专利名称:在酮酸存在下的酶促反应的制作方法
在酮酸存在下的酶促反应
发明领域
本发明涉及在特定的反应增强化合物的存在下X-Gly至χ-α -羟基-Gly或 X-NH2 (X是具有甘氨酸基团可以与其共价附着的羰基的肽或任何化合物)的酶促转化。在优选实施方案中，这些反应增强化合物是酮酸(或其盐或酯)，它们可以有利地替代过氧化氢酶使用，所述过氧化氢酶是现有技术这些类型酶促反应，例如酰胺化反应的一般组分。
相关领域的描述
众多人激素、生长因子、细胞因子、神经递质衍生的脂肪酸和其他重要的生物学化合物具有氨基酸或肽作为其分子结构的基本部分。许多疾病对患者中的这些生物学化合物的水平升高呈阳性应答。可以以多种方式给患者施用治疗上有效量的此类生物学相关化合物。因此，关于此类化合物的有效的、划算的制造方法是非常重要的。当生物学化合物以适合于经口递送的剂量形式制备时，这是特别正确的，所述经口递送的剂量形式是通常优选的施用方式，尽管相对于其他施用方式生物利用率较低。
哺乳动物细胞和其他真核生物可以执行特定的翻译后加工操作，而原核生物则不能。某些原核生物，例如大肠杆菌(E. coli)广泛用作宿主用于经由重组DNA (rDNA)技术生产哺乳动物蛋白质，因为它们可以很容易在分批发酵方法中生长，且因为它们在遗传上是充分表征的。然而，许多哺乳动物蛋白质需要一定类型的翻译后加工。如果这些蛋白质由例如大肠杆菌基因工程产生，那么翻译后加工通常必须使用复杂的、体外化学操作来完成， 这对于大规模生产应用是成本高昂的。即使当使用哺乳动物宿主重组生产肽时，通常也需要有效生产只在稍后对其实施进一步修饰的前体。
一种类型的此类进一步加工活性涉及肽或蛋白质的羧基末端氨基酸的特异性酰胺化。许多天然存在的激素和肽包含此类修饰，如果蛋白质将是生物学活性的，那么所述修饰通常是必需的。一个例子是降钙素，其中用非酰胺化脯氨酸残基替代天然形式的酰胺化脯氨酸导致生物学活性非常显著的减少。为了完全活性需要翻译后酰胺化的其他生物学肽包括但不限于生长激素释放因子、其他降钙素、降钙素基因相关肽、促胰液素、肽YY等。
蛋白质的羧基末端氨基酸的特异性酰胺化通常由α酰胺化酶催化。为了最大功效需要酰胺化的许多重要的生物学蛋白质的多肽序列可以例如通过基因工程技术来制造。 然而，重要的和有时必需的羧基末端酰胺化通常必须在体外进行。在这点上需要避免昂贵且繁琐的化学酰胺化技术，并且因此需要采用酰胺化酶来执行特异性的酰胺化。
肽基甘氨酸α -酰胺化单加氧酶(PAM)催化肽底物转化为酰胺化的肽产物。该转化是2步反应。PAM具有2个催化结构域肽基甘氨酸α _羟基化单加氧酶(PHM)催化步骤1(底物转化为中间体)和肽基甘氨酸α-羟甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)催化步骤 2 (中间体转化为产物)。全长的PAM催化2个步骤。
在自然界中，大约50%的肽激素和神经递质以前述方式由PAM酰胺化。PAM活性已在众多不同物种中识别出来，并且在不同的物种如大鼠、母牛和青蛙中往往具有显著的结构同源性。还已知PAM的功能、底物和辅因子在物种之间是相似的(通常相同)。底物是具有含有游离羧基的甘氨酸残基的化合物，通常是肽。PAM催化的酰胺化反应是本领域众所周知的。例如，在美国专利6，103，495中详细描述了一种反应，其中使用肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶催化甘氨酸延伸型鲑鱼降钙素前体转化为在其C末端酰胺化的真正的鲑鱼降钙素(即，具有替代前体C末端甘氨酸的氨基)。
由于酶的失活，PAM的活性在酰胺化反应的过程中迅速减少。为了预防此类失活， 现有技术的酶促酰胺化反应一般需要第二种酶(例如过氧化氢酶或辣根过氧化物酶)用于良好的转化和反应得率。然而，这消极影响了该方法的成本和效率，并且从调节立场上通常是不合需要的。例如，过氧化氢酶是大的蛋白质，它难以纯化，并且它可能被不需要的蛋白酶污染，所述蛋白酶在酰胺化反应中可以攻击任何产物、前体和/或酶。在药物产物的情况下与过氧化氢酶共同纯化的蛋白质还可超过调节标准地污染最终产物。此外，当过氧化氢酶来自动物来源时，或当过氧化氢酶制造中使用动物组分时，必须特别小心以避免传染性海绵状脑病。
发明概述
因此本发明的目的是提供有效、高得率、低成本的酶促酰胺化反应，其中过氧化氢酶或其他酶促清除剂相对于现有技术可以大大减少，并且优选完全消除。另一目的是提供根据前述反应方法制造的酰胺化生物学化合物。
在一个方面，本发明提供了用于体外生产酰胺化产物的方法，所述方法包括在(A) 肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶和(B)反应增强化合物的存在下，所述反应增强化合物是 α -酮酸，或其盐或酯，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体反应，其中所述α “酮酸具有分子结构RC (0) C (0) 0Η，且其中R选自芳基、C1-C4烃部分、卤化或羟基化的 C1-C4烃部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本发明提供了用于体外生产酰胺化产物的方法，所述方法包括通过在(i)肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶和(ii)反应增强化合物的存在下，所述反应增强化合物是α “酮酸，或其盐或酯，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体反应形成羟基化中间体，其中所述α-酮酸具有分子结构RC(O)C(O)OH,且其中R选自芳基、 C1-C4烃部分、卤化或羟基化的C1-C4烃部分和C1-C4羧酸；和同时或随后在路易斯碱或肽酸α-羟甘氨酸α-酰胺化裂合酶的存在下使所述中间体反应。
在另一实施方案中，本发明提供了用于增强肽药物试剂的生物利用率的方法，其中所述试剂在非天然酰胺化的位置处酰胺化，所述非天然酰胺化通过如下步骤完成，使具有游离酸形式的甘氨酸残基的前体在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶和(B)反应增强化合物的存在下，所述反应增强化合物是α “酮酸，或其盐或酯，在需要酰胺化的位置处反应，其中所述α “酮酸具有分子结构RC (0) C (0) 0Η，且其中R选自芳基、C1-C4烃部分、卤化或羟基化的C1-C4烃部分和C1-C4羧酸。
在另一方面，本发明提供了用于增强肽药物试剂的生物利用率的方法，其中所述试剂在非天然酰胺化的位置处酰胺化，所述非天然酰胺化通过下列步骤完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶和(ii)反应增强化合物的存在下，所述反应增强化合物是 α -酮酸，或其盐或酯，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体在需要酰胺化的位置处反应，其中所述α “酮酸具有分子结构RC (0) C (0) 0Η，且其中R选自芳基、C1-C4烃部分、卤化或羟基化的C1-C4烃部分和C1-C4羧酸，因此形成羟基化中间体；和
(B)同时或随后使所述中间体与路易斯碱或肽基α -羟甘氨酸α _酰胺化裂合酶反应。
在上述方法的一个实施方案中，反应增强化合物是α-酮酸盐。在另一实施方案中，反应增强化合物是α-酮酸酯。在再一实施方案中，反应增强化合物是α-酮酸。
在一个实施方案中，R(在反应增强化合物的分子结构中)是芳基(优选苯基)。 在另一实施方案中，R是C1-C4烃，优选C1-C4烷基。直链R基团可能比相应的支链R基团略微更加有效。
本发明还提供了已根据本文提及的任何一种方法制备的酰胺化产物。
发明详述
本发明应用于制造需要具有酰胺基的任何化合物。因为本文讨论的酶识别具有甘氨酸残基的肽，所以本发明对于此类结构的酰胺化有用，即使当它们是较大分子的部分时， 所述较大分子在其他位置上包括非天然的或修饰的氨基酸，或氨基酸衍生物例如保护基团等。即使具有作为其分子结构部分的非肽区域的化合物也应从本发明受益，只要存在由本文使用的酶识别的甘氨酸。
催化本文反应的酶被认为识别具有游离酸形式(即具有游离的羧基)且附着至羰基的甘氨酸残基的任何前体底物。参见，例如，Merkler等人，Archives of Biochemistry and Biophysics, 1966，第330卷，No. 2，430-434(甘氨酸延伸型脂肪酸底物)；和美国专利 6，103，495 (在天然鲑鱼降钙素的酰胺形成的氨基位置上具有C末端甘氨酸的鲑鱼降钙素， 用作鲑鱼降钙素酰胺化的底物)。因此，预期使用本文讨论的酰胺化酶的任何底物的任何酶促酰胺化都可以从本发明受益，它增强替代现有技术过氧化氢酶(或其他现有技术的反应增强化合物例如清除剂酶(scavenging enzyme))的酶促酰胺化。对于PHM催化的反应同样应该是正确的，PHM是PAM的功能性结构域之一。
存在众多的药物试剂，不仅包括天然的激素和神经递质，还包括药物活性截短物及其修饰，或衍生的脂肪酸，当酰胺化时所述药物试剂更具有生物学活性。即使当生物学活性不必增加时，药物试剂的酰胺化也可能令人满意地增加相对于使用游离酸形式的试剂的经口生物利用率。参见2004年10月7日公开的美国专利公开号20040197323 (Mehta等人的美国专利申请序号10/761,481的公开)，其公开内容引入本文作为参考。本领域技术人员将理解如本文所教导的酰胺化肽或其他化合物的其他原因。本发明被认为增强PAM催化和PHM催化的反应，不管所选择的产物或底物，只要底物是由PAM或PHM识别的底物。
肽基甘氨酸α -酰胺化单加氧酶(PAM)及其2个催化结构域肽基甘氨酸α -羟基化单加氧酶(PHM)和肽基甘氨酸α-羟甘氨酸α-酰胺化裂合酶(PAL)在文献中得到报告。本领域还已报告了优选的反应条件，辅因子等。本文报告了酰胺化和酰胺化产物纯化的一个具体例子。本发明的主要改进是现在可以用某些α-酮酸(或其盐或酯)替代现有技术酰胺化中通常使用的过氧化氢酶。
不希望被理论束缚，认为本文讨论的酶促反应不合需要地生产过氧化氢作为副产物，所述过氧化氢对酶促反应和/或可回收的产物得率有负面影响。在现有技术中认为过氧化氢酶可能已充当过氧化物清除剂以使形成的任何过氧化氢的负面影响最小化。
再次不希望被理论束缚，认为本发明的α _酮酸(或其盐或酯)有效地执行过氧化物清除剂的作用而无需过氧化氢酶或其他清除剂酶。认为例如α-酮酸可以以下列方式与过氧化反应[0027]R-C (0) -C (0) -0Η+Η202 — RC (0) 0H+C02+H20
当使用丙酮酸作为α-酮酸时，假定它与过氧化氢反应以产生乙酸、水和二氧化碳。
因为R基团在这个反应中没有变化，所以大量的R部分是可能的。申请人已测试了许多酮酸(或其相应的酯或盐)，并且在下表1中已报告了其用于酰胺化重组人甲状旁腺激素截短物(PTH的前31个氨基酸，随后为C末端甘氨酸)的效率。在表1的脚注里还报告了使用过氧化氢酶的酰胺化。在表1中酰胺化产物的转化不是可直接比较的，因为使用了不同浓度的反应增强酮酸(或其盐或酯)。选择适合于每种化合物的优选浓度。同样，因此关于表1中测试的每种化合物使用单独的对照，从而使得每种化合物的表现可以与其对应的对照进行比较。如所表明的，3种测试化合物并不优于对应的对照。表1中列出的对照值是在本发明的反应增强化合物不存在下酰胺化rhPTH(l-31)Gly32-0H观察到的一般值。
用α -酮酸/酯的酰胺化反应
下文列出了执行以测试各种酮酸(或其盐或酯)的功效的一些反应细节。
为了确定下表1中的信息，在水中制备所有试剂的贮存液。在下列条件下进行酰胺化:4mg/mL rhPTH(l-31)Gly32_0H、30mM 2-吗啉代乙磺酸(MES)pH[6. 3-6. 5]、0· 5 μ M硫酸铜、5mM碘化钾、2mM抗坏血酸、[0-1%]乙醇和15，000U/mL PAM。所有反应均于37°C温育 4小时。以下列顺序加入试剂rhPTH(l-31)Gly32-0H、水、MES、碘化钾、乙醇、硫酸铜、α -酮酸或酯、抗坏血酸和ΡΑΜ。所有反应均用6%三氟乙酸酸化至ρΗ 2. 0并通过CEX-HPLC (面积％ )分析，以检测所需产物rhPTH(l-31)NH2的形成。结果如下表1。
表 1
在α -酮酸/酯的存在下 rhPTH(l、0.5 μΜ硫酸铜、5mM碘化钾、2 mM抗坏血酸、[0如表1中所示，α -酮酸的盐和酯倾向于与相应的α -酮酸类似地表现。较大的 R基团倾向于不能如较小的R基团(优选C1-C4) 一样表现良好，除了芳族基团当位于吸电子位时倾向于表现良好。直链化合物倾向于比相应的支链化合物表现得稍好一些。预期烃部分可以是卤化或羟基化的而不明显损害功能。如所显示的，有效的化合物表现相当良好并且因此是现有技术过氧化氢酶的适当的替代物，因此避免了上文讨论的过氧化氢酶的缺点ο
下文列出了根据本发明酰胺化底物并纯化所得产物的一些详细的方法步骤。
实施例1 使用肽基甘氨酸α -酰胺化单加氧酶将甘氨酸延伸型甲状旁腺激素片段转化为酰胺化的对应物
使用丙酮酸盐的rhPTH(l-34)Gly35-0H的酰胺化
表2中显示了用于酰胺化rhPTH(l-34)Gly35-0H的组分和最终浓度。随后为酰胺化的概述。
8表2 rhPTH(l 将在 l，900mL 25mM MES、200mM NaCl pH 6. 0 中的大约 12. 4 克 rhPTH(l_34) Gly35-0H装进配有搅拌器和气体喷雾器的玻璃容器中。
向这种溶液中以列出的顺序加入下列组分3，025mL水、74lmL250mM MES pH6. 3、1. 03mL 3mM硫酸铜、124mL碘化钾、62mL 190标准强度乙醇、124mL 400mM丙酮酸钠和124mL100mM抗坏血酸钠。
将反应容器置于水浴中并将反应混合物搅拌加热至25-27°C。
用21mL 2M HCl将反应混合物的pH调整至5. 8。启动氧喷射；调整喷射速率以避免反应混合物的过量发泡。
加入47mL PAM并将反应混合物于25_27°C温育4小时35分钟(在温育时间段自始至终执行氧喷射)。
用74mL 2M HCl将反应混合物酸化至pH2. 4。
如Miller 等人 ABB 298 :380_388 (1992)美国专利号 4，708，934、欧洲公开 0308067和0382403、以及Biotechnology第II卷(1993)第64-70页中所描述的可以获得 PAM酶，其公开内容引入本文作为参考。PAM酶还可由内部命名为UGL 73-26/M MWCB 00的 PAM表达细胞系获得，所述细胞系根据国际承认用于专利程序的微生物保存布达佩斯条约 (Budapest Treaty on the International Recognition of Deposits of Microorganisms for Purposes of Patent Procedure)作为ATCC编号PTA-6784保藏于美国典型培养物保藏中心(ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas Virginia, 20110-2209, U. S. Α.。 对保藏的细胞系实施在这个条约下公布的规程，并且样品将在条约要求的时间和在条约要求的条件下，并符合条约签名人的专利法和规程时可用。例如，在基于本申请的美国专利或要求其优先权或参考其的任何其他美国申请授权后，对保藏材料的可用性的所有限制将不能取消地去除至布达佩斯条约或35U. S. C. § 112所要求的程度。
甘氨酸延伸型前体可以通过类似于美国专利6，103，495，实施例1_2中所描述的方式发酵产生，并如美国专利6，103，495，实施例3中所描述的在酰胺化之前进行纯化.它还可根据美国专利公开U. S. 2005/0221442 (美国申请号11/076,260)产生。前述的公开内容引入本文作为参考。
在其中用于酰胺化的酶是肽基甘氨酸α -羟基化单加氧酶(PHM)的情况下，使用与如上所述相同的反应混合物，其中用PHM替代ΡΑΜ。此外，在4-6小时的温育时间段结束时，通过添加碱使反应混合物的PH增至8-9。在终止反应之前将反应混合物再搅动4-8小时。通过只表达PAM的N末端部分(约前40dKa)可以获得ΡΗΜ。参见例如Mizuno等人， BBRC第148卷，No. 2，第546-52页(1987)，其公开内容(因为它涉及Mizuno' s" AEl" 引入本文作为参考。已知青蛙皮肤天然地表达PHM。
实施例2 酰胺化后的纯化
阳离子交换(CEX)层析
使用CEX 层析实现从残留的 rhPTH(l-34)Gly35-0H 纯化 rhPTH(l_34) _NH2。下文描述了 CEX层析法的概述。将酸化的酰胺化输出物装载到9cmX19cm、用25mM MES pH 6.5 平衡的Toyopearl SP650M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以180cm/小时操作并且在 280nm监控柱流出物的UV吸光度。用25mM MES pH 6. 5洗涤柱直至柱流出物的pH回到 6.5。用25mM MES,80mM NaCl pH6. 5洗涤柱直至洗涤峰完全洗脱并且达到稳定的UV基线。 用25mMMES，200mM NaCl pH 6. 5从柱洗脱产物rPTH(l_34) _NH2。收集整个UV峰；并通过 RP-HPLC筛选级分以确定汇集的标准。反相(RP)层析
使用RP层析将盐形式的肽从氯化物交换为乙酸盐；RP层析提供了肽的边缘纯化。 用3体积的333mM乙酸钠稀释CEX层析输出物并充分混合。在装载前允许混合物在室温下放置75分钟。将乙酸盐稀释的样品装载到6cmX17cm、用250mM乙酸钠pH 7. 5平衡的 Amberchrom CG300M(Tosoh Bioscience LLC)柱上。柱以 180cm/小时操作并且在 280nm监控柱流出物的UV吸光度。用250mM乙酸钠pH 7. 5将柱洗涤60分钟。用0. 乙酸平衡柱。用0. 乙酸、40%乙醇从柱中洗脱出产物rhPTH(l-34)-NH2。收集整个UV峰。
rhPTH (1-34) -NH2 的表征
将RP层析输出物通过冻干法浓缩为白色絮状粉末，从而得到11.8克(来自酰胺化的95 %总得率)rhPTH (1-34) _NH2。通过电雾化电离质谱法(ESI-MS)确定 rhPTH(1-34)-NH2分子量为4，116. 9Da，这与计算出的平均分子量4，116. 8Da相一致。
尽管本发明已关于其具体实施方案进行了描述，但许多其他变化和修饰及其他用途对于本领域技术人员将是显而易见的。本发明因此不限制于本文的具体公开内容，而仅限制于附加的权利要求
。
权利要求
1.用于体外生产酰胺化产物的方法，所述方法包括在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶和(B)反应增强化合物的存在下，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体反应，其中，所述的反应增强化合物选自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其盐、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其盐、2- 丁酮酸或其盐、3-甲基-2-氧代丁酸或其盐和2-酮戊二酸或其盐。
2.权利要求
1的方法，其中所述反应增强化合物选自丙酮酸或其盐。
3.权利要求
2的方法，其中所述反应增强化合物是丙酮酸钠。
4.用于体外生产酰胺化产物的方法，所述方法包括(A)通过在(i)肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶和(ii)反应增强化合物的存在下，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体反应形成羟基化中间体，其中，所述的反应增强化合物选自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其盐、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其盐、2-丁酮酸或其盐、3-甲基-2-氧代丁酸或其盐和2-酮戊二酸或其盐；和(B)同时或随后使所述中间体与路易斯碱或肽基α-羟甘氨酸α _酰胺化裂合酶反应。
5.权利要求
4的方法，其中所述反应增强化合物选自丙酮酸或其盐。
6.权利要求
5的方法，其中所述反应增强化合物是丙酮酸钠。
7.权利要求
1的方法，其中所述产物是非天然酰胺化的肽。
8.权利要求
4的方法，其中所述产物是非天然酰胺化的肽。
9.权利要求
1的方法，其中所述产物是酰胺化的肽，其中所述的肽在非天然酰胺化的位置处酰胺化。
10.权利要求
4的方法，其中所述产物是酰胺化的肽，其中所述肽在非天然酰胺化的位置处酰胺化。
11.用于增强肽药物试剂的生物利用率的方法，其中所述试剂在非天然酰胺化的位置处酰胺化，所述非天然酰胺化通过如下步骤完成，使具有游离酸形式的甘氨酸残基的前体在(A)肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶和(B)反应增强化合物的存在下，在需要酰胺化的位置处反应，其中，所述的反应增强化合物选自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其盐、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其盐、2- 丁酮酸或其盐、3-甲基-2-氧代丁酸或其盐和2-酮戊二酸或其盐。
12.用于增强肽药物试剂的生物利用率的方法，其中所述试剂在非天然酰胺化的位置处酰胺化，所述非天然酰胺化通过下列步骤完成(A)在(i)肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶和(ii)反应增强化合物的存在下，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体在需要酰胺化的位置反应，因此形成羟基化中间体，其中，所述的反应增强化合物选自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其盐、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其盐、2-丁酮酸或其盐、3-甲基-2-氧代丁酸或其盐和2-酮戊二酸或其盐；和(B)同时或随后使所述中间体与路易斯碱或肽基α -羟甘氨酸α _酰胺化裂合酶反应。
13.权利要求
1的方法，其中所述产物是肽。
14.权利要求
4的方法，其中所述产物是肽。
15.用于体外生产α-羟基-甘氨酸的方法，所述方法包括在(i)肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶和(ii)反应增强化合物的存在下，使具有游离酸形式且附着至羰基的甘氨酸残基的前体反应，其中，所述的反应增强化合物选自丙酮酸乙酯、丙酮酸或其盐、丙酮酸甲酯、苯甲酰甲酸或其盐、2- 丁酮酸或其盐、3-甲基-2-氧代丁酸或其盐和2-酮戊二酸或其盐。
16.权利要求
15的方法，其中所述反应增强化合物选自丙酮酸或其盐。
17.权利要求
16的方法，其中所述反应增强化合物是丙酮酸钠。
专利摘要
在酮酸或其盐或酯的存在下酶促实现X-Gly至X-α-羟基-Gly或X-NH2(X是具有能够与甘氨酸形成共价键的羰基的肽或任何其他化合物)的体外转化，以提供良好的得率而无需过氧化氢酶或类似的酶促反应增强剂。肽基甘氨酸α-酰胺化单加氧酶(PAM)是用于催化该转化的优选酶。可替代地，使用肽基甘氨酸α-羟基化单加氧酶(PHM)将X-Gly转化为可以回收的X-α-羟基-Gly，或任选地可以同时或顺次通过路易斯碱或酶肽基α-羟甘氨酸A-酰胺化裂合酶(PAL)的作用转化为酰胺。PHM和PAL都是PAM的功能性结构域。
文档编号C12P21/06GKCN101065493 B发布类型授权 专利申请号CN 200580040163
公开日2011年11月16日 申请日期2005年11月23日
发明者A·P·康萨尔沃, J·P·吉利甘, N·M·梅塔, W·斯特恩 申请人:尤尼基因实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),