专利名称:用于将选择的分子转运至细胞的载体的制作方法
本发明涉及用于将选择的分子转运至细胞的载体，其包含SAINT分子，所述分子通过静电作用，更特别地通过非共价结合，例如通过氢键结合至所述选择的分子。此外，本发明涉及用于将选择的分子靶向转运至细胞的SAINT分子的用途。
以这样的方式，即以选择的分子必须在身体的优选的细胞中或其附近发挥其作用的方式施用选择的分子在现有技术领域：
的知识水平之内。递送这些分子至身体的一种可能性是给身体施用相当大的量的选择的分子，由此，通过扩散，可在被靶向的细胞中获得所需浓度的所述选择的分子。该方法的问题在于选择的分子在身体的其他部位可能产生不想要的位置效应(site effects)。
因此已发展了递送选择的分子例如药物至位于身体的特定部位的特定细胞。使用的第一种方法包括将选择的化合物偶联至抗体。该偶联是共价偶联。作为结果，选择的化合物的活性，和游离的分子的活性相比，显著降低。此外，目前使用的方法是将选择的分子包装在脂质体中。可将抗体偶联至其中包装有所述分子的脂质体的外侧。该抗体至脂质体的偶联大部分发生在将选择的分子包入脂质体之后。在抗体的偶联发生在选择的分子被包入之前的情况下，所述抗体可能位于脂质体的内膜，这样可能导致脂质体的功效减少。将选择的分子例如药物化合物包装入脂质体的公知的不利方面是药物将缓慢地从脂质体渗漏出来。第二个不利方面是包装(脂质内部包含选择的化合物)的形成必需在包含所述选择的化合物的溶液中进行。在包装期间，不超过5％的选择的化合物被包装入脂质体中。这意味着95％的选择的化合物未被包装入脂质体内。因此，该方法的效率非常低。
本发明的目的在于提供强力地提高选择的化合物至细胞的递送的载体。
此外，本发明的目的在于提供使得能够对选择的分子进行长效和稳定的结合的载体。
为达到上述目标中的至少一个目标，本发明提供了前文中提到的载体，所述载体特征在于权利要求
1的方案(measures)。通过这种方式，提供了递送选择的分子至细胞的非常稳定的方法。
尽管通常提到下面的氢相互作用和氢键，但相互作用不限于该单一形式。在所有情况下，是指任何类型的静电作用。
在本说明书中，术语“细胞”以其一般意思使用。然而，说到此，本领域技术人员将清楚地理解，“特定的细胞”是指选择的化合物待被转运至的细胞。
优选的实施方案描述于权利要求
2、3和4。
根据另一个方面，本发明涉及Saint分子以被靶向的方式将选择的分子转运至细胞的用途。Saint分子是公知的，也被描述为转运载体，且详细描述于欧洲专利公开号BP-0755924 B1和具有公开号US5,853,694和US 6,726,894的美国专利，所述专利由本申请者注册。这些专利-申请的描述在本申请中引用作为参考。根据广义描述，Saint分子被当作合成的两亲性分子。
将选择的分子例如一般为大分子或药物制剂封装在Saint分子中的方法详尽地描述于前述的欧洲专利EP 0755924 B1和美国专利US5,853,694和US 6,726,894。
根据优选的实施方案，将Saint分子共价地连接至连接体分子。通过该共价偶联，确保其为稳定的载体的整合的和牢固的部分。考虑到R5和R5′可以相同或不同，所述连接体可在位置R1、R2、R3、R4、R5和R5′上结合至Saint分子。关于这些类型的Saint分子的更详细的描述，参考US 6,726,894。连接体的实例是例如下列1-N’-甲基--4-(氨基丁基，顺-9-油烯基)-甲基氯化嘧啶(methylpyrimidiniumchloride)(SAINT-氨基-连接体)和1-N′-甲基-4-(N-琥珀酰亚胺基-S-乙酰硫代乙酸，顺-9-油烯基)-甲基氯化吡啶(Saint-SATA-连接体)。在这两种情况下，乙酰硫代乙酸(acetylthioacetate)和SATA基团用作连接体(部分)。然而等同的化合物也可用作连接体-部分，包括可共价地连接至Saint分子的每一种化合物。尽管一般只有一个连接体分子与Saint分子结合，但位置的组合可能被连接体分子占据，例如单独的R1、R2、R3、R4、R5或R5′或这些位置的组合，最多所有5个连接体位置都被占据。
根据其他优选的实施方案，细胞特异性配体选自抗体或其衍生物、蛋白、肽、具有作为细胞表面的靶的特定用途的化合物和具有想要的细胞特异性的其他化合物。
抗体或其衍生物可通过合成产生或可以是天然发生的变体。
在本发明的范围之内，我们将能够结合细胞的受体或蛋白的每一种化合物都当作配体。配体的前提条件是其具有对于受体和/或细胞类型的特异性。这些类型配体的实例是L-多巴或肾上腺素衍生物。该第一类型的配体特异性地结合黑质中的多巴胺受体；第二类型的配体特异性地结合身体的肾上腺素能受体。当然，本发明不限于该实例。
更特别地，优选地，被封装的分子结合在Saint分子的活性表面。不受该实施方案的限制，此处使用带正电荷的吡啶(pyridinium)基团。该基团结合至被封装的带负电荷的大分子。此外，所述Saint分子可能以间接的方式结合大分子，在所述大分子带正电荷的情况下，通过和围绕所述大分子的水层相互作用结合大分子。因此，所述Saint分子将通过静电作用例如通过形成氢键结合所述大分子，从而阻止选择的分子从Saint分子渗漏。
此外，来自例如吡啶环的碳原子或邻位电子的静电作用可能用于结合。
本发明产生了将选择的分子例如药物递送至身体的特定部位的特定细胞的可能性。因此产生了有利方面，即必须给身体施用的药物的量可和需要治疗的细胞的量精确地配合。通过选择Saint分子和被封装的化合物之间的恰当的配制，可防止所述化合物的渗漏，且在递送至细胞膜、和其融合或被其吸收后将其释放，所述细胞膜也包含和连接体偶联的配体互补的受体配体。通过该方式，防止了所述选择的分子在身体的其他位置释放。在此处，其仍包含在saint分子-载体中。
上面描述本发明的基本内容。基于上面的描述和所附的权利要求
，本领域技术人员将能够容易地产生都将落在本发明的范围之内的其他实施方案。
实施例人胚肾细胞难以被转染。当使用这些细胞时，主要的竞争转染法(competing transfection method)(其他厂商的)需要几微克的质粒DNA以进行成功的转染。在和SAINT-18组合的情况下，1□g(每12个孔)通常导致高于90％的转染率。为了能够体现靶向部分SAINT-18-RGD的增强效应，在该方案中，我们使用少量的质粒DNA(每12个孔500ng)。Saint-连接体-RGD的结构式描述于下面的
图1中。此外，如本发明中所描述的，将RGD-肽偶联至SAINT-连接体的SATA基团。RGD基团是整联蛋白受体家族的靶向部分且被认为可增加转染的功效。将人胚肾细胞品系293A培养在12孔板中并用4种组合的Saint分子(即Saint-18、偶联至RGD的Saint-18、Saint-18和偶联至RGD的Saint-18的混合物和只有作为参照的连接体分子)进行转染。将500ng CMV-GFP质粒和3.75nm SAINT分子或连接体(每孔)混合。转染48小时后，通过FACS分析测量GFP的表达。GFP阳性细胞的百分比示于下面的图中。
分子式＝C58H91ClN8O10S分子量＝1103.88734
Saint-连接体-RGD的结构式描述于图1的结果清楚地显示1.S18-连接体(参照)作为转染剂的功能很差(第4柱)。
2.S18/RGD能够转染细胞。
3.S18∶S18RGD比例500∶1增加转染率大约33％。
单独的S18-连接体不具有显著的转染能力。我们预测，100％的S18-RGD具有由于RGD基团产生的空间位阻效应导致的减少的转染功效。然而，当将S18RGD和S18以500∶1的比例混合时，转染效率大大增加。将确定更佳的比例。
使用除了RGD外的靶向部分(例如细胞特异性配体)获得了类似的结果。然而，在所有情况下，需要最优化以获得最优的效果。该实验极好地表明Saint分子的转染增强特征。
(按照条约第19条的修改)1.用于转运选择的分子至细胞的载体，其包含与Saint-连接体分子混合的脂质、亲水脂分子或其它类型的药物递送实施方案，其特征在于所述Saint分子共价结合至连接体分子，且所述连接体分子共价结合至抗体或其衍生物、蛋白、肽、具有其靶向细胞表面的特定用途的化合物和具有想要的细胞特异性的其他化合物。
2.Saint分子在将选择的分子靶向转运至细胞中的用途，其中所述Saint分子通过静电作用结合至所述选择的分子，且其中所述Saint分子偶联至所述连接体分子，且所述连接体分子偶联至细胞特异性配体。
3.权利要求
2的用途，使用权利要求
1的载体。
权利要求
1.用于转运选择的分子至细胞的载体，其包含通过静电作用结合至所述选择的分子的Saint分子，其特征在于所述Saint分子结合至连接体分子，且所述连接体分子偶联至细胞特异性配体。
2.权利要求
1的载体，其特征在于所述Saint分子共价地结合至所述连接体分子。
3.权利要求
1或2的载体，其特征在于所述细胞特异性配体选自抗体或其衍生物、蛋白、肽、具有其靶向细胞表面的特定用途的化合物和具有想要的细胞特异性的其他化合物。
4.权利要求
1、2或3的载体，其特征在于所述共价结合的分子启动和细胞的融合。
5.Saint分子在将选择的分子靶向转运至细胞中的用途，其中所述Saint分子通过静电作用结合至所述选择的分子，且其中所述Saint分子偶联至所述连接体分子，且所述连接体分子偶联至所述细胞特异性配体。
6.权利要求
5的用途，使用权利要求
2、3或4中任一项的载体。
专利摘要
用于将选择的分子转运至细胞的载体，其由通过静电作用结合至选择的分子的Saint分子构成，其中所述Saint分子偶联至连接体分子且所述连接体分子偶联至细胞特异性配体，其中所述Saint分子共价地结合至所述连接体分子。
文档编号C12N15/88GKCN101044241SQ200580035812
公开日2007年9月26日 申请日期2005年10月20日
发明者M·H·J·勒伊特斯 申请人:辛沃鲁克斯Ip有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan