用于提高扩增的核酸修复的制作方法

专利名称:用于提高扩增的核酸修复的制作方法
用于提高扩增的核酸修复
背景技术：
多核苷酸的复制，更具体地扩增，通常用在分子生物学中以研究，例如，基因的性质。当多核苷酸以某些方式被损坏时，复制便产生问题。
例如，美国专利5，035，996描述了一种在扩增反应中使用修饰的核苷酸、dUTP控制聚合酶链反应扩增反应的污染的方法。该方法使用尿嘧啶DNA糖基化酶(UDG)消除那些含有尿嘧啶的PCR产物以防止污染后续的PCR反应。美国专利公开2004-0067559 Al也依靠扩增前引物DNA中修饰的碱基，并使用，例如dUTP以掺入扩增子中。随后，可通过加入例如UDG和内切核酸酶(Endo) IV，使扩增子形成片段。
一种被称作热启动核酸扩增的扩增方法已经被用于降低聚合酶链反应(PCR)过程中的错误引发(mis-priming)。在一类热启动扩增中，依靠在PCR反应中存在带有加帽的 3’末端(blocked 3'terminus)的PCR引物阻止聚合酶引起的延伸(参见例如，美国公开号 2003-0119150)。所述引物通过在> 37°C时有活性的热稳定3‘ -5'外切核酸酶去帽。因此，所述聚合酶仅当外切核酸酶在> 37°C使3'末端去帽时才延伸PCR引物。可选地，Taq 聚合酶被加帽，并随后在扩增温度下被激活。
Barnes, W. Μ. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2216-2220(1994)描述了在扩增中使用Vent⑧聚合酶和Taq聚合酶作为对仅应用Taq聚合酶的改良。(ihadessy等报道了突变的Taq聚合酶，该聚合酶不会被破损的或脱碱基的位点终止((ihadessy等，Nature Biotechnol. 22(6) :755-9(2004))。
报道称，如果DNA大量破损，则常规扩增技术受到影响(Di Bernardo等，Nucl. Acids Res. 30 :el6(2002))o由暴露于含有DNA核酸酶的环境和微生物引起的DNA降解和 /或片段化是鉴证学、诊断测试和常规扩增中常见的问题，并且影响扩增产物的保真度和产率。此外，分析从储存、冷冻或成化石的灭绝的或极其稀有的生物体中所获得DNA的研究人员也要面对DNA降解的问题。
Fromenty, B.等，Nucl. Acids Res. 28(11) :e50(2000)和国际公开号 W0/0151656 报道了，用外切核酸酶(Exo)III处理提高长PCR的产率。然而，Fromenty也报道了，使用 Exo III时DNA < 500bp的扩增子的产率降低。与使用ExoIII相关的一个问题是它降解模板及引物。
Di Benardo 等在 Nucl. Acids Res. 30(4) :el6(2002)中描述了 T4DNA 连接酶(T4 连接酶)及大肠杆菌聚合酶用作预处理，以在双链DNA的交联区域间扩增单链DNA的较短区域。
扩增受损DNA的另一个方法在美国公开号2003-0077581中描述。降解的核酸和与其有同源序列的未降解核酸杂交。随后降解核酸的区域被核苷酸前体填充。接着用聚合和/或连接酶共价链接片段化的链。
改善受损DNA扩增的制剂可从Sigma, St. Louis, MO和Qbiogene，现在的MP Biomedicals, Irvine, CA购得。尽管这些制剂的组成没有说明，可以设想这些制剂中含有 Exo III。[0010]其他人报道了大肠杆菌DNA聚合酶I (E. coli DNA Poll)与T4连接酶的组合使用以进行预扩增修复(Pusch等，Nucl. Acids Res. 26 :857 (1998))。然而，根据Pusch等，所述预扩增产物必须在扩增开始前纯化。发明概述
在本发明的一个实施方式中，提供了一种通过修复受损多核苷酸增强复制或扩增产物的保真度和产率中至少一项的方法，其中该方法可以包括在不存在内切核酸酶 VI (Endo VI)的反应混合物中温育多核苷酸，所述反应混合物包含连接酶和NAD+或ATP中至少一种作为辅助因子。所述多核苷酸可从任何天然或合成来源获得，包括从保藏的生物材料、法医学证据、生物起源的古老物质以及组织活检切片材料获得。多核苷酸破损的例子可包括脱嘌呤/脱嘧啶(AP)位点、化学修饰的核苷酸、切口、缺口和DNA-DNA、DNA-蛋白质交联，DNA-RNA交联或RNA-RNA交联中至少一种。
在本方法的一个实施例中，所述连接酶是热稳定连接酶。Taq DNA连接酶是使用 NAD+作为辅助因子的热稳定连接酶的一个例子。大肠杆菌DNA连接酶是其辅助因子为NAD+ 的连接酶的另一个例子。所述含有连接酶的反应混合物中其它组分可以包括T7 Endo I或其突变体、聚合酶及AP内切核酸酶中的一种或多种。用在所述反应混合物中的聚合酶的例子包括Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶、或古细菌(archaeal)聚合酶或其突变体。古细菌聚合酶或由此衍生的嵌合的聚合酶的例子包括Pfu、Vent. 、De印Vent ,9° North,KOD和 Wmsion 聚合酶以及PWO中的一种或多种。用在所述反应混合物中其它聚合酶的例子包括 Y聚合酶家族的成员，如大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人聚合酶κ、人聚合酶η、 Sso Dpo4、Sac Dbh, See聚合酶ζ和人聚合酶ι。
用在所述反应混合物中的内切核酸酶的例子包括至少下列一种来自噬菌体Τ4、 大肠杆菌、人类和嗜热菌属(Thermus)种中任意的至少一种内切核酸酶。所述反应混合物可进一步包含一种或多种选自下面的酶Τ4嘧啶二聚体糖基化酶、[fapy]_DNA糖基化酶 (Fpg), UvrA, UvrB, UvrC, UvrD, Cho, Endo V, Endo III,Endo VI11, UDG, λ β 蛋白、RecA 和 Aag0
在本发明的一个实施方式中，通过选自以下的方式，在复制多核苷酸后实现产率的提高，这些方式包括PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、转录调控的扩增、链置换扩增、滚环扩增和全基因组扩增。当所述多核苷酸为RNA，所述扩增可以是反转录扩增 (RT-amplification)。当所述多核苷酸为DNA，所述反应混合物可包括在10-1000 μ L的反应体积内，加入到I-IOOOng DNA中的1-100单位的大肠杆菌Endo IV、0. 05-0. 25单位的大肠杆菌聚合酶I以及5-500单位的Taq连接酶。
当浓度约50%以下的起始多核苷酸制备物提供缺少该反应混合物可获得的至少相似量的复制产物时，确定为产率改善或提高。优选地，所述改善应该是可重复的，表示约 75%或更多的复制样品将证明改善。而且，任选地，所述方法的一个附加特征是它能够在单一的温育温度下获得改善的结果。
在本发明的一个实施方式中提供了一种方法，其中多核苷酸的扩增能够在聚合酶链反应中产生大小范围在50个核苷酸到100，000个核苷酸内的扩增子。
在本发明的一个实施方式中，提供了包含一种或多种酶以及它们的使用说明的试剂盒，其中至少一种酶是连接酶，所述一种或多种酶被配制为可添加进多核苷酸制备物中， 以增强(如上文所述)多核苷酸的复制。[0018]在本发明的一个实施方式中，提供了一种组合物，该组合物包括有效量的连接酶、 聚合酶和AP内切核酸酶——不包括Endo VI，提供与没有该组合物的复制多核苷酸相比， 复制多核苷酸产率和保真度至少一种的增强。在所述组合物的一个例子中，某种酶的浓度如下在10-1000 μ L体积中，1-100个单位的AP内切核酸酶、0. 05_5个单位的聚合酶、和 5-500个单位的连接酶用在预扩增混合物中。
所述组合物中特定酶的例子包括AP内切核酸酶，更具体地，II型AP内切核酸酶， 更具体地，大肠杆菌Endo IV。所述聚合酶的例子是大肠杆菌聚合酶I。此外，所述组合物可进一步包含至少一种下列的酶Τ4嘧啶二聚体糖基化酶、[fapy]_DNA糖基化酶(Fpg)、 UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、Cho、Endo V、Endo III、Endo VIII、UDG、RecA、λ β 蛋白禾口 Aag。
在本发明的一个实施方式中，提供了一种提高复制或扩增的多核苷酸产率的方法，包括(a)获得至少第一对和第二对引物，其中第二对引物在与多核苷酸杂交时嵌入第一组引物中；(b)使多核苷酸经受上述组合物；(c)用第一组引物扩增该多核苷酸；(d)用第二组引物扩增(c)的产物；以及(e)获得扩增多核苷酸的提高的产率。
在本发明其它的实施方式中，提供了一种克隆多核苷酸片段的方法，包括利用诸如上述组合物修复多核苷酸片段中的序列错误。这种组合物具有使多核苷酸片段的末端平齐(blunt-ending)的有利特性，消除了将片段克隆进载体中的步骤。
在本发明其它的实施方式中，提供了一种测定多核苷酸序列的方法，包括测序前将所述多核苷酸与上述组合物接触。测序结果的质量在灵敏度和准确度方面通常有改善。
在本发明其它的实施方式中，提供了一种复制或扩增片段化DNA的方法，包括 (a)将片段化的DNA与上述组合物接触；(b)任选地，加入重组的感受态蛋白；和(c)扩增或复制该片段化DNA。重组的感受态蛋白的例子是来自如λ噬菌体的RecA和β蛋白。附图简述

图1A-1D显示用特定酶预先温育后，从热破损λ DNA中得到提高的扩增子产率。
图IA显示由热引起的不同程度破损的DNA模板以及这种破损对51Λ λ DNA片段的扩增的影响，其中5ng、2ng和Ing的热处理的λ DNA在99°C热处理O秒、30秒、60秒、90 秒、120秒或180秒预先破损后被扩增。所述受损DNA在扩增前未经过酶处理。扩增的量经电泳后确定，并且发现其因120秒热处理而大大降低。凝胶上第一泳道包含1 μ g的对数2 梯度大小标准物(2-log ladder sizestandard) (NEB#N3200,New England Biolabs，Inc.， Ipswich, MA)。
图IB示出使用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌聚合酶I从热破损的λ DNA中扩增51Λ λ DNA片段得到提高的扩增子产率。DNA被如图IA所述热破损，但是受损DNA在扩增前经过酶处理。扩增结果在使用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌聚合酶I进行10分钟预处理反应后显示。扩增子的产率全部增加，但是特别值得注意的是120秒和180秒热破损DNA。凝胶上第一泳道和最后泳道含有IygW 2_log梯度大小标准物(NEB#N3200，NewEngland Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ)。
图IC显示了使用Taq连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌聚合酶I从热破损λ DNA 中得到的提高的扩增子产率。扩增按照图IB所示进行，但是扩增前的酶处理包含耐热嗜热菌(Thermus thermophilus) (Tth)Endo IV代替大肠杆菌内切核酸酶IV。扩增结果在使用水生嗜热菌(Thermus aquaticus) (Taq)连接酶、Tth Endo IV和大肠杆菌聚合酶I进行10分钟预处理反应后显示。扩增子的产率全部增加，但是特别值得注意的是120秒和180秒热破损DNA。只有第一泳道包含分子量标记梯度。
图ID显示了使用大肠杆菌连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV和大肠杆菌DNA聚合酶I从热破损λ DNA中得到的提高的扩增子产率。扩增按照图IB所示进行但是扩增前的酶处理包含大肠杆菌连接酶代替Taq连接酶。经过99°C加热180秒的λ DNA被用作模板。 所用模板DNA的量在每一泳道的上方显示。对每个由酶预处理的模板数量，51Λ扩增子的产
率提高。
图2Α和2Β显示模板DNA经ρΗ 5的柠檬酸盐缓冲液处理对扩增子产率的影响。
图2Α显示了 51Λ的λ DNA片段扩增的结果，其中λ DNA在ρΗ 5的柠檬酸盐缓冲液中在70°〇加热0、20、40、80、120和160分钟。50ng、10ng和5ng每种柠檬酸盐处理的样品被扩增，并且所得产物在凝胶上观察以确定扩增的程度。所述DNA在扩增前没有用所选酶进行处理。右侧最后泳道包含Iyg的2-log梯度。
图2B显示了 λ DNA的51Λ扩增子产率的增加，无论所述酶混合物中使用何种聚合酶。120分钟柠檬酸盐破损的λ DNA在扩增前用多种酶处理。
第1 泳道1 μ g 的 2-log 梯度(NEB#N3200,New England Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ)。
第2泳道无预处理。
第3泳道用Taq连接酶、Taq DNA聚合酶及大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。
第4泳道用Taq连接酶、大肠杆菌聚合酶I及大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。
第5泳道用Taq连接酶、Taq Vent DNA聚合酶混合物及大肠杆菌内切核酸酶 IV预处理。
图3显示了磷虾(krill)基因组的200bp片段的扩增结果，所述磷虾基因组是从乙醇储存的磷虾样品中提取的，并且用包含多种聚合酶中的一种、连接酶和提高扩增产率的AP内切核酸酶的酶混合物预处理。
第1泳道没有用酶对磷虾DNA进行预处理。
第2泳道用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及Taq聚合酶预处理磷虾DNA。
第3泳道用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及Vent 聚合酶预处理磷虾DNA。
第4泳道用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及50 1 Taq Vent 聚合酶预处理磷虾DNA。
图4显示了从热破损DNA得到101Λ扩增子产率的增加。180秒热破损DNA用酶混合物预处理并随后扩增。
第1 泳道1 μ g 的 2-log 梯度大小标准物(NEB#N3200，New EnglandBiolabs, Inc. , Ipswich, ΜΑ)。
第2泳道用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV及大肠杆菌聚合酶I预处理。
第3泳道用Taq连接酶、大肠杆菌内切核酸酶IV预处理。
第4泳道用Taq连接酶预处理。
第5泳道对照——未处理的DNA。
图5显示了连接酶预处理提高了从环境DNA(土壤样品提取物)获得的扩增子的产率。[0049]第1 泳道2_log 梯度大小标准物(NEB#N3200，New England Biolabs, Inc.， Ipswich, ΜΑ)。
第1泳道无酶预处理。
第2泳道用Τ4连接酶预处理。
第3泳道无酶预处理。
第4泳道用Taq连接酶预处理。
图6Α-1到6Α-9以及6Β-1到6Β-2 用大肠杆菌DNA连接酶(A)和T4DNA连接酶 (B)在NCBI进行Blast P搜索。
图 7 :Tth Endo IV 的 DNA 序列(SEQ ID NO :11)。
图8A、8B和8C显示了紫外光对使用λ DNA的扩增子产率的影响。
图8Α λ DNA经历长达50秒的紫外辐射，并且显示出产生21Λ扩增子的产率轻微降低。
图8Β λ DNA经历长达50秒的紫外辐射，并且显示出51Λ扩增子产率的降低。
图8C 加入到λ DNA中的多种反应混合物对紫外辐射后的51Λ扩增子的产量的影响被示出。
第2-7泳道是不存在反应混合物的对照。
第8-13泳道显示了加入连接酶、聚合酶及AP内切核酸酶以及10单位T4pdg的增加的有益效果。
第14-19泳道显示了加入连接酶、聚合酶及AP内切核酸酶以及80单位T4pdg的增加的有益效果。
第1 和 20 泳道:2-log 梯度大小标准物(NEB#N3200，New EnglandBiolabs, Inc.， Ipswich, ΜΑ)。
图9Α和9Β显示了加入连接酶到T7Endo I扩展了 Endo I DNA比例的可用范围， 其中产物未被降解。如每一泳道所示，Taq连接酶和T7Endo I以不同的量被加入到超螺旋的DNA中。
图9A是对照，其中没有Taq连接酶被加入但是增加量的T7Endo I被使用。所述超螺旋DNA用12. 5-25单位的T7Endo I被大量切成各种尺寸的片段。
图9B显示100单位Taq连接酶的加入在T7Endo I的存在下如何保护DNA不受非特异性酶切，以至于甚至用200单位T7Endo I时，仍有对应于线性DNA的，未在不存在连接酶的情况下出现的清晰条带。
图IOA和IOB显示了修复酶处理对氧化破损DNA或未破损模板的扩增子产率的影响。
图IOA显示了加入修复酶到未破损模板，PWB407，对扩增子产率没有影响。
图IOB显示了加入Fpg到破损模板——质粒PWB407，对产率产生不一致的效果，所述破损模板在甲基蓝存在下预先温育。在Fpg存在或不存在的情况下加入Taq连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶及大肠杆菌内切核酸酶IV —致地增加了扩增子的产率。
图11显示了用修复酶处理后，从破损的DNA得到增加的PCR反应保真度。PCR之前对未破损模板PWB407进行修复酶处理对保真度没有明显影响。单独用Fpg或也用Taq 连接酶、大肠杆菌DNA聚合酶I及大肠杆菌内切核酸酶处理破损的模板——用甲基蓝温育
9的质粒PWB407，增加了 PCR的保真度。如下文所述，保真度的量度是克隆含IacZ的扩增子后，白色菌落的数量与蓝色菌落的数量之比。白色菌落的百分比越高，错误率越高。
图12显示了处理受损DNA或以增加保真度或产率中至少一项的流程图。
图13A和1 显示了用多种酶修复混合物在室温下温育15分钟或在4°C温育过夜的，30秒紫外破损的DNA的51Λ片段扩增子的产率如何被提高。
图13A 室温温育
第1泳道2-log梯度DNA分子量标准物。
第2和3道未用多种酶修复混合物在室温下温育15分钟的两个反应。
第4和5道用修复混合物在室温下温育15分钟的反应具有预期的51Λ扩增子。
图13B :4°C温育
第1泳道2-log梯度DNA分子量标准物。
第2和3泳道未用多种酶修复混合物在4°C温育过夜的两个反应。
第4和5道用修复混合物在4°C温育过夜的反应具有预期的51Λ扩增子。
图14显示用修复酶混合物在室温下处理15分钟和用古细菌聚合酶进行PCR扩增后，从含尿嘧啶的质粒中得到的扩增子产率的提高。第1和2泳道显示使用vent DNA聚合酶的pNEBO. 92U的PCR扩增产物。在920bp有一个勉强可见的条带。第3和4泳道显示了从用修复酶混合物处理的PNEBO. 92U得到的PCR扩增产物。
图15显示了琼脂糖凝胶，其上可辨识出一条对应于620碱基对的扩增DNA的条带。所述620bp的扩增子是从48个核苷酸或更少的20个重叠单链寡核苷酸获得的。
第1 泳道:2-log DNA 分子量标准物(NEB#N3200，New England Biolabs, Inc.， Ipswich, ΜΑ)。
第2泳道在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0. 1单位大肠杆菌聚合酶 1、5单位T4pdg和20单位Endo IV温育的20个寡核苷酸。
第3泳道在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0. 1单位大肠杆菌聚合酶 1、5单位I~4pdg、20单位Endo IV和λ β蛋白温育的20个寡核苷酸。
第4泳道在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0. 1单位大肠杆菌聚合酶 1、5单位1MpdgJO单位Endo IV和大肠杆菌RecA温育的20个寡核苷酸。
第5泳道在装配步骤中，用400单位Taq DNA连接酶、0. 1单位大肠杆菌聚合酶 1、5单位T4pdg、20单位Endo IV、λ β蛋白和RecA温育的20个寡核苷酸。
第6泳道对照，在装配步骤中，未加入修复酶的20个寡核苷酸。
图16显示了 DNA修复处理对未被辐射(_)和被辐射DNA(+)的影响，其通过由当含有选择性标记的DNA被用来转化细胞时获得菌落的数量来确定。
图17显示了使用不同的嵌套引物对在2组扩增反应后对从古穴熊(ancient cave bear)DNA获得提高的扩增子产率。基因图谱显示了引物对F1_R1、F1_R2和F1-R4的位置。 在凝胶上方，提供了一组数字(88、79、10、11、1868和1314)，其代表每个样品中估计的线粒体DNA量。3A和;3B泳道包含最多的DNA。+/_表示使用Fl-Rl进行第一次扩增前是否使用了修复混合物。在3B泳道中，观察到对应于已修复洞穴熊DNA的明显的条带，其在不存在修复的泳道中没有出现。
图18显示了质粒pNEBO. 92U的DNA序列(SEQ ID NO 42)。实施方式详述[0092]本发明的实施方式提供了复制，或更特别地扩增多核苷酸方法的改进。提高复制或扩增的多核苷酸产率和保真度中至少一项与在复制或扩增无反应混合物存在下所需的 50%多核苷酸后获得的可检测到的多核苷酸产率相关，所述反应混合物含有如本实施方式中示例的选定的修复酶。“保真度”涉及这样的复制，在其中错误率小于不存在包含本实施方式中所示例选定的修复酶的反应混合物的其它情况。
本发明的方法使用包含酶的反应混合物。如果怀疑存在多种类型的破损，那么可以如实施例中使用的特殊混合物所示，构建酶的组合。如果多核苷酸的破损是已知的，那么优选的酶混合物可如实施例中所示被选择。如果破损的性质未被识别，可以使用通用酶混合物。总之，在一步中一起加入酶不排除依次加入酶。
在多核苷酸复制导致聚合酶依赖性扩增时，长度小于约500个碱基(短至100个碱基对)的短扩增子或大于500个碱基或长至约501Λ的长扩增子可被扩增(用PCR、RT-PCR 和qPCR扩增)。其它类型的扩增可产生具有宽的尺寸范围的扩增子。例如，尺寸小至100 个碱基或大至全基因组(人类为三十亿个碱基)的多核苷酸。这些扩增方法的例子包括 全基因组扩增、滚环扩增(RCA)和解旋酶依赖性扩增(HDA)。其它类型的多核苷酸合成包括引物延伸反应，如测序反应。所述方法的实施方式在分子生物学研究和解决应用生物学问题上具有广泛用途，其包括例如分析片段化和破损的DNA，诸如下列情况中发现的DNA 物证分析；生物考古学——其中分析来自远古来源的DNA是期望的；生物分类学——其中分析来自环境样品，如生命工程条码(Barcode of Life Project)所要求的DNA是期望的；及包括组织活检确定疾病的易感性或状态的诊断分析。其它用途包括高保真度测序、基因装配、片段分析及克隆的一步法复制和连接。破损的来源及程度
大多数分离的多核苷酸或体外复制的多核苷酸都受到某种程度的破损。多核苷酸的破损可能源自单个核苷酸的化学修饰或多核苷酸骨架的破裂。多核苷酸经受来自各种来源的破损，如包括甲醛和乙醇的化学试剂、环境因素、极端温度、氧化、干燥和紫外光。各种类型的破损包括(a)由例如热、多核苷酸在乙醇中的储藏及暴露于环境中诸如水或极端 PH值的因素引起的脱嘌呤或脱嘧啶破损；(b)由例如脱氨基作用、烷基化和氧化引起的单个核苷酸的修饰；(c)由例如热、多核苷酸在乙醇中的储藏及暴露于环境中诸如水或极端 PH值的因素引起的切口和缺口；(d)由例如甲醛、光或环境因素引起的交联；(e)由例如由聚合酶造成的核苷酸错误插入引起的DNA错配；及(f)DNA的片段化。
在保藏的组织、干燥的标本或暴露于环境的多核苷酸中破损更严重。破损可以作为样品或其来源或其制备物老化的结果而发生。而且，破损可在多核苷酸合成方法应用的过程中发生，如在涉及高温步骤的PCR扩增过程中发生。因此，大多数核苷酸有一定程度的破损。当较长的扩增子被分析时，这种破损有较大的影响，因为扩增中遇到破损的可能性增大。
多核苷酸可以以各种方式受到破坏。不同的多核苷酸制备物经历不同类型的破损，取决于例如，该多核苷酸制备物在体外的储存和操作，含有多核苷酸的原核细胞、古细菌或真核细胞如何储存及从中提取多核苷酸的细胞的性质。合成的多核苷酸可在化学合成中受到破坏。
术语“多核苷酸”特别是指双链DNA、双链RNA、杂交DNA/RNA双螺旋、单链DNA和单链RNA。[0099]“修复酶”特别是指参与多核苷酸修复过程的嗜冷、嗜温或嗜热的酶。例如，修复酶可引发在某个键的多核苷酸断裂，从而促进该多核苷酸破损区域的移除或单一核苷酸的移除。具有合成功能的酶，如连接酶和聚合酶，也是修复酶。在本发明的实施方式中，在反应混合物中提供了一种或多种选定的修复酶。破损的DNA经受所述反应混合物，以增强DNA 的复制和/或扩增。“增强”是指与不存在修复混合物所观察到的比例相比，获得了复制或扩增产物与初始材料的改善的比例。
DNA修复酶在科技文献中被描述，例如，参见Wood，R. D.等的Mutat. Res. 577(1-2) :275-83(2005)和 Elsen, J. A.和 Hanawalt, P. C.的 Mutat. Res. 435(3) 171-213(1999)。下面表1中提供了人类修复酶的列表。尽管没有在表1中描述，但是所列酶的同源体和其它功能上相关的酶包含在修复酶的描述中。上述任何酶可以是天然存在的、重组的或合成的。所述任何酶可以是天然的或体外产生的有多种活性的嵌合蛋白。搜索数据库以鉴别共享保守序列基序和有相似酶活性的相关酶的方法是本领域普通技术人员所知的。例如，NCBI的网站(www, ncbi. com)提供了保守结构域数据库。例如，如果在该数据库中搜索Endo IV的同源体，可调出74个序列匹配。(连接酶也见图6A-1到6A-9和 6B-1 到 6B-2)。
用在酶混合物中修复受损DNA的“多核苷酸切割酶”特别是指一类修复酶并包括 AP内切核酸酶、糖基化酶和负责碱基切除修复的裂合酶。
受损碱基可由DNA糖基化酶去除，DNA糖基化酶水解脱氧核糖部分与碱基间的 N-糖基键。例如，大肠杆菌糖基化酶，UDG内切核酸酶，修复脱氨基的胞嘧啶，而来自大肠杆菌的两种3-mAde糖基化酶(TagI和TagII)修复烷基化剂引起的破损。
由糖基化酶引起的受损碱基去除得到的产物是必须被正确置换的脱嘌呤或脱嘧啶位点(AP位点)。这可由在与AP位点相邻的糖磷酸盐骨架上形成切口的内切核酸酶完成。该脱碱基的糖被移除并且一个新核苷酸由聚合酶/连接酶活性插入。这些修复酶在原核和真核细胞中发现。在这里具有应用价值的一些酶在一个分子中具有糖基化酶和AP内切核酸酶的活性。脱碱基位点可由AP内切核酸酶和/或AP裂合酶识别并酶切。第II类 AP内切核酸酶在AP位点切割，留下可在多核苷酸聚合时使用的3' 0H。此外，AP内切核酸酶可以移除连接在3' OH上抑制多核苷酸聚合的部分。例如，3'磷酸盐可被大肠杆菌内切核酸酶IV转化为3' OH。AP内切核酸酶可与糖基化酶联合工作。
糖基化酶底物的例子包括尿嘧啶、次黄嘌呤、3-甲基腺嘌呤(3-mAde)、甲酰胺基嘧啶(formamidopyrimidine)、7，8-二氢-8-氧代鸟嘌呤和羟甲基尿嘧啶。DNA中尿嘧啶的存在可因为由硫酸氢盐、亚硝酸或自发脱氨基引起的胞嘧啶错误插入或脱氨基而发生。 次黄嘌呤一般是因为由亚硝酸或自发脱氨基引起的鸟嘌呤脱氨基而发生。在该上下文中， 3-mAde是烷基化剂的产物。甲酰胺基嘧啶(FAPY) (7-mGua)是DNA甲基化试剂的一种常见产物。7，8-二氢-8-氧代鸟嘌呤是鸟嘌呤的一种诱变氧化产物。伽玛辐射产生4，6-二氨基-5-FAPY。羟甲基尿嘧啶由胸腺嘧啶的离子化辐射或氧化破损产生。
这些不同类型的破损可用上述及表1中描述的类型的糖基化酶修复。
另一种修复酶是裂合酶。这种酶可以切断多核苷酸中的磷酸二酯键。
AP内切核酸酶的例子属于4种类型。(I)切割3'端一3' -0H+5 ‘ -P-并且具有相关的糖基化酶活性。(II)切割5'端一3' -0H+5 ‘ -P(III)切割3'端—3' -P+5' -OH(IV)切割 5'端一3' -P+5' -OH
已经分离得到若干显示出具有AP内切核酸酶或裂合酶及糖基化酶活性的酶，它们以协同的方式或顺序的方式协调作用。
目前发现的适合用于提高复制或扩增反应中产率或保真度至少一项的多核苷酸切割酶的例子包括由任何特定生物体或病毒但不限于它们衍生的以下类型的酶1)AP内切核酸酶，如大肠杆菌Endo IV、Tth Endo IV和人类AP内切核酸酶⑵糖基化酶，如UDG、 大肠杆菌AlkA和人类Aag⑶糖基化酶/裂合酶，如大肠杆菌Endo III、大肠杆菌Endo VIII、大肠杆菌Fpg、人类OGGl和T4嘧啶二聚体糖基化酶(T4pdg)；及4)裂合酶，如大肠杆菌 Endo V。
Endo IV(也被称作Exo III)被公知能够在正常反应条件下在数小时内降解多核苷酸中感兴趣的破损区域外多核苷酸的很大一部分，因此未被包含在当前的酶混合物中， 处理受损的多核苷酸。
出于当前目的的“聚合酶”是指具有聚合酶活性的酶，即使它可能具有其它活性。 相同的一种或多种聚合酶可被自始至终用在修复和复制反应中，而不同的聚合酶可被用于该方法的不同阶段。
聚合酶的例子包括热稳定的细菌聚合酶，如Taq DNA和耐热嗜热菌(Thermus thermophilus)聚合酶，及古细菌聚合酶，如Vent 、De印Vent 和Pfu ；对热不太稳定的酶，如Bst聚合酶、Thermomicrobium roseum聚合酶和嗜温聚合酶，如噬菌体聚合酶 (如phU9聚合酶、T7聚合酶和T4聚合酶)、大肠杆菌聚合酶I和大肠杆菌聚合酶II、 Y家族聚合酶，如大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人类聚合酶κ、人类聚合酶 η、SsO Dpo 4、Sac Dbh、See 聚合酶 ζ、人类聚合酶 ι (MacDonald 等，Nucleic Acids Res. 34 :1102-1111(2006) ；Vaisman 等，DNA Repair5 :210(2006) ；Ohmori 等，Mol. Cell. 8 7-8(2001) ；Goodman Ann. Rev. Biochem. 71 :17_5(K2002))，或它们的突变体、衍生物或修饰物。衍生物的例子包括Wmsion 酶(Firmzymes，hpoo，芬兰)和将双链结合蛋白与来自一个或数个来源的聚合酶序列结合起来的其它聚合酶。
用在此处描述的酶混合物中的“连接酶”是指将多核苷酸单链的5'端连接到多核苷酸另一条单链的3'端的酶。这样的连接酶基本上可在所有真核、原核和古细菌细胞中找到，并且也能够在一些细菌噬菌体和病毒中找到。适当的连接酶的例子包括9° N连接酶、 大肠杆菌连接酶、T4连接酶和Taq连接酶。其它连接酶包括LIGA (NP-416906. 1)、Tth DNA LGS (AAA27486. 1)、LIG3 (NM-013975)和 LIG4 (NM-002312)。
在这里可能有利用价值的其它连接酶或类似连接酶的蛋白通过Blast搜索用T4 连接酶或大肠杆菌连接酶搜索数据库而被显示出来(见图6A-1到6A-9和图6B-1及6B-2)， 其中任何与这些已知连接酶共有至少6个连续氨基酸的酶可被包含在依据本发明实施方式的修复混合物中。
与已公开的连接酶与Exo III在不存在任何辅助因子的情况下的使用(美国公开号2005-0026147)相反，这里已经发现在包含连接酶的酶混合物中需要NAD+或ATP。更具体地，Taq连接酶和大肠杆菌连接酶需要NAD+，而T4连接酶和9° N连接酶需要ATP。
某些连接酶、聚合酶和内切核酸酶可从New England Biolabs Inc.，Ipswich, MA 获得，其中2005-2006产品目录的第107-117页被引入作为参考(连接酶在第102-108页)，并且在美国临时申请号60/717，296和国际公开号102005/052124中描述。此外，在预扩增混合物中，热稳定的修复酶可与不耐热的修复酶互换使用。热稳定的酶在高于40°C或更特别地，65 °C或以上的温度中保持活性。
本发明的实施方式提高了由复制多核苷酸序列、扩增或其它合成反应得到的产物的产率或保真度。例如，当受损多核苷酸在预温育混合物和/或扩增过程中被用酶制备物 (一种或多种)处理时，上述目的可以达到。
可以从上述预温育中获益的扩增方案包括聚合酶链反应(PCR)、链置换扩增 (SDA)(美国专利号5，455，166和5，470，723)；解旋酶依赖性扩增(HAD)(美国公开号 2004-0058378-A1)；转录调控的扩增(TMA) (Guatelli 等，Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 1874-1878(1990))；滚环扩增(RCA)，其产生多拷贝的序列，用于从体内滚环DNA复制修改的体外 DNA 扩增中(见，例如，Fire 和 Xu，Proc. Natl. Acad. ki. USA 92:4641-4645(1995)； Liu J. Am. Chem. Soc. 118 :1587-1594(1996) ；Lizardi Nature Genetics 19 225-232(1998))；以及全基因组扩增法(Hawkins 等，Current Opinions in Biotechnology 13 :65-67(2002))。
“通用的”酶混合物现在被发现可用于在反应混合物中在复制或扩增前或复制或扩增过程中一般地修复破损的多核苷酸。按照本实施方式，在给定的情况下也有特定的有利的组合。
所述通用酶混合物包含连接酶和诸如NAD+或ATP的辅助因子。所述混合物优选地额夕卜包括上述在诸如 Thermopol (New England Biolabs, Inc. , Ipswich,MA) ^AccuTaq LA DNA聚合酶缓冲液(Takara Bio Inc.，Shiga,日本)或任何其它常规Taq缓冲液的合适缓冲液中的聚合酶和AP内切核酸酶。在各种示例性的实施方式中，所述通用酶混合物包含大肠杆菌聚合酶I或Taq聚合酶，和AP内切核酸酶诸如嗜温Endo IV，如大肠杆菌内切核酸酶 IV，或嗜热Endo IV，如Tth Endo IV，以及连接酶，其选自大肠杆菌连接酶、Taq连接酶或古细菌连接酶诸如9° N连接酶。在一个特定的实施方式中，所述酶混合物包含1-100单位的Endo IV、0. 05-0. 25单位的大肠杆菌聚合酶I和5-500单位的Taq DNA连接酶，其适合在扩增前或扩增期间中在10-1000 μ L的反应体积中修复I-IOOOng的DNA。应该理解，不同于上述通用混合物中特别说明的，内切核酸酶和聚合酶的浓度范围可随所用酶及反应温度而不同。然而，运用实施例中描述的分析可容易地确定所述浓度范围。例如，XDNA的标准制备物可按照实施例1进行热处理。所述DNA随后可以经受一些列含有连接酶和辅助因子的酶混合物的处理。额外的酶被滴定加入以便确定该酶在混合物中优选的浓度。用这种方法，可以最优化DNA修复。在每个样品扩增后，扩增的DNA的量可以通过凝胶电泳确定，揭示测试酶的优选浓度范围。
所述通用酶混合物可在多核苷酸扩增或其它合成前或期间使用。
如实施例所示，取决于破损的类型，期望用依赖DNA破损性质的额外的修复酶补充所述通用酶混合物。单个修复酶或修复酶混合物的用途可用实施例和附图中所述的分析方法确定，以确定其修复某一特定多核苷酸的适用性。多核苷酸一般和特殊破损的修复(a) 一般破损
确定多核苷酸中破损的性质是很耗费时间的。如果怀疑多核苷酸有某种形式的破损，例如该多核苷酸扩增较差，优选的是不必要去分辨出破损或多个破损。在这些情况下，一种如上所述的通用酶混合物可被用于确定是否获得了改善的扩增。如果使用该通用混合物获得的改善足够，那么不需要进一步的行动。如果改善不足，额外的酶可被加入到这里所述的混合物中，直到获得优选的结果。所述整个分析可在诸如96孔盘的单一反应容器中完成。盘中的每个微孔对不同的酶混合物是可用的，其包括所述通用酶混合物加上被选择以解决下列每类破损的酶。图12 (流程图)和实施例中描述的分析提供了选择用于修复DNA 的一般破损或未知破损的酶的方案。(b)特殊破损(i)AP位点
碱基的缺失是最常见形式的自发DNA破损。聚合酶和基于聚合酶的技术被这些脱碱基位点的存在不利影响。引物延伸反应的效率通过修复多核苷酸中发现的任何脱碱基位点而被提高。在一个实施方式中，这通过在脱碱基位点切割磷酸盐骨架的Endo IV活性实现。这在被切割的脱碱基位点的5'端的DNA片段上留下了可延伸的3' 0H。它也在被切割的脱碱基位点的3'端的DNA片段上留下了脱氧核糖-5'-磷酸盐(dR5P)。聚合酶可以从游离的3' OH段延伸，用正确的核苷酸替代被切割的脱碱基位点。dR5P可被特异性靶向到dR5Ps的酶诸如哺乳动物聚合酶β或哺乳动物聚合酶β的8Kd N-末端部分去除 (Deterding,J Biol Chem275 10463-71 Q000))，被在某些聚合酶诸如大肠杆菌DNA聚合酶 I中存在的flap内切核酸酶活性去除，或被独立的flap内切核酸酶诸如FENI去除。dR5P 的去除也可通过flap内切核酸酶活性在该基团下游切割而发生。dR5P的去除和3' OH相邻的5'磷酸盐生成后，连接酶可以封闭这个切口以完成修复(见实施例1-3)。(ii)修饰的核苷酸(a)胸腺嘧啶二聚体
光照可以通过诱导嘧啶二聚体的形成来破损DNA。嘧啶二聚体阻断由诸如Taq DNA 聚合酶的DNA聚合酶催化的DNA延伸反应，并因此阻止DNA扩增(Wellinger等，Nucleic Acids Res. 24(8) :1578-79 (1996))。因此，理想的是在扩增前或扩增中修复嘧啶二聚体。 这可通过向通用酶混合物中加入嘧啶二聚体糖基化酶/裂合酶(Vande Berg等，J.Biol. Chem. 273(32) :20276-20284 (1998))而完成。DNA骨架在嘧啶二聚体的5 ‘端被酶切，并留下可被DNA聚合酶延伸的3'羟基部分。在某些实施方式中，在3'羟基上的延伸和随后的形成以及接下来切割在DNA延伸期间产生的含破损的flap导致切口的产生，该切口被能够封闭该切口的酶封闭。flap的切割可由延伸性聚合酶，例如大肠杆菌聚合酶I，或由flap 内切核酸酶的作用来完成(Xu，Y等，J.Biol· Chem. 275Q7) =20949-20955(2000) ；Liu，Y等， Annu. Rev. Biochem. 73 =589-615 (2004)) (b)氧化破损，烷基化和脱氨基作用
由于不希望的核苷酸插入受损碱基的对面，错误可被引入DNA扩增反应的产物(Gilbert 等，Am. J. Hum. Gen. 72 :48-61 (2003) ；Hofreiter 等，Nucl. AcidsRes. 29 4793-9(2001)) 0这些错误在扩增、克隆和测序需相同样品多次后可被发现。由于碱基破损导致的错误也可通过在用酶如UDG处理样品前和后比较序列数据来鉴定，其中UDG去除常见类型的突变 DNA 破损中的一种(Hofreiter 等，Nucl. AcidsRes. 29 :4793-9 (2001)) 然而，用UDG处理在DNA中产生脱碱基位点，抑制通过引物延伸的DNA扩增。这可能会在UDG 处理后引起DNA样品难以扩增。然后，该AP位点可被含有连接酶，并且优选地也包括AP内切核酸酶，和聚合酶的反应混合物修复。尿嘧啶的去除使得扩增反应中通常在该位点停止的聚合酶能够继续扩增DNA。例如，Vent 聚合酶活性在含有尿嘧啶的DNA模板上被抑制。 去除尿嘧啶的能力允许聚合酶具有提高的效率。
相反，这里显示了在含有连接酶和聚合酶的混合物中包含UDG能够被成功地用来提高多核苷酸复制或扩增的产物的产率和保真度。实施例12-14提供了多种包含UDG的有益的酶混合物的描述。
作为氧化破损产物的修饰的核苷酸也能够通过Fpg或hOGG从多核苷酸中去除留下阻断的多核苷酸，其中该阻断的多核苷酸可被诸如Endo IV的AP内切核酸酶修复。
复制或扩增前，酶预处理修复多核苷酸氧化破损的效率由实施例9显示，其中复制的多核苷酸产物的提高的保真度用含有连接酶、聚合酶、Endo IV和Fpg的酶混合物显示ο
其它修饰的核苷酸如烷基化碱基或脱氨基碱基——其中胞嘧啶被转化为尿嘧啶、 鸟嘌呤转化为黄嘌呤或腺嘌呤转化为次黄嘌呤，导致错误编码。这些修饰的核苷酸的去除是希望的。这些修饰的碱基可由上面讨论的UDG或由Alka或实施例10中描述的Aag去除。 (iii)交联
其它的核苷酸剪切修复(NER)蛋白(Minko等，Biochemistry44 3000-3009(2005) ；Costa 等，Biochimie 85(11) :1083-1099(2003) ；Sanar, Ann. Rev. Biochem. 65 :43-81(1996))可用于修复由甲醛和体积大的加合物(bulky adduct)产生的破损，以及导致产生形成DNA-蛋白质交联的化学修饰的碱基的破损。大肠杆菌UVrA、UVrB， 突变体 UvrB, UvrC, UvrD 或 Cho 中至少一种(Moolenar 等，Proc. Natl. Acad. Sci USA 99 1467-72(2002))可用于在受损位点周围的5'端和任选的3'端进行剪切。关于这些酶的性质及纯化方案的细节可从hu，Y等，Biochemistry43 =4196-4205(2004)中获得。修复过程可利用DNA聚合酶、DNA连接酶和任选地flap内切核酸酶完成。
如果NER酶(一种或多种)切割DNA但在该DNA中留下抑制引物延伸的加帽3' 末端，则在5'剪切位点产生3'羟基可能是有用的。一个例子是如果NER酶(一种或多种)剪切DNA并留下3'磷酸盐。那么这将不能被已知的DNA聚合酶延伸，除非该3'磷酸盐被例如大肠杆菌内切核酸酶IV去除。
如果所述一种或多种NER酶切割DNA破损的5'和3'端，那么当新释放的寡核苷酸与该DNA分离时，破损被去除。聚合酶可以简单地填充DNA的剪切区域，留下切口，该切口可由连接酶随后封闭以完成修复。在某些情况下，聚合酶可以填充DNA并随后继续置换剩下的DNA链。在这些情况下，带有flapase活性的酶允许形成连接酶可封闭的切口。在一种或多种NER酶仅切割破损的5'端的情况下，聚合酶优选地置换原始的DNA链直到其通过破损部位，在该部位flapase切割DNA flap产生可连接的切口。所述flapase可在到达DNA破损部位前和后具有活性。优选地，聚合酶和flapase活性一直作用直到最终置换并去除DNA破损，留下可连接的切口，因此修复DNA模板。实施例7提供了有关上述方法的效力的例子。(iv)切口、缺口和错配的多核苷酸
DNA骨架中的切口、缺口能够导致截短的引物延伸产物以及由单链区域的不期望的杂交形成嵌合物。异源双链DNA在多模板PCR和均一模板PCR中可能是个问题 (Lowell, J. L. &Klein, D. A. Biotechniques 28 :676-681 (2000) ；Thompson， J. R.等，Nuc 1. Acids Res. 30(9) :2083-2088(2002) ；Smith, J. &Modrich,P. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94: 6847-6850(1997))。例如，嵌合物可以在错配位点形成。
连接酶和聚合酶任选地与包含在通用酶混合物中辨识并切割异源双链位点的酶 (T7Endo I和其突变体)结合的效果导致DNA中切口、缺口、异源双链和嵌合物的修复，因此
16提高了多核苷酸复制和扩增反应的产率及保真度。实施例8显示了如上文所示使用T7Endo I和连接酶的有利效果。T7内切核酸酶或突变体与DNA比例的有用范围可通过在异源双链切割反应中包含DNA连接酶活性以将非特异切割的不良作用减到最小来扩展。该方法不需要 DNA 的量化并且避免了 Lowell 等在 Biotechniques 28 :676-681 (2000)；和 Smith 等在 Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94 :6847-6850 (1997)中要求的 PCR 反应后的额外步骤。
对某些多核苷酸，破损的性质可能已知。作为例子，酶混合物可根据修复特殊破损的上述(b)部分进行选择。当破损未知或来源混合时，可以使用这里描述的包含在实施例中的通用混合物。DNA微阵列
DNA微阵列是用于分析DNA样品强有力的方法(Lipshutz等，CurrOpinion in Structral Biology 4:376-380(1994) ；Kozal 等，Nat Med 2(7) :753-9 (1996))。从受损 DNA的微阵列分析中得到的信息的数量和质量将得益于该受损DNA的首次修复。实施例和附图的讨论
扩增后产物产率的提高被一般性显示和针对特殊来源的破损而显示图1A-1D和 4 (热破损)，2A-2B (柠檬酸盐)，8A-8C (紫外辐射)，12、3、5和17 (DNA、环境DNA、储存的磷虾DNA和洞穴熊DNA的一般破损)和9A-9B (经受不希望的异源双链形成)以及在不同温度下不同温育时间的影响(图13和14)。保真度的提高显示在图10A-10B和11中。图6A-1 到6A-9，6B_1到6B-2提供了与Taq连接酶和T4连接酶序列同源的序列的细节。图7描述了 Tth Endo IV的DNA序列，且图18-1到18-2描述了质粒pNEBO. 920的序列。图15显示了多重片段化DNA可被修复，形成适合扩增产生扩增子的模板。克隆和转化用修复混合物的好处在图15和16中显示。
实施例1和图1A-1D显示了当模板DNA被破损超过了某一破损阈值时(如，约90 秒热处理)，从PCR扩增中得到的扩增子的产率被显著地负面影响(见图1A)。这种破损对扩增的影响可以被逆转，并且扩增子产率可通过将DNA与酶混合物在扩增前温育而提高 (见图1B、1C和1D)。此外，如果假定的“未破损”的DNA扩增子产率可通过加入所述的酶混合物而提高，那么实际上，该DNA被认为是已经破损的。
实施例1显示了酶混合物对DNA扩增的影响不依赖于单一类型的AP内切核酸酶或连接酶，而是相反地，来自多个可选来源的内切核酸酶或连接酶可以被使用。例如，热稳定的Tth Endo IV被发现与大肠杆菌内切核酸酶IV—样有效，并且大肠杆菌连接酶与热稳定的Taq连接酶一样有效。
实施例2和图2A-2B显示了另一种类型的DNA破损——脱嘌呤对扩增产率的负效应，其中脱嘌呤是由低PH值的存在引起的。而且，该实施例显示了酶混合物对DNA扩增的影响不依赖于单一类型的聚合酶，而是相反，多种可选来源的聚合酶可以被使用。例如，大肠杆菌聚合酶I可以被Taq DNA聚合酶或Taq和Vent DNA聚合酶的混合物替代，以产生
提高的产率。
实施例3和图3显示了扩增产率的提高可在短(200bp)片段中观察到。实际上， 扩增产率的提高应该能在从短至100个碱基到长至1001Λ的宽范围的DNA模板大小中观察到，并且应该相信甚至大于1001Λ的DNA扩增产率可以达到。
图3也显示了即使当DNA以粗物质形式储存(例如，在生物体的细胞内自身储存) 被破损时，通过扩增前加入酶混合物，扩增产率明显提高。尽管所述酶混合物在扩增前加入到模板DNA中，但是当模板DNA用热稳定等效物的酶混合物在扩增或预扩增步骤中温育时， 可见相似的产率效果。
实施例4和图4显示了单独的连接酶可提高扩增子产率，但是加入AP内切核酸酶进一步提高了产率。当连接酶、AP内切核酸酶和DNA聚合酶在扩增前被使用时，在本实施例中观察到最佳结果。而且，该实施例显示修复不依赖于DNA的大小。例如，对51Λ和101Λ 扩增子可获得相似的结果。
实施例5和图5显示了使用连接酶从扩增中可达到提高的产率，所述连接酶可能是依赖NAD+或依赖ATP的酶，也显示了这种效果可在不限于单一来源的连接酶的情况下达到。图5显示了即使在预温育混合物中没有额外的酶使用时，Taq连接酶和T4连接酶在提高扩增产率上都有效。如果所述连接酶被加入到扩增混合物(如果是热稳定的)中，这种效果也被认为会产生。图5也显示了在扩增从在自然界中暴露于多种破损性试剂的土壤样品中直接获得的环境DNA时，该方法的优点。
图6A-1到6A-9，6B_1和6B_2和7是通用酶混合物中使用的酶或编码酶的序列的描述，通用酶混合物被这样命名是因为它可以在没有关于破损本身的特殊知识的情况下， 广泛地应用于受损多核苷酸。尽管所述实施例是指DNA，多核苷酸的扩增或复制被更一般地设想。总之，即使在所有情况下没有被明确表述，扩增被发现有所改善的情况一般地也适用于增强多核苷酸的复制。
这里引用的所有参考文献，以及2005年10月20日提交的美国申请序列号 11/255，290和2004年10月21日提交的美国临时申请序列号60/620，896，2005年1月24 日提交的60/646，7 和2005年4月21日提交的60/673，925，被引入作为参考。实施例实施例1 提高由热处理破坏的DNA的扩增子产率
开发出一种最优化所选试剂的使用以在扩增前修复DNA的试验。各种程度热破损的产生
由热处理引起不同数量的DNA破损。这可用以下方式达至IJ 100μ LADNA(NEB#N3011,New England Biolabs，Inc.，Ipswich, ΜΑ)以 0. 5mg/ml 被等份加入到不同的试管中，在PE2700热循环仪中分别进行99°C热处理30秒、60秒、90秒、120秒和180秒。一份样品被用作没有预处理的扩增模板。
余下的受损DNA用酶混合物如下预处理受损DNA模板在室温下在下列混合物中温育10分钟
DNA(5ng、2ng 禾口 Ing)；
100 μ M dNTPs(NEB#M0447，New England Biolabs, Inc. ， Ipswich, MA)；
ImM NAD+(Sigma#N_7004，Sigma，St Louis, M0)；
80 ^itL Taq 3 (NEB#M0208， New England Biolabs, Inc. ， Ipswich, MA) 40-100单位大肠杆菌连接酶(NEB#M0205S)；
0. 1 单位大肠杆菌 DNA 聚合酶 I (E. coli poll, NEB#M0209, New EnglandBiolabs, Inc. , Ipswich, MA)；
10 单位大肠杆菌 Endo IV (NEB#M0304, New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA) 或 10 单位 Tth Endo IV ；
IXThermopol 缓7中液(NEB#B9004，New England Biolabs, Inc. ，Ipswich, MA)到96 μ L的终体积。
反应结束时，样品被转移到冰上并随后扩增。DNA扩增反应
λ DNA的扩增用以下引物按照Wang等Nucl. Acids Res. 32 1197-1207(2004)的方法进行:CGAACGTCGCGCAGAGAAACAGG (L72-5R) (SEQ ID NO 1)和 CCTGCTCTGCCGCTTCACGC(L30350F)(SEQ ID NO 2)
4μ1扩增混合物被加入到96μ1上述修复混合物中。所述扩增混合物在 IXThermopol 缓冲液中含有 100 μ M dNTPs，5 单位 Taq DNA 聚合酶，0. 1 单位 Vent (exo+) DNA 聚合酶，5 X 1(Γ"Μ 引物 L72-5R 和 5 X 1(Γ"Μ 引物 L30350F。
为了修正任何酶储存缓冲液的效应，当一种修复酶被从反应中省略时，适当量的其储存缓冲液被加入到反应中。在所有情况下，扩增反应用以下参数在热循环仪中进行 95°C下20秒一个循环，接着是94°C下5秒、然后72°C下5分钟25个循环。被扩增的扩增子的大小为51Λ。
DNA(5kb)扩增的结果通过1 %琼脂糖凝胶电泳确定。6X加样染料(分子克隆实验室手册，第三版，Sambrook和Russell编辑，冷泉港出版社，冷泉港，NY，2001，第5. 4-5. 17 页(Molecular Cloning :A Laboratory Manual,3rd ed. ,eds. Sambrook and Russell,Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor，NY，2001，pp. 5. 4-5. 17)被加入到 100 μ 1 扩增反应物中。20 μ 1该溶液与作为大小标准的2-log梯度(NEB#N3200，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA) 一起被点样到琼脂糖凝胶上。
每种样品的扩增DNA的量通过凝胶电泳进行比较，并且结果显示于图IA-D中。当样品在热处理后但扩增前用酶混合物处理时，获得明显提高的扩增产率(图1B、1C和1D)。 实施例2 用酶混合物预处理后，具有低pH诱导的脱碱基位点的DNA提高的扩增子产率由脱碱基位点造成的各种程度损伤的产生
为了分析受损DNA修复的程度，首先用酸性PH引起不同数量的DNA损伤。这通过以下方式达到
DNA 用 Ide，H.等在 Biochemistry 32(32) :8276-83(1993)中描述的方法脱嘌呤。 ADNA(NEB#N3011,New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA)用乙醇沉淀。该 DNA 以 0. 5mg/ ml的浓度重悬浮在脱嘌呤缓冲液(IOOmM NaCl，IOmM柠檬酸盐，pH5)中，并在70°C温育0、 20、40、80、120和160分钟。随后该样品用乙醇沉淀并重悬浮在0. OlM Tris, 0. 001M EDTA, PH8. 0的溶液中。用缓冲液对照校准后，DNA浓度通过测量含DNA溶液的A26tl而确定。DNA 用酶混合物预处理
受损DNA在室温下在下述混合物中温育10分钟
DNA (120 分钟低 pH 处理后的 2. 5ng 的受损 DNA) ； 100 μ M dNTPs ； ImM NAD+ ；80 单位 Taq连接酶；0. 1单位Taq DNA聚合酶或0. 1单位大肠杆菌聚合酶I (NEB#M0209，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)或 0· 1 单位 Taq :0. 002 单位 Vent 聚合酶(NEB#M0254，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA) ；10 单位大肠杆菌内切核酸酶 IV ；IXThermopol 缓冲液到终体积96 μ 1。
上述混合物在室温下温育10分钟并随后在扩增前转移到冰上。DNA扩增反应
扩增如实施例1所述进行，以产生51Λ扩增子。通过用酶混合物处理含脱碱基位点的λ DNA，相比阴性对照扩增子产率增加(图2Α)。使用不同酶混合物进行一系列预处理的结果显示于图2B。所述酶混合物随聚合酶而变化(大肠杆菌聚合酶I或Taq Vent )。 实施例3 从在防腐剂中储存后的完整生物体中提取的DNA提高的扩增子产率
如Bucklin，A 和 Allen，L.D.，Mol. Phylogenet. Evol. 30(3) :879-882(2004)中所述，从北方磷虾(Meganyctiphanes norvegica) (krill)分离基因组DNA。所述磷虾储存在乙醇中约5年。
由酶混合物对磷虾DNA的预处理按如下进行50ng北方磷虾基因组DNA ；100 μ M dNTPs ；ImM NAD+ ；40 单位 Taq 连接酶；0. 5 单位 Taq DNA 聚合酶，0. 2 单位 Vent (exo+) DNA聚合酶，或含有0. 05单位Taq DNA聚合酶和0. 001单位Vent (exo+)的Taq Vent (exo+)混合物；10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ；IXThermopol缓冲液到终体积96 μ 1。
在进行扩增步骤前，该反应在室温下温育15分钟。DNA扩增反应
如 Bucklin， A 禾口 Allen， L. D. ， Mol. Phylogenet. Evol. 30(3) 879-882 (2004)所述，对应于52F和233R的扩增引物产生200bp的扩增子。52F TTTTTAGCAATACACTACACAGCAA(SEQ ID NO :3) 233R :ATTACGCCAATCGATCACG (SEQ ID NO 4)
引物以0. 5μΜ的终浓度加入，并且每种dNTP的终浓度为200μΜ。1 μ 150 1的 Taq Vent 混合物(5单位Taq DNA聚合酶和0. 1单位Vent (exo+)DNA聚合酶被加入到反应中)随后被加入到每个反应中到终体积100 μ L。
对于对照反应(第1泳道)，没有加入Endo IV、Taq连接酶和预处理聚合酶。体积被相应调整。在修复酶被省略的反应中，适当体积的酶储存缓冲液被加入对照，以获得缓冲液效应。
循环条件如下94°C下30秒，52 °C下30秒和72 °C下1分40秒40个循环。25 μ L (反应物的四分之一)被制备，点样到琼脂糖凝胶上，电泳，并如上文所述观察。
用上述酶混合物预温育样品后，观察到磷虾基因组DNA提高的扩增子产率(图3)。 实施例4 来自热破损DNA的大(101Λ)扩增子提高的产率
如实施例1所述制备热破损DNA。λ DNA在99°C加热180秒。
用酶混合物对受损DNA的预处理如下进行λ DNA (1 μ g的180秒热处理的DNA)； 100 μ M dNTPs ； ImM NAD+ ；80单位Taq连接酶；0. 1单位大肠杆菌聚合酶I ； 100单位大肠杆菌内切核酸酶IV ； IX Thermopol缓冲液到体积96 μ L。
所述混合物在扩增前温育10分钟。
DNA扩增按实施例1所述进行，除了下面特别说明的。引物被加入到上述96 μ 1预温育混合物中。引物 L71-10R (序列 GCACAGAAGCTATTATGCGTCCCCAGG) (SEQ ID NO 5)代替了实施例 1 中的 L72-5R。iCycler 的热循环仪程序(Bio-Rad,Hercules,CA)是95°C下 20 秒1个循环，95 °C下5秒、72°C下10分钟25个循环，和随后的72°C下10分钟1个循环。扩增子大小为101Λ。
DNA如实施例1所述进行观察，除了以下例外。20 μ 1的6X加样缓冲液被加入到 100 μ 1扩增反应物中。10 μ 1的该溶液用水和1 X加样缓冲液稀释到100 μ 1。20 μ 1的该溶液被点样到每条泳道中。该凝胶为0.8%的琼脂糖凝胶。结果显示于图4中。实施例5: 来自环境DNA(从土壤样品中提取)的DNA的改善的扩增产率
使用从MoBio Laboratories, Inc.，Carlsbad, CA 购买的超净土壤 DNA 试剂盒 (UltraClean Soil DNAKit)(目录号U800-50)从土壤中分离环境DNA。用连接酶预处理DNA
含有从土壤中分离的0. 6 μ g环境DNA和下述(a)和(b)中两种连接酶中的一种的100 μ 1终体积形成反应混合物。该反应混合物随后在室温下温育15分钟。
(a) IX Taq 连接酶缓冲液(New England Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ)和 80 单位 Taq连接酶。
(b) 1ΧΤ4 连接酶缓冲液(New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)和 800 单位 Τ4 连接酶(NEB#M0202，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)。
1 μ 1反应混合物用在下述扩增反应中。DNA扩增反应
用下述引物进行DNA 扩增反应:GGGGGXAGAGTTTGATCMTGGCTCA (SEQ ID NO 6)和 G GGGGXTACGGYTACCTTGTTACGACTT (SEQ ID NO :7) (M = C 或 A ;Y = C 或 T ;X = 8-氧代-鸟嘌呤)。这些引物靶向具有1. 6kb扩增子大小的16S rRNA。
所述50 μ 1反应物含有IOpmol的每种引物，1 μ 1修复的环境DNA, 200 μ M dNTPs, 1 X Thermopol缓冲液和1. 25单位Taq DNA聚合酶。用以下循环参数进行扩增94°C下5分钟1个循环，94°C下30秒、55°C下1分钟、72 °C下1分40秒32个循环，随后72°C下5分钟 1个循环。
按照实施例1所述进行凝胶电泳。结果显示于图5。实施例6 紫外光破损的DNA 的提高的扩增子产率
为了确定分析DNA 修复有效性的条件，50 μ g λ DNA (ΝΕΒ#Ν3011，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)在 TE 缓冲液(IOmM Tris-HCl, ImMEDTA, ρΗ7· 5)中稀释到 50 μ g/ml的浓度，并用36J/m2的紫外光辐射0、10、20、30、40和50秒。
受损DNA的预处理用酶混合物按照如下进行
所述受损DNA在室温下在下述混合物中温育15分钟DNA (50ng损伤0、10、20、30、 40或50秒的ADNA) ；200 μ M dNTPs ； ImM NAD+ ；400单位Taq连接酶；0. 1单位大肠杆菌DNA 聚合酶I ；10单位大肠杆菌Endo IV ;80单位或10单位T4PDG(也称作T4Endo V) (Trevigen, Gaithersburg, MD) ；IX Thermopol 缓冲液用水调整体积到 50 μ 1。
15分钟温育后，这50 μ 1反应混合物被加入到50 μ 1扩增溶液中。所述扩增溶液含有40pmol每种引物(如实施例1所述的L72-5R和L30350F或L72_2R(其DNA序列为 CCATGATTCAGTGTGCCCGTCTGG) (SEQ ID NO :8))，1 X Thermopol 缓冲液，ImM NAD+, 200 μ M dNTPs，2. 5 单位 Taq DNA 聚合酶(NEB#M0267，New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA)和水到终体积50 μ L。将50 μ L修复反应物与50 μ 1扩增溶液混合得到终体积100 μ 1。
这100 μ 1溶液被放入热循环仪中。对于L72-5R和L30350F引物组合94°C下5 分钟1个循环；94°C下30秒，58°C下60秒，和72°C下4分钟30个循环；72°C下5分钟1个循环。对于L72-2R和L30350F引物组合94°C下5分钟1个循环；94°C下30秒，58°C下60 秒，和72°C下2分钟30个循环；72°C下5分钟1个循环。
扩增产物的存在与否用溴化乙锭在1. 8%的琼脂糖凝胶上观察。任意条带的大小与含有 2-log 梯度(NEB#N3200S，New England Biolabs, Inc. , Ipswich, MA)大小标准的泳道比较。结果显示于图8。实施例7 使用核苷酸剪切修复蛋白UvrA、UvrB和UvrC得到DNA 的提高的扩增子产率
用含有涉及核苷酸剪切修复的蛋白质的酶混合物预温育样品后，确定磷虾基因组DNA的提高的扩增子产率。
储存DNA用酶混合物的预处理如下进行
储存DNA在下列混合物中在4-37°C温育1-180分钟DNA :50ng北方磷虾基因组DNA; 100 μ M dNTPs ；ImM ATP ;400单位Taq连接酶；0. 1单位大肠杆菌聚合酶I ； IOnM 大肠杆菌UvrA，250nM大肠杆菌UvrB (或突变体UvrB*)，有或无50nM大肠杆菌UvrC ； IXThermopol缓冲液到终体积96 μ 1。*对于UvrB突变体，参见hu，Y.等，Biochemistry 43 :4196-4205(2004)。
DNA扩增反应按照实施例3所述进行。实施例8 通过异源双链的酶切手段去除至少一条链上的错误核苷酸后，提高的DNA序列准确性实验条件
A.向T7Endo I中加入Taq连接酶被显示在DNA制备物中允许使用提高浓度的 T7Endo I，而没有随机降解DNA。
该试验依赖于用增加量的T7Endo I处理含有十字形结构的超螺旋DNA。
0、1.6、3.1、6.2、12. 5、25、50、100、200 或 400 单位的 T7Endo I(NEB#M0302, England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)被力口入至Ij 含有 1 μ g 的 pUC(AT) (Guan, C.等， Biochemistry 43:4313—4322(2004))禾口 IXNEBuffer 2 (NEB#B7002S，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)的 50 μ 1 反应物中。质粒 pAT25tetA 可被用来代替 pUC (AT) (Parkinson, Μ. J. &Lilley, D. Μ. J. Mol. Biol. 270 169-178 (1997)和 Bowater, R. P.，et. al. Biochemistry 33 :9266-9275 (1994)) 0另一组反应同时建立并使用与上述相同的组分，并添加 ImM NAD+(Sigma 目录号 N-7004，Sigma, St. Louis, MO)和 100 单位 Taq 连接酶(使用浓度为 IOOu/μ 1 的 ΝΕΒ#Μ0208 的原液，NewEngland Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)。所有的反应均在37°C温育60分钟。
结果通过将所述反应物在0. 9%的TBE琼脂糖凝胶上跑胶，用溴化乙锭染色并用紫外光观察来分析(见图9A和9B)。在没有T7Endo I存在的情况下，pUC (AT)质粒在凝胶上产生2条带，对应于超螺旋形式(下方条带)和松弛环状形式(上方条带)。
T7Endo I将超螺旋的pUC (AT)解成松弛环状形式和跑在超螺旋和松弛环状形式中间的线状形式。在某种T7Endo I DNA的比例下，产生弥散，表示T7Endo I通过非特异性酶活性降解了 DNA。Taq连接酶的存在显著地增加了可用的T7Endo I与DNA的比例。该比例通过用国际公开号WO 2005/052124中描述的突变的T7Endo I替代T7Endo I而进一步提尚°
B.应用方法A，以从PCR反应物中去除异源双链。
从土壤中分离DNA以及所述纯化DNA的扩增按照实施例5进行，并任选地添加5 单位T7Endo I或其突变体。当加入T7Endo I或其突变体时，增加额外的扩增循环(37°C下 15分钟1个循环)。最后一步是允许T7内切核酸酶剪切形成的任意异源双链。
按照实施例1所述进行凝胶电泳。异源双链DNA按照Lowell，J. L.和Klein， D. A. Biotechniques 28 =676-681(2000)的描述在凝胶上观察。在T7Endo I或其突变体存在的情况下没有异源双链DNA的存在显示了 T7Endo I或其突变体与连接酶的效力。
单位定义随此处引用的每一种酶的产品描述在NEB目录，NewEngland Biolabs, Inc.，Ipswich, MA中描述。例如，T7Endo I或其突变体的单位定义是在50 μ 1的反应体积中，在37°C下1小时中，将超过90 %的1 μ g超螺旋质粒转化为超过90 %的线性DNA需要酶的量。
在连接酶存在时，T7Endo I DNA的比例可以增大，而不增加DNA非特异性切割。 实施例9 氧化破损后DNA扩增反应提高的序列准确性产生具有氧化破损的DNA
进行氧化破损的DNA 是 pffB407(Kermekchiev, Μ. B.等，Nucl. AcidsRes. 31 6139-47(2003))。该破损是使用甲基蓝(MB)和可见光的组合如前所述产生的(Sattler等， Arch. Biochem. Biophys. 376(1) 26-3 (2000)) 质粒 DNA QOO μ g/ml，在蒸馏水中)被点样在拉伸的封口膜(parafilm stretches)上(每滴50 μ 1)。MB被加到液滴中至终浓度为0 到50(0、3、6、12. 5、25和50) yg/mK终体积ΙΟΟμΙ)的范围。带有这些拉伸封口膜的盘被置于冰上并用1 X IOOff的灯照射8分钟。该MB-光-处理的DNA被沉淀、干燥并随后重悬浮在50 μ 1的TE缓冲液(ρΗ 8. 0)中。通过^Onm的吸光度确定最终的DNA浓度。DNA扩增条件
含有IacZ 基因的 pWB407 的部分用引物 316-138，TGTCGATCAGGATGATCTGGACGAAGA GC(SEQ ID NO :9)，和 316-137，CGAAAGCTTTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGA(SEQ ID NO 10)扩增。引物316-138和316-137分别基于前述引物Kfd-四和H;3Bla34(Kermekchiev，M. B.等， Nucl. Acids Res. 31 :6139-47 (2003)) 该 100 μ 1 PCR 反应物含有 10 或 50ng 的模板 DNA， 如果合适指出，和40皮摩尔每种引物。所用循环条件随用于扩增的热稳定聚合酶而变化。
当使用 Taq DNA 聚合酶(NEB 目录号 M0267S，New England Biolabs, Inc.， Ipswich,ΜΑ)时，循环条件有初始的94°C下5分钟1个循环的变性步骤，随后94°C下30秒、 58°C下60秒和72°C下3分30秒进行30个循环，以及最终72°C下5分钟。
当使用 Phusion DNA 聚合酶(NEB 目录号 F-530S，New EnglandBiolabs, Inc.， Ipswich,ΜΑ)时，循环条件有初始的98°C下30秒1个循环的变性步骤，随后98°C下10秒、 62°C下30秒和72°C下1分30秒进行30个循环，以及最终72°C下5分钟。
该反应的结果通过在1. 6%琼脂糖凝胶上加样25 μ L反应物，准备，电泳并且如上述观察进行分析。所用标记物是2-log DNA梯度(NEB目录号M3200S，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ)。扩增准确度的确定
从pWB407模板进行DNA扩增的准确度按照Barnes等，Genel 12 :29-35 (1992)和 Kermekchiev 等，Nucl. Acids Res. 31 :6139-47(2003)所述确定。含有 IacZ 基因的扩增子从经受不同量的氧化破损的质粒PWB407产生。所述氧化破损按上文所述使用甲基蓝进行。PCR反应按上文所述使用50ng模板进行。循环后，10单位的限制性内切核酸酶， Dpnl，被加入到每份IOOyL PCR反应物中并在37°C温育2小时。该步骤消除了初始的模板质粒。接着，所得的扩增产物用酚/氯仿萃取并用异丙醇沉淀(Molecular Cloning =A Laboratory Manual,3rd ed. , eds. Sambrook and Russell, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY, 2001，pp. 6. 25，A8. 12-A8. 24)。沉淀产物在水中重悬浮并用制造商(New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)推荐的条件使用限制性内切核酸酶StyI和 HindIII切割。该DNA消化反应通过加热到65°C 20分钟使HindIII和MyI酶失活而停止。该限制性消化产物用microcon YM-100柱(Millipore, Billerica, MA)纯化以去除短的DNA片段。
总体积50 μ 1的修复反应混合物含有10或50ng的pWB407扩增子+/-甲基蓝温育。所述修复反应物含有 20mM Tris-HCl (25°C下 ρΗ8· 8)，IOmM KCl, IOmM(NH4)2SO4, 2mMMgSO4,0. 1% Triton X-100, ImM NAD+，200 μ M dNTPs(dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP)和各种修复酶混合物。
以50 μ L的总体积分别使用或以多种组合使用的修复酶混合物是0. 4单位Fpg， NEB 目录号 M0240S，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, ΜΑ) ；200 单位 Taq 连接酶；0. 1 单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ； ImM NAD+； 100 μ M dNTPs ； IXThermopol 缓冲液。
所述反应在25°C温育15分钟。温育后，50 μ L的PCR混合物(20mMTris-HCl (25°C 时 pH8.8)，10mM KCl，IOmM(NH4)2SO4, 2mM MgSO4,0.1 % TritonX-100, ImM NAD+, 200 μ M dNTPs (dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP)以及 2· 5 单位 iTaq DNA 聚合酶(NEB 目录号 M0267S，New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA)或 1 单位 Phusion DNA 聚合酶被加入到 50 μ L 修复反应物中，并且该新溶液经受PCR的热循环条件。从这些反应中得到的扩增子按照上面对其它扩增子所述进行纯化和限制性酶消化。
该扩增子被克隆进pWB407质粒中。质粒pWB407通过用限制性内切核酸酶MyI和 HindIII消化，随后与1单位/ μ g南极磷酸酶(antarctic phosphatase)的DNA(NEB目录号 M0289S，New England Biolabs, Inc.，Ipswich,MA)在 37°C温育 30 分钟而制备。去磷酸化的pWB407载体骨架通过琼脂糖凝胶电泳纯化。用QIAquick凝胶提取试剂盒^jIAquick Gel Extraction Kit) (Qiagen, Valencia, CA)进行凝胶提取。
在30 μ L反应体系中用大约0. 1 μ g载体DNA和大约0. 5 μ g扩增子将消化的扩增子连接到制备的PWB407质粒中。按照制造商推荐的条件(New EnglandBiolabs, Inc., Ipswich,ΜΑ)用Τ4连接酶进行连接。连接产物被电转化进大肠杆菌菌株WB441中(Barnes， W. Gene 112 :29-35 (1992)) 所用的选择指示平板(selectiveindicator plate)是含有 50 μ g/ml氨苄青霉素和80 μ g/ml Xgal的LB平板。铺平板前，细菌在营养丰富的培养基中37°C培养1小时，以允许氨苄青霉素抗性的表达。缺少连接酶处理的对照转化产生零菌落。在37°C下一天后，和25°C下一或两天后，对蓝色菌落记分。结果显示于图10A-10B和 11中。实施例10 提高脱氨基破损后DNA扩增反应的序列准确度产生脱氨基DNA
进行脱氨基的DNA 是 pWB407 (Kermekchiev 等，Nucl. Acids Res. 31 6139-6147(2003))。该破损按照 Yan，W.等在 J. Virol. 77 (4) =2640-50(2003)中的描述用亚硝酸的随机诱变引发。亚硝酸可以将DNA的鸟嘌呤脱氨基为黄嘌呤，胞嘧啶脱氨基为尿嘧啶，以及将腺嘌呤脱氨基为次黄嘌呤。
质粒DNA(aiig)用pH4. 6的IM醋酸盐缓冲液中的0. 7M NaNO2处理。该反应通过加入4倍体积冰冷的IM Tris-HCl (pH7. 9)在不同的时间点终止。该质粒DNA用乙醇沉淀， 干燥并随后重悬浮在100 μ L的TE缓冲液中。预处理反应物以修复脱氨基的碱基
以50 μ L的总体积分别使用或以多种组合使用的修复酶混合物是
(a) 1 单位人 Aag，New England Biolabs, he.，Ipswich, MA ;2 单位 Endo III (NEB 目录号 M0268S)，New England Biolabs, Inc. , Ipswich，MA ;2 单位 Endo V(NEB 目录号 M0305S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；2 单位 UDG (NEB 目录号 M0280S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；200 单位 Taq 连接酶；0. 1 单位大肠杆菌 DNA 聚合酶 I ；10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ；ImM NAD+ ；100 μ M dNTPs ；IXThermopol缓冲液。
(b) 2 单位 Endo V (NEB 目录号 M0305S)，New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA ；2 单位 UDG(NEB 目录号 M0280S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；200 单位 Taq DNA连接酶；0. 1单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ； ImM NAD+ ； 100 μ M dNTPs ；IXThermopol 缓冲液。
(c) 2 单位 Endo V (NEB 目录号 M0305S)，New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA ； 200单位Taq连接酶；0. 1单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ； ImM NAD+ ； 100 μ M dNTPs ； 1 X Thermopol 缓冲液。
(d) 1 单位人 Aag，New England Biolabs, he.，Ipswich, MA ;2 单位 Endo III (NEB 目录号 M0268S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；200 单位 Taq 连接酶；0. 1 单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ；ImM NAD+； 100 μ M dNTPs ； IXThermopol 缓冲液。
(e) 1 单位人 Aag，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；2 单位 UDG (NEB 目录号 M0280S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA ；200 单位 Taq 连接酶；0. 1 单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ；ImM NAD+ ； 100 μ M dNTPs ；IXThermopol 缓冲液。
(f) 1 单位人 Aag，New England Biolabs, Inc. ,Ipswich,MA ；2 单位 Endo V (NEB 目录号M0305S)，New England Biolabs, Inc.，Ipswich，MA ;200 单位Taq连接酶；0. 1 单位大肠杆菌DNA聚合酶I ； 10单位大肠杆菌内切核酸酶IV ；ImM NAD+ ； 100 μ M dNTPs ；IXThermopol 缓冲液。
扩增反应条件和扩增准确度的测定按照实施例9所述进行。实施例11 单位定义嗜热连接酶的单位
一个单位定义为在50 μ 1总反应体积中，Iyg BstE II消化的XDNA在45°C下15 分钟内产生50%连接所需的酶量。Taq连接酶可从New England Biolabs, Inc. ,Ipswich, MA获得。嗜温连接酶的单位
一个单位定义为在20μ 1总反应体积中，HindIII酶切的XDNA(0. 12μΜ的 5' DNA末端浓度，300 μ g/ml)在16°C下30分钟内产生50%连接所需的酶量。大肠杆菌连接酶可从New England Biolabs, Inc.，Ipswich，MA获得。AP内切核酸酶的单位
一个单位定义为在10 μ 1总反应体积中，在37°C下1小时内切割Ipmol含有单一 AP位点的34-聚体寡核苷酸双链体所需的酶量。嗜温聚合酶的单位
一个单位定义为在50μ 1总反应体积中，在37°C下30分钟内，用33μΜ包含 [3H]-dTTP的dNIPs和70 μ g/ml变性的鲱鱼精DNA将IOnmol的dNTP插入不溶于酸的物质所需的酶量。嗜热聚合酶的单位
一个单位定义为在50μ1总反应体积中，在75°C下30分钟内，用200μΜ包含 [3H]-dTTP的dNIPs和200 μ g/ml被激活的小牛胸腺DNA将IOnmol的dNTP插入不溶于酸的物质所需的酶量。嗜热的聚合酶——Taq聚合酶和古细菌聚合酶可从New England Biolabs, Inc. , Ipswich, MA 获得。
嗜热的UDG、Fpg、Endo III和Endo VIII的单位定义与所列嗜温等同物(NEB目录，New England Biolabs, Inc.，Ipswich, MA)的单位定义相同。
权利要求
1.克隆或测序多核苷酸片段的方法，其包括利用包含用于与多核苷酸温育的有效量的NAD+连接酶、聚合酶和不包括Endo VI的AP 内切核酸酶的组合物修复所述多核苷酸片段中的序列错误；和克隆或测序所述多核苷酸片段。
2.根据权利要求
1所述的方法，其中所述NAD+连接酶是热稳定的连接酶。
3.根据权利要求
1所述的方法，其中所述NAD+连接酶是大肠杆菌(E.coli)连接酶或 Taq连接酶。
4.根据权利要求
1所述的方法，其中所述组合物能够补平所述多核苷酸片段的末端， 以便克隆进载体中。
5.提高复制或扩增的多核苷酸产率的方法，其包括(a)至少获得第一对和第二对引物，其中所述第二对引物在与所述多核苷酸杂交时是嵌套在所述第一对引物中的；(b)使所述多核苷酸经受包含用于与多核苷酸温育的有效量的NAD+连接酶、聚合酶和不包括Endo VI的AP内切核酸酶的组合物，以便与不存在所述组合物的情况下复制的多核苷酸相比，提供复制多核苷酸的产率和保真度中至少一项的提高；(c)用所述第一对引物扩增所述多核苷酸；(d)用所述第二对引物扩增步骤(c)的产物；和(e)获得扩增的多核苷酸的提高的产率。
6.根据权利要求
1或5所述的方法，其中所述组合物另外包括pdg、Fpg和任选地UDG， 并且其中所述AP内切核酸酶包括内切核酸酶IV、内切核酸酶VIII。
7.根据权利要求
6所述的方法，其中所述NAD+连接酶是TaqDNA连接酶，所述聚合酶是大肠杆菌聚合酶I，所述PDG是"Γ4 pdg，并且所述Endo IV.Endo VIII、Fpg和任选地UDG 从大肠杆菌中获得。
8.多核苷酸测序的方法，其包括(a)将所述多核苷酸与包含有效量的NAD+连接酶、聚合酶和不包括EndoVI的AP内切核酸酶的组合物接触；和(b)对所述多核苷酸测序。
9.复制或扩增片段化的DNA的方法，其包括(a)将所述片段化的DNA与包含用于与多核苷酸温育的有效量的NAD+连接酶、聚合酶和不包括Endo VI的AP内切核酸酶的组合物接触，以便与不存在所述组合物的情况下复制的多核苷酸相比，提供复制多核苷酸的产率和保真度中至少一项的提高；(b)任选地加入重组的感受态蛋白；和(c)扩增或复制所述片段化的DNA。
10.根据权利要求
9所述的方法，其中所述重组感受态蛋白是RecA或β蛋白。
11.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含Τ7Endo I 或其突变体。
12.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含聚合酶和至少一种AP内切核酸酶。
13.根据权利要求
12所述的方法，其中所述至少一种AP内切核酸酶是大肠杆菌EndoIV。
14.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述聚合酶选自Taq聚合酶、大肠杆菌聚合酶和古细菌聚合酶或其突变体。
15.根据权利要求
14所述的方法，其中所述古细菌聚合酶选自Pfu、Vent 、De印Vent 、 9° North、KOD 或 Pwo 聚合酶。
16.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述聚合酶是Y聚合酶家族的成员。
17.根据权利要求
12所述的方法，其中所述聚合酶选自大肠杆菌聚合酶IV、大肠杆菌聚合酶V、人聚合酶κ、人聚合酶η、Sso Dpo4, Sac DWu See聚合酶ζ和人聚合酶ι。
18.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含Τ4嘧啶二聚体糖基化酶。
19.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含 [fapy]-DNA 糖基化酶(Fpg)。
20.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含UvrA、 UvrB, UvrC, UvrD 和 Cho 中的至少一种。
21.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含EndoVIII、 Endo V或Endo III中的至少一种。
22.根据权利要求
1、5、8或9所述的方法，其中所述反应混合物进一步包含UDG和Aag。
23.根据权利要求
5所述的方法，其中扩增通过选自PCR扩增、解旋酶依赖性扩增、链置换扩增、滚环扩增和全基因组扩增的方法进行。
24.根据权利要求
5所述的方法，其中所述多核苷酸是RNA，所述扩增是RT-扩增。
专利摘要
提供了修复多核苷酸的方法及组合物，以便其能够在，例如扩增反应中，以提高的保真度和/或产率被复制。这涉及包含连接酶和选自NAD+或ATP的辅助因子的反应混合物的使用，以及在没有内切核酸酶VI存在的情况下将所述多核苷酸与所述反应混合物温育。所述反应混合物可能进一步包含AP内切核酸酶和聚合酶。如果使用，这些酶可根据它们抗高温的能力进行选择。例如，所述反应混合物可在多核苷酸合成反应前使用，在这种情况下，非嗜热的酶可被使用。由于修复被迅速完成并且延长的温育通常不是有害的，因此对于在所述酶混合物中温育几秒、几分钟或几小时而言，所述修复反应对时间不敏感。
文档编号C12Q1/68GKCN101331236 B发布类型授权 专利申请号CN 200680047566
公开日2012年2月29日 申请日期2006年4月11日
发明者B·斯拉塔科, R·库切拉, R·瓦伊斯维拉, T·C·埃文斯, 管楚狄, 陈立新 申请人:新英格兰生物实验室公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (6),