专利名称:利用气升式生物反应器高效生产高纯度花生四烯酸的方法
技术领域：
本发明涉及生产高纯度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的方法。具体地说，利用气升式生物反应器，在非机械搅拌及特定优化的工艺条件下，高密度、高效培养非人工改造被孢霉(Mortierella)生产高纯度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的方法。
技术背景近年来，长链多不饱和脂肪酸在人体中的生理和治疗功能得到越来越多的重视和认同。长链多不饱和脂肪酸通常包括Omega-3，Omega-6和Omega-9多不饱和脂肪酸。由于Omega-3和Omega-6多不饱和脂肪酸具有极其重要和独特的生理及营养功能，这些多不饱和脂肪酸的开发和利用得到人们的普遍重视(Chen F & Jiang Y.Algae and Their B iotechnologicalPotential，Kluwer Academic Publishers，316pp.(2001)；陈峰，姜悦《微藻生物技术》，共348页，中国轻工出版社(1999))。花生四烯酸(arachidonic acid，AA)属Omega-6长链多不饱和脂肪酸，而二十二碳六烯酸(docosahexaenoicacid，DHA)则属于Omega-3长链多不饱和脂肪酸。这两种多不饱和脂肪酸是人的神经和视觉组织中结构性成分，因此在神经和视觉系统中必不可少。人体并不能有效地从头生物合成花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)；所以必须从食物中摄取以满足人体的需求。关于多不饱和脂肪酸的生理功能和营养学方面的研究已有较多的报道。目前研究的重点在于如何通过生物技术的方法，利用微生物(包括海洋微藻，真菌等)来高效生产纯度高、杂质少的多不饱和脂肪酸。尤其是由于生产花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)的菌种通常会同时生物合成二十碳五烯酸(EPA)，可是EPA对婴幼儿的生长发育有一定的不良影响。因此，利用微生物生产不含EPA的花生四烯酸(AA)或二十二碳六烯酸(DHA)是目前世界范围内的重要研究课题。
花生四烯酸(AA)存在于多种微生物中，尤其是真菌(例如，Mortierellaspp.，包括Mortierella alpina，Conidiobolus nanodes，Entomophthora exitalis，Blastocladiella emersonit)和微藻(例如，Porphyridium cruentum，Sargassumsalicifolium，Euglena gracilis)(J.Biosci Bioeng.871-14(1999))。其中高山被孢霉(Mortierella alpina)是最高效的花生四烯酸(AA)生产菌之一(J.Biotechnol.56153-165(1997))。在本专利申请之前，也有几份有关利用高山被孢霉生产花生四烯酸申请(包括，马泰克公司，公开号CN1175976A；华中科技大学，公开号CN1323904A，CN1539982A；烯王生物公司，公开号CN1362522A)。然而，这些专利申请存在着种种缺点与不足。包括(1)生产规模小、产油量低、花生四烯酸生产能力低等缺点(公开号CN1175976A)；(2)由于采用超低温，发酵周期长。且通气量太高，不但高耗能，现实生产难以实现(CN1323904A)；(3)花生四烯酸油脂中含有难以去除的二十碳五烯酸(EPA)(高达3.7％)(CN1539982A)；(4)生物工程诱变菌存在生产稳定性与食用安全性等潜在的问题(CN1362522A)。同时，这些专利申请也忽略了机械搅拌对被孢霉菌丝体的破坏以致可能导致生物量和花生四烯酸产量低等问题。因此，需要一种生产高效花生四烯酸的新方法。
因此，本发明的目的是提供一种高效生产花生四烯酸的方法。本发明的另一目的是提供由本发明的方法得到的花生四烯酸。
发明内容
本发明提供一种生产高纯度花生四烯酸的方法，其包括在通风条件下，利用非机械搅拌，采用深层液体高密度培养被孢霉(Mortierella)。
具体实施方式
为了达到高密度、高效、低耗能、规模化生产高纯度食用安全性高的花生四烯酸油脂，本发明采用非人工改造被孢霉(包括Mortierella alpine和同属的其他种株，例如Mortierella alliacea)，利用气升式生物反应器(80L至10000L)，通风速度为不低于0.5VVM，但通常可维持在低于3VVM的较低水平，通过喷气口，反向对冲喷射，以增加发酵液溶解氧浓度。这样一方面减少机械搅拌的能耗，另一方面可以保护被孢霉细胞不被搅碎或剪切损伤，从而增大了细胞的存活率，并使细胞内含物(包括花生四烯酸油脂)不会流失，从而大大提高产油率。
本发明所用的液体培养基为以海水或海盐为主要成分的基本培养液，并添加葡萄糖、氨基酸、酵母浸出物、无机盐、微量元素等成分，通过高温(121℃)蒸气消毒20分钟，快速冷却后接种培养。培养液的启始pH为6，而发酵过程中pH控制在6-8的范围内。培养温度在细胞的大量积累阶段(通常是首5.5天)控制在约31℃从而使细胞维持在较高的繁殖速率，而主要碳源葡萄糖浓度控制在40g/L以下，使细胞不受抑制，保持较高的比生长速率，而葡萄糖的补充则采用指数添加的补料方式。在花生四烯酸大量积累阶段(通常是后1.5天)，温度降为23-25℃，从而促进长链多不饱和脂肪酸的形成。在此同时，通气量应维持在较高的水平(接近3VVM)以保持溶解氧不低于30％饱和度，这样有利于花生四烯酸的合成和积累。通过本发明所描述的方法，细胞干重可达40g/L，产油可达50％(细胞干重)，花生四烯酸含量可达45-53％(总油)并不含二十碳五烯酸(EPA)。耗能为机械搅拌发酵的40％。
以上为本发明的总体描述，以下所列实施例只供说明本发明之用，而不是对本发明的任何限制。
实施例1高山被孢霉实验室保存培养在含有土豆葡萄糖的培养基(将土豆粉碎、煮沸、用0.4微米滤纸过滤、加入葡萄糖40g/L)中加进DIFCO公司琼脂(10g/L)，配制成固体培养基。高温蒸气消毒(121℃)20分钟后供接种用。将高山被孢霉(Mortierella alpineRK0233)菌丝体用接种环转移少许到土豆葡萄糖固体培养基上。在30℃静置培养。为保证菌种的无污染和健康，每天进行显微镜镜检，若受污染必须马上纯化，并每3天利用气相质谱仪分析一次脂肪酸组成(尤其是花生四烯酸含量的稳定性)，以确保菌种的原有特性。
实施例2气升式生物反应器(80L)培养生产花生四烯酸将保存培养的少许高山被孢霉(Mortierella alpine RK0233)菌丝体首先接种于250mL装有100-150mL经高温蒸气消毒灭菌的培养液的三角瓶中。该培养液含有大约20％的深海水，并含有以下成分葡萄糖，20g/L；酵母浸出物，10g/L；硝酸钠，7g/L；谷氨酸，2g/L；KH2PO4，1g/L；CaCl2.H2O，0.1g/L；MgSO4.7H2O，0.5g/L；FeCl3.6H2O，15mg/L；Zn SO4.7H2O，7.5mg/L；及CuSO4.5H2O，0.5mg/L。pH调为6.0。培养温度为31℃。摇床速度为150rpm。在三角瓶摇床培养2天后接种到装有80L同样培养液的气升式生物反应器中，接种量为3.5％。培养温度为31℃。通风速率启始为0.5VVM。并通过模拟指数生长连续添加葡萄糖，但在任何情况下葡萄糖浓度维持在40/L以下。在此条件下培养5天。然后停止流加葡萄糖，并开始降温至23-24℃，加大通风速率至2VVM，二天后离心收集菌丝体，热风干燥，然后冷冻(-20℃)保藏。
通过此实施例方法气升式生物反应器培养，比生长速率高达0.06h-1，菌丝体干重为37.5g/L，生物量(对葡萄糖)转化率为0.48g/g，产油率(占菌丝体干重)为47.6％，花生四烯酸(AA)占总油含量为52.8％，二十碳五烯酸(EPA)含量为0。
实施例3气升式生物反应器(10,000L)培养生产花生四烯酸此实施例中的三角瓶摇床培养及80L生物反应器的培养方式大致与上述相同。80L生物反应器的培养被用作为一级种子培养，所以省略了低温(23-24℃)加大通气积累多不饱和脂肪酸阶段。培养期也相应缩短为2天。另外，增加1000L规模的二级种子培养阶段，培养方式与一级种子培养相似，即高温31℃快速培养2天，然后以5％的接种量接到10,000L气升式生物反应器。让其培养5.5天直至菌丝体大量积累至37-40g/L干重。在此期间，葡萄糖采用指数生长添加法(按比生长速率高达0.06h-1计算流加速率)。然后，急速降温至23-24℃，通风速率提高至3VVM，保持1.5天后放罐，离心收集菌丝体，热风干燥，然后冷冻(-20℃)保藏。在整个10,000L气升式生物反应器发酵过程中，严格间隙式取样分析检查生物量增长、糖氮消耗、脂肪酸组成、细胞状态等，确保产量和质量的稳定性。表1和2列出气升式生物反应器(10,000L)培养生产花生四烯酸(AA)的相关实验数据。
表1脂肪酸的组成
*含量少于0.5％。
表2其他的重要参数
权利要求
1.一种生产高纯度花生四烯酸的方法，其包括在通风条件下，利用非机械搅拌，采用深层液体高密度培养被孢霉(Mortierella)。
2.根据权利要求
1的方法，其中被孢霉为非人工改造，包括高山被孢霉(Mortierella alpine)和同属的其他种株，例如Mortierella alliacea。
3.根据权利要求
1的方法，其中在被孢霉种株在非机械搅拌的气升式通风培养条件下快速生长。
4.根据权利要求
1的方法，其中所采用的培养液为以海水或海盐为主要成分的基本培养液，并添加葡萄糖、氨基酸、酵母浸出物、无机盐、微量元素等成分。
5.根据权利要求
1的方法，其中所述的通风为气升式喷射，通风速度为不低于0.5VVM(每分钟单位培养液的通气量)，pH为6-8。
6.根据权利要求
2-5的方法，被孢霉的培养分为两个阶段，即细胞的大量积累和产物的大量积累阶段。
7.根据权利要求
6的方法，其中在细胞的大量积累阶段，控制葡萄糖浓度在每升40克以下以防止基质抑制影响，同时温度维持在约31℃。
8.根据权利要求
6的方法，其中在产物的大量积累阶段提供充分的溶解氧(高于30％饱和度)，并处于较低温(低于25℃)。
9.根据权利要求
1-8的方法，其中被孢霉积累大量高纯度花生四烯酸(AA)；细胞中抽提所得的粗油不含二十碳五烯酸(EPA)；发酵周期为七天。
10.根据权利要求
1-9的方法生产的高纯度花生四烯酸。
专利摘要
本发明涉及一种利用气升式生物反应器，在特定优化的工艺条件下，高密度、高效培养非人工改造被孢霉(Mortierella)生产高纯度花生四烯酸(arachidonic acid，AA)的新方法。本方法具有节能、高密度、高效、花生四烯酸纯度高并不含二十碳五烯酸(eicosapentaenoic acid，EPA)等特点。
文档编号C12R1/645GKCN1786178SQ200410100348
公开日2006年6月14日 申请日期2004年12月6日
发明者姜悦, 陈璇 申请人:姜悦, 陈璇导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan