或大规模生产。
发明内容本发明的目的在于克服已有蚓激酶分离技术中存在的方法复杂，成本高，收率低等缺陷；为了提高蚓激酶的药效，进一步开发新的剂型(针剂等)创造条件；通过将丝氨酸类蛋白酶的可逆性竞争抑制剂p-氨基苯甲脒以共价结合到羰基二咪唑或溴化氰活化的琼脂糖(Sepharose)上作为配基，用含有脲基或胍基化合物的溶液进行特异性梯度洗脱，得到具有高纤溶活性的单组分蚓激酶。该方法操作简单，成本低，适用于实验室和规模化生产。本发明提供一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，包括以下步骤其特征在于以p-氨基苯甲脒为配基，包括以下步骤1.羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖填料1)用羰基二咪唑活化琼脂糖填料在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；用浓度递增的二氧六环逐渐转入有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中；2)用常规的溴化氰方法活化琼脂糖填料；2.采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐溶解在NaHCO3溶液中，然后与活化后的琼脂糖填料按体积比1∶10～1∶5混合，于室温下振荡偶联，使配基连接到琼脂糖填料上，反应结束后，将填料抽干，充分洗涤，再用Tris-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液交替洗涤2次以上，抽干，待用。2.用平衡缓冲液装柱，充分平衡。3.蚯蚓粗提物上样。4.非特异性洗脱采用平衡缓冲液，洗脱至基线；特异性洗脱是用包括0.01～3.0M的含有脲基或胍基化合物的平衡混合液作为特异性洗脱液，来进行特异性梯度洗脱；收集特异性梯度洗脱下来的单组分蚯蚓纤溶酶。5.除去洗脱下来的蛋白酶溶液中的盐。6.采用通常的工艺浓缩得到蚯蚓纤溶酶的单一组分。在上述方法中，亲和层析柱所用的填料包括琼脂糖6B，琼脂糖CL-6B，琼脂糖4B以及琼脂糖CL-4B；步骤1)中用于转入有机相和洗涤用的二氧六环，其浓度是20～100％；步骤2)中所用的NaHCO3溶液，浓度为0.5～1.5M；步骤2)中偶联时维持pH4～5；步骤5)中，非特异性洗脱采用终浓度分别为0.01～0.1M的Tris-HCl，0.1～10mMNaCl及0.01～0.05％的叠氮化钠的混合液作洗脱液；步骤5)中，含有脲基或胍基化合物的特异性洗脱液，包括尿素、盐酸胍和精氨酸；本方法适用于纯化来源于双胸蚓、异唇蚓、爱胜蚓、正蚓以及锯齿蚓的纤溶蛋白酶。本发明的优点是亲和层析树脂的配基p-氨基苯甲脒是胰蛋白酶的可逆竞争性抑制剂，胰蛋白酶或胰蛋白酶样的蛋白酶可以结合在填料上，用来纯化蚓激酶，具有很强的分辨能力。将采用本发明分离纯化得到的产物进行检测用电泳仪进行SDS-PAGE电泳，分离胶浓度为8～15％。SDS-PAGE电泳图及WesternBlotting结果表明由本发明分离得到的蚓激酶组分是单一条带(如图1，2所示)，电泳显示分子量为35,000Da。氨基酸序列测定仪(AppliedBiosystemsProcise-PROCISE)的实验结果显示，N-末端氨基酸序列为N-Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg(图3)，表明此蛋白确为EFE-III，即命名为EFE-III-a。利用生色底物法进行测活(如文献5Zhou，J.，Fan，R.，WuC.andHeR.Q.(1997)Assayoflumbrokinasewithachromophoricsubstrate.ProteinandPeptideletters4，409-414)，结果表明该组分具有很强的纤溶活性(如图4所示)，因此可以制成新的剂型——针剂或疗效更强的口服液。此方法工艺简单，不需要大型复杂的设备，原料来源丰富，因此成本低，特别适合于规模化工业生产。图1本发明得到的单一蛋白组分纯度的SDS-聚丙烯酰胺电泳检测图图2WesternBlotting检测所得到蛋白组分的抗原性图3-1～10所得蛋白组分的N末端测序结果图4采用生色底物法对本发明得到的蛋白组分进行的活力测定图具体实施方式下面结合实施例和附图对本方法进行详细说明以下实施例中所用的羰基二咪唑(CDI)、p-氨基苯甲脒(PAB)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)、盐酸胍、溴化氰、Tris购自Sigma公司(美国)；Chromozym-TH购自Roche公司(瑞士)；琼脂糖填料(Sepharose)购自Pharmacia公司(美国)；其他试剂为分析纯或电泳纯。实施例11)用羰基二咪唑活化琼脂糖填料SepharoseCL-6B取10mLSepharoseCL-6B，在沙芯漏斗中水洗2～3次，再用0.001MHCl洗一次，双蒸水洗多次；分别用30％、70％和100％的二氧六环转入有机相；将羰基二咪唑(CDI)溶于二氧六环中，同Sepharose混合搅拌15～30分钟；再分别用100％、70％和30％的二氧六环各洗一次，最后用双蒸水充分洗涤，待用。2)步骤5)中，含有脲基或胍基化合物的特异性洗脱液，包括尿素、盐酸胍和精氨酸。采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶解在少量1.0MNaHCO3中，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶5(V/V)混合，于室温下振荡偶联24小时(维持pH＝4.0)，使配基连接到琼脂糖填料上。反应结束后，将填料抽干，用双蒸水充分洗涤，再用0.1M，pH＝8.0Tris-HCl缓冲液(含1.0MNaCl)和0.1M，pH＝4.0乙酸盐缓冲液(含1.0MNaCl)交替洗涤数次。3)装柱，用终浓度为pH＝6.0，0.02MTris-HCl的混合缓冲液平衡。4)上样称取赤子爱胜蚓(Eiseniafetida)粗提物的冻干粉，溶于pH＝6.0的0.02MTris-HCl，0.2mMNaCl缓冲液中，终浓度为0.5mg/mL。上样量为柱体积的1/3。5)洗脱0.02M的Tris-HCl，0.2mMNaCl及0.02％的叠氮化钠的混合液作洗脱液，除去非特异性结合的杂蛋白；然后用pH＝6.0，0.1M的Tris-HCl及0.02％叠氮化钠的混合液，用浓度范围0.01～2.0M盐酸胍进行特异性线性洗脱。收集洗脱下来的胰蛋白酶类似物组分。6)透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冷冻干燥后称重为0.1mg。配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为15％，100V电泳，得到的结果是分子量为35,000Da的单一蛋白带(如图1所示)。WesternBlotting结果表明由本发明分离得到的蚓激酶组分是单一条带(如图2所示)。氨基酸序列测定仪的实验结果显示，N-末端氨基酸序列为N-Ile-Val-Gly-Gly-Ile-Glu-Ala-Arg(如图3所示)，表明此蛋白确为EFE-III。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为反应缓冲液，测定OD385的变化，结果表明所得的蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于35ΔA·g-1·min-1(如图4所示)。实施例21)溴化氰活化SepharoseCL-4B取15mlSepharoseCL-4B在沙芯漏斗中用双蒸水充分清洗，抽干，将其悬浮在2.0M碳酸钠溶液中；称1.5g溴化氰溶于1.5ml乙腈中，分次加入SepharoseCL-4B悬浮液中，并滴加2.0M氢氧化钠溶液，维持PH值不变。反应一段时间后，立即抽干，再用0.1M四硼酸钠溶液洗涤已活化的琼脂糖填料。2)采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶解在少量1.0MNaHCO3中，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶8(V/V)混合，于室温下振荡偶联30小时(维持pH＝5.5)，使配基连接到琼脂糖填料上。反应结束后，将填料抽干，用双蒸水充分洗涤，再用0.1M，pH＝8.0Tris-HCl缓冲液(含1.0MNaCl)和0.1M，pH＝4.0乙酸盐缓冲液(含1.0MNaCl)交替洗涤数次。3)装柱，用终浓度为pH＝10.0，0.04MTris-HCl的混合缓冲液平衡。4)上样称取粉正蚓(Lumbricusrubellus)粗提物的冻干粉，溶于pH＝12的0.05M甘氨酸-氢氧化钠，0.5mMNaCl缓冲液中缓冲液中，终浓度为5mg/mL。上样量为柱体积的1/10，用pH＝12，终浓度分别为0.05M的甘氨酸-氢氧化钠。5)洗脱0.5mMNaCl及0.05％的叠氮化钠的混合液作平衡液，除去非特异性结合的杂蛋白。然后用pH＝10.0，0.2M的甘氨酸-氢氧化钠及0.05％叠氮化钠的混合液，用浓度范围是0.02～1.5M精氨酸进行特异性线性洗脱。收集洗脱下来的胰蛋白酶类似物组分。6)透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冷冻干燥后称重为0.12mg。配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为10％，100V电泳。结果表明得到的蛋白是单一组分。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为缓冲液测定OD385的变化，结果表明所得的蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于27ΔA·g-1·min-1。实施例31)用羰基二咪唑活化Sepharose6B取8mLSepharose6B，在沙芯漏斗中水洗2～3次，再用0.1MHCl洗一次，双蒸水洗多次；分别用20％、50％、80％和100％的二氧六环转入有机相；将羰基二咪唑(CDI)溶于二氧六环中，同Sepharose混合搅拌15～30分钟；再分别用100％、80％、50％和20％的二氧六环各洗一次，最后用双蒸水充分洗涤，待用。2)采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-已基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺盐酸盐(EDAC)溶解在少量1.0MNaHCO3中，然后与活化后的琼脂糖填料按1∶8(V/V)混合，于室温下振荡偶联20小时(维持pH＝5.5)，使配基连接到琼脂糖填料上。反应结束后，将填料抽干，用双蒸水充分洗涤，再用0.1M，pH＝8.0Tris-HCl缓冲液(含1.0MNaCl)和0.1M，pH＝4.0乙酸盐缓冲液(含1.0MNaCl)交替洗涤数次，装柱，用终浓度为pH＝10.0，0.04MTris-HCl的混合缓冲液平衡。3)装柱用pH＝7.0的0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，0.6mMNaCl缓冲液平衡。4)上样称取红色爱胜蚓(Eiseniarosea)粗提物的喷雾干粉，溶于pH＝7.0的0.1M磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，0.6mMNaCl缓冲液中，终浓度为3.0mg/mL，上样量为柱体积的1/5。5)洗脱用pH＝10，终浓度分别为0.1M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠，0.6mMNaCl及0.03％的叠氮化钠的混合液作洗脱液，除去非特异性结合的杂蛋白。然后用pH＝9.0，0.2M的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠及0.03％叠氮化钠的混合液，用浓度范围是0.1～1.5M尿素进行特异性线性洗脱。收集洗脱下来的胰蛋白酶类似物组分。6)透析除盐后，超滤浓缩。浓缩液冷冻干燥后称重为0.15mg。配制SDS-PAGE电泳凝胶，分离胶浓度为8％，120V电泳。结果表明得到的蛋白是单一组分。采用Chromozym-TH作为生色底物，以pH＝8.3的Tris-HCl作为缓冲液测定OD385的变化，结果表明所得的蚓激酶组分纤溶活性很高，相当于31ΔA·g-1·min-1。权利要求1.一种分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于以p-氨基苯甲脒为配基，包括以下步骤1)用羰基二咪唑或溴化氰活化琼脂糖填料a.用羰基二咪唑活化琼脂糖填料在沙芯漏斗中充分清洗琼脂糖，以除去有机相；用浓度递增的二氧六环逐渐转入有机相；将羰基二咪唑溶于二氧六环中，同琼脂糖混合搅拌；再用浓度递减的二氧六环洗涤，最后置换到水相中；b.用常规的溴化氰方法活化琼脂糖填料；2)采用p-氨基苯甲脒作为亲和层析树脂的配基将p-氨基苯甲脒和缩合剂1-乙基-3-碳二亚胺盐酸盐溶解在NaHCO3溶液中，然后与活化后的琼脂糖填料按体积比1∶10～1∶5混合，于室温下振荡偶联，使配基连接到琼脂糖填料上，反应结束后，将填料抽干，充分洗涤，再用Tris-HCl缓冲液和乙酸盐缓冲液交替洗涤2次以上，抽干，待用；3)用平衡缓冲液装柱，充分平衡；4)蚯蚓粗提物上样；5)非特异性洗脱采用平衡缓冲液，洗脱至基线；特异性洗脱是用包括0.01～3.0M的含有脲基或胍基化合物的平衡液作为特异性洗脱液，来进行特异性梯度洗脱；收集特异性梯度洗脱下来的单组分蚯蚓纤溶酶；6)除去洗脱下来的蛋白酶溶液中的盐；7)采用通常的工艺浓缩得到蚯蚓纤溶酶中的EFE-III组分。2.按权利要求1所述的p-氨基苯甲脒亲和层析法纯化蚯蚓蛋白酶的方法，其特征在于所述填料琼脂糖树脂，包括琼脂糖6B，琼脂糖CL-6B，琼脂糖4B或琼脂糖CL-4B。3.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在步骤1)中用于转入有机相和洗涤的二氧六环，其浓度是20～100％。4.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于步骤2)中所用的NaHCO3溶液，浓度为0.5～1.5M。5.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于步骤2)中偶联时维持pH4～5。6.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于步骤5)中，非特异性洗脱采用终浓度分别为0.01～0.1M的Tris-HCl，0.1～10mMNaCl及0.01～0.05％的叠氮化钠的混合液作洗脱液。7.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于步骤5)中，所述的含有脲基或胍基化合物的特异性洗脱液，包括尿素、盐酸胍和精氨酸。8.按权利要求1所述的分离纯化单组分蚯蚓纤溶酶的亲和层析法，其特征在于本方法适用于纯化双胸蚓、异唇蚓、爱胜蚓、正蚓以及锯齿蚓的纤溶蛋白酶。专利摘要本方法采用琼脂糖凝胶偶联p－氨基苯甲脒配基制备亲和层析柱，从蚯蚓的匀浆液中分离纯化出具有较强纤溶活力的单组分蛋白酶。通过该亲和层析柱，用含有脲基及胍基的化合物制备洗脱液进行梯度洗脱，经透析或分子筛等方法脱盐，得到其中的EFE－III纤溶蛋白酶，它具有很强的纤维蛋白溶解活力。用该方法纯化来源于各种蚯蚓的纤溶蛋白酶具有简洁方便，成本低等特点，适用于实验室和规模化生产。文档编号C12N9/68GKCN1454994SQ02116747公开日2003年11月12日申请日期2002年4月30日发明者赵静,赫荣乔申请人:中国科学院生物物理研究所导出引文BiBTeX,EndNote,RefMan