专利名称:耻垢分枝杆菌菌苗的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有免疫调节作用的生物制品，特别是指耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)CGMCC NO.0795菌苗，属于微生物应用技术领域：
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背景技术：
结核病是危害人类健康的重大传染病之一，多耐药结核菌的大量出现以及与艾滋病并发使结核病人数急剧增加，对人类的健康形成极大威胁。在已感染结核菌人群中强反应者(结核菌素实验时，硬结直径≥15mm或有水泡、坏死，并除去已经发病者)发病几率极高，被称为结核感染高危人群。我国目前有近半人口感染了结核菌，其中高危人群达5000万之多。大量的结核高危人群是个巨大的隐患，他们本身发病率极高，又是潜在的传染源，如何控制这些人群潜在的内源性复发和外源性再感染，是全球结核病控制的重点之一。
目前国际对结核病的控制方式主要是对未感染人群接种卡介苗预防和对临床病人采用长期化疗。然而，结核病预防沿用多年的卡介苗，其适用对象是尚未感染的健康人群，对已经感染的高危人群无保护作用；长期规则化疗又很难被尚未发病的高危人群接受。因此，为高危人群寻找合适的保护手段，对结核病的控制将有重要意义。为此，我们提出新的结核病预防概念现代预防不仅仅指预防病原体对宿主的感染，更应包括预防感染人群的发病。
上个世纪末，国内学者在Stanford教授研究的基础上，成功研制出M.vaccae菌苗，它在对结核病的辅助治疗方面获得显著疗效，这提示了对结核高危人群采取免疫预防的可能性；然而，M.vaccae菌苗在国外已受到严格的专利保护，不利于进一步研究和应用。目前类似的产品还有草分枝杆菌制剂，但其因注射副作用大，不能进行多次注射而影响了作用效果；耻垢分枝杆菌也是一种非致病性、快生长分枝杆菌，对机体有较强的免疫调节作用，国内外尚无该菌苗的报道。
发明内容
本发明的主要目的在于提供一种耻垢分枝杆菌菌苗的液体或冻干制剂的制备方法及其用途。
本发明的目的是通过如下技术方案实现的一种耻垢分枝杆菌菌苗，该菌苗包括耻垢分枝杆菌(MycobacteriumSmegmatis)的裂解产物。
所述的菌苗中的细胞已用高压蒸汽法裂解。
所述的菌苗包括耻垢分枝杆菌的细胞壁、菌体蛋白和富含细菌DNA具有较强免疫活性的CpG片段的复合物。
所述的复合物为液体菌苗或冻干制剂。
上述耻垢分枝杆菌菌苗是从耻垢分枝杆菌制备的。
所述的耻垢分枝杆菌菌苗的制备方法至少包括如下步骤步骤一菌体培养将液体低温保藏菌种室温下溶解，接种于改良罗氏培养基，37℃培养3-7天后转种于改良罗氏培养基，37℃培养3-5天；步骤二菌体收集待菌体生长至对数期时，以生理盐水洗下罗氏培养基表面的菌体并将上述菌体以生理盐水洗涤一次或一次以上，离心收集菌体。离心条件为6000r/min、30min、4℃。
步骤三菌苗制备以生理盐水或磷酸盐缓冲液将上述菌体配成所需浓度的菌液，经121℃、15min高压，裂解菌体，制备细胞匀质。
步骤四成品制备无菌条件下分装上述细胞匀质，即制得耻垢分枝杆菌液体菌苗，或经冷冻干燥制得耻垢分枝杆菌菌苗的冻干制剂。
所述的改良罗氏培养基的配制方法为(2000ml)将天冬素4.5g、磷酸二氢钾3.0g、柠檬酸镁0.65g、硫酸镁0.3g、马铃薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸馏水750ml混匀后，沸水浴至澄明，10磅20分钟灭菌，即为基质；将新鲜鸡蛋洗净沥干，75％酒精中浸泡30分钟，取出，放入无菌室，晾干；将鸡蛋液1250ml打入容器搅匀后经无菌纱布过滤入含基质的大三角瓶中，混匀并加入2％孔雀绿液20ml混匀，倒入广口瓶中，分装中管，约7ml/管；最后在87℃-88℃，40分钟条件下烤干。37℃无菌测定24h后贮存4℃冰箱备用。
上述耻垢分枝杆菌菌苗在制备一种生物制品中的用途为该生物制品可用于预防结核高危人群的内源性复发和外源性再感染；或可用于促进免疫功能处于低下状态的结核菌感染人群的免疫功能恢复；或可用于抑制免疫功能处于亢进状态的结核菌感染人群的过强免疫应答。
该生物制品可用于提高正常人群的Th1类免疫应答。
综上所述，本发明具有如下优点本发明提供的菌苗集中了细菌细胞壁良好佐剂作用、菌体蛋白的抗原特异性及诱导产生细胞因子的作用特点，并富含细菌DNA具有较强免疫活性的CpG片段；解决了国外类似制品菌体颗粒大、液体菌苗易形成菌团的问题，避免或减少了目前常规菌苗注射后可能出现的副作用，提高制品的安全性；可多次注射，解决了国外类似制品皮内途径只能一次注射或三个月以上长间隔注射效果欠佳的缺点。
本发明涉及的耻垢分枝杆菌菌苗不但可以预防正常人群被结核菌感染，更可经济、有效地控制结核高危人群潜在的内源性复发和外源性再感染，这对控制结核病的蔓延、提高人类的生活质量具有重要意义。此外，该菌苗对免疫系统介导的皮肤病也有潜在的治疗价值。
图1为阴性对照组(生理盐水组)豚鼠脏器病变外观；图2为本发明耻垢分枝杆菌菌苗预防组豚鼠脏器病变外观；
图3为阳性对照组(M.Vaccae菌苗组)豚鼠脏器病变外观。
具体实施方式
下面将结合附图和具体实施例来对本发明进行详细说明耻垢分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)，已于2002年9月10日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，保藏编号为CGMCC NO.0795。
耻垢分枝杆菌菌苗是耻垢分枝杆菌的裂解产物，其制备方法为步骤一菌体培养将液体低温保藏菌种室温下溶解，接种于改良罗氏培养基，37℃培养3-7天后转种于改良罗氏培养基，37℃培养3-5天；步骤二菌体收集待菌体生长至对数期时，以生理盐水洗下罗氏培养基表面的菌体并将上述菌体以生理盐水洗涤一次或一次以上，离心收集菌体。离心条件为6000r/min、30min、4℃。
步骤三菌苗制备以生理盐水或磷酸盐缓冲液将上述菌体配成所需浓度的菌液，经121℃、15分钟高压、裂解菌体，制备细胞匀质。
步骤四成品制备无菌条件下分装上述细胞匀质，即制得耻垢分枝杆菌液体菌苗，或经冷冻干燥、制得耻垢分枝杆菌菌苗的冻干制剂。
其中，改良罗氏培养基配制方法为(2000ml)首先，将天冬素4.5g、磷酸二氢钾3.0g、柠檬酸镁0.65g、硫酸镁0.3g、马铃薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸馏水750ml混匀后，沸水浴至澄明，10磅20分钟灭菌，即为基质。
其次，将新鲜鸡蛋(约四斤)洗净沥干，75％酒精中浸泡30分钟，取出，放入无菌室，晾干；然后，将鸡蛋液1250ml打入瓷杯，搅匀后经无菌纱布过滤入含基质的大三角瓶中，混匀，并加入2％孔雀绿液20ml，混匀，倒入广口瓶中，分装中管，约7ml/管，最后在87℃-88℃烤干；37℃无菌测定24h后贮存4℃冰箱备用。
耻垢分枝杆菌菌苗应用于动物的实验结果耻垢分枝杆菌菌苗预防高危结核的效力实验以结核强毒菌株腹股沟皮下注射健康豚鼠，建立结核菌感染的高危模型。感染后3天，给每只豚鼠肌肉注射0.1mg耻垢分枝杆菌菌苗进行免疫预防，每周一次，连续4周。同时以生理盐水作阴性对照组，以M.vaccae菌苗作阳性对照组(耻垢分枝杆菌菌苗和M.vaccae菌苗应用剂量均为一人份/只)。结果观察感染后第7周，解剖各组豚鼠，观察肝、脾、肺、淋巴结等各脏器结核病变程度，根据《病理学实验方法结核菌感染后病变指数标准》以双盲法进行评分；取各豚鼠的脾脏进行活菌分离；同时取所有动物的肝、脾、肺做病理检查。各脏器外观结果如图1、图2、图3所示，其病理评分及活菌分离结果如下表1.豚鼠脏器病变指数(X±SD)
**治疗组与对照组比较时，p＜0.01表2.豚鼠脾脏活菌分离数的对数值(X±SD)
病理切片结果为对照组动物的肺、肝、脾多呈广泛性粟粒样结核结节或干酪样坏死。M.vaccae组病变较轻，除有个例呈结核样病变，多为治疗后的类上皮样结节、或呈现正常的组织切片；耻垢分枝杆菌菌苗预防组病变最轻，呈现非特异性增生、治疗后类上皮样结节、或正常的组织切片。
综合上述结果，可以看出与对照组比较，耻垢分枝杆菌菌苗同M.vaccae菌苗一样，可显著减轻豚鼠脏器的病变程度、降低病理指数、抑制或杀死豚鼠体内的结核菌。
实验结论为耻垢分枝杆菌菌苗对已经感染结核菌的“高危”豚鼠有预防作用。
耻垢分枝杆菌菌苗的药理学研究以正常、免疫功能低下和免疫功能亢进的动物模型分别探讨了耻垢分枝杆菌菌苗的免疫调节作用及其作用机理。结果发现耻垢分枝杆菌菌苗可提高正常动物的免疫功能，尤其是提高Th1类免疫应答，包括增强T淋巴细胞增殖反应、迟发性超敏反应、提高IL-12和IL-2等Th1类细胞因子和巨噬细胞内杀伤因子(NO)的表达，这对预防结核等细胞内感染的疾病具有重要意义；同时，在免疫功能低下的动物模型中，耻垢分枝杆菌菌苗可促进免疫功能的恢复，在免疫功能亢进的动物模型中，耻垢分枝杆菌菌苗可抑制过强的免疫应答。由此可看出，耻垢分枝杆菌菌苗具有双向免疫调节功能，这对因感染时期不同而呈现不同免疫状态的结核菌感染人群的预防有重要意义。
耻垢分枝杆菌菌苗的毒理学研究按新药临床前研究的要求，进行了耻垢分枝杆菌菌苗对小鼠的急性毒性实验、Beagle犬的长期毒性实验以及豚鼠的全身过敏实验和家兔的热源实验。取3种剂量(分别为人用剂量的25000倍、50000倍、250000倍)，经腹腔、肌肉2种途径注射小鼠，结果均未引起实验小鼠的异常症状及死亡。取3种剂量(相当于拟临床人用量的62.5倍、625倍和3125倍时)，给Beagle犬连续肌肉注射14周，在实验前、中、末期和恢复期，通过一般行为、血常规、血生化、尿常规、心电图和病理学等指标的检测，均未发现Beagle犬出现毒性反应。同时，热源实验和全身过敏实验分别证明了耻垢分枝杆菌菌苗无热源反应、不引起全身速发性变态反应。
总之，耻垢分枝杆菌菌苗实验结果表明该菌苗可提高正常小鼠的细胞免疫功能，促进免疫功能低下小鼠免疫功能的恢复；抑制免疫功能亢进豚鼠超强的免疫应答；在结核菌感染的动物模型中，该菌苗可显著抑制已经感染的动物体内结核菌的繁殖、近而减轻脏器的病变程度；在猪血清致敏的动物模型中，该菌苗可显著抑制模型动物过敏反应的发生；同时，该菌苗具有良好的安全性。
最后所应说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的精神和范围，其均应涵盖在本发明的权利要求
范围当中。
权利要求
1.一种耻垢分枝杆菌菌苗的制备方法，其特征在于它至少包括如下步骤步骤一菌体培养将液体低温保藏耻垢分枝杆菌CGMCC NO.0795菌种室温下溶解，接种于改良罗氏培养基，37℃培养3-7天后转种于改良罗氏培养基，37℃培养3-5天；步骤二菌体收集待菌体生长至对数期时，以生理盐水洗下罗氏培养基表面的菌体并将上述菌体以生理盐水洗涤一次或一次以上，离心收集菌体，离心条件为6000r/min、30min、4℃；步骤三菌苗制备以生理盐水或磷酸盐缓冲液将上述菌体配成所需浓度的菌液，经121℃、15min高压，裂解菌体，制备细胞匀质；步骤四成品制备无菌条件下分装上述细胞匀质，制得耻垢分枝杆菌液体菌苗，或经冷冻干燥制得耻垢分枝杆菌菌苗的冻干制剂。
2.根据权利要求
1所述的耻垢分枝杆菌菌苗的制备方法，其特征在于所述的改良罗氏培养基2000ml的配制方法为将天冬素4.5g、磷酸二氢钾3.0g、柠檬酸镁0.65g、硫酸镁0.3g、马铃薯淀粉37.6g、丙三醇15.0ml、蒸馏水750ml混匀后，沸水浴至澄明，10磅20分钟灭菌，作为基质；将新鲜鸡蛋洗净沥干，75％酒精中浸泡30分钟，取出，放入无菌室，晾干；将鸡蛋液1250ml打入容器搅匀后经无菌纱布过滤入含基质的大三角瓶中，混匀并加入2％孔雀绿液20ml摇匀，倒入广口瓶中，分装中管，7ml/管；最后在87℃-88℃，40分钟条件下烤干，37℃无菌测定24h后贮存4℃冰箱备用。
3.一种权利要求
1或2的制备方法制备的耻垢分枝杆菌菌苗。
4.根据权利要求
3所述的耻垢分枝杆菌菌苗，其特征在于所述的菌苗包括所述耻垢分枝杆菌的细胞壁、菌体蛋白和富含细菌DNA具有较强免疫活性的CpG片段的复合物。
5.一种权利要求
3或4所述的耻垢分枝杆菌菌苗在制备一种生物制品中的用途，该生物制品用于预防结核高危人群的内源性复发和外源性再感染；或用于促进免疫功能处于低下状态的结核菌感染人群的免疫功能恢复；或用于抑制免疫功能处于亢进状态的结核菌感染人群的过强免疫应答。
6.根据权利要求
5所述的耻垢分枝杆菌菌苗在制备一种生物制品中的用途，其特征在于该生物制品用于提高正常人群的Th1类免疫应答。
专利摘要
本发明公开了一种耻垢分枝杆菌菌苗，是耻垢分枝杆菌(MycobacteriumSmegmatis)的裂解产物，集中了细菌细胞壁良好佐剂作用、菌体蛋白的抗原特异性及诱导产生细胞因子的作用特点，并富含细菌DNA具有较强免疫活性的CpG片段。该菌苗是通过收集生长于改良罗氏培养基上的耻垢分枝杆菌，用高压蒸汽法裂解制备得到的。该耻垢分枝杆菌菌苗可用于提高正常人群对结核菌的免疫功能，促进免疫功能处于低下状态的结核菌感染人群的免疫功能恢复，抑制免疫功能处于亢进状态的结核菌感染人群的过强免疫应答；尤其用于对结核高危人群的免疫预防。
文档编号C12N1/20GKCN1234845SQ02130687
公开日2006年1月4日 申请日期2002年9月18日
发明者王国治, 徐苗, 陈保文, 沈小兵, 苏城 申请人:中国药品生物制品检定所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan