金龟子绿僵菌杀螨制剂的制作方法

专利名称:金龟子绿僵菌杀螨制剂的制作方法
技术领域：
本发明涉及一类防治植食性害螨的丝孢类真菌杀螨制剂。
背景技术：
叶螨泛指叶螨科的种类，属植食性螨类，一般为多食性作物和经济植物害螨，种类 多，分布广。在我国棉区危害的叶螨种类主要有朱砂叶螨、截形叶螨、二斑叶螨、敦煌叶螨和 土耳其斯坦叶螨等5种。在广大柑桔园区危害最严重的植食性叶螨是柑桔全爪螨，近年来 已明显上升成为柑桔主要害虫。除柑桔之外，还危害梨、桃、柿、枣、茶、桑、桂花、垂柳、月季 和冬青等植物。叶螨通常以成螨、若螨和幼螨在植物叶背吸取汁液，使叶面水分蒸腾增强， 叶绿素变色，光合作用受到抑制，从而使叶面变红、干枯、脱落、甚至整个植株枯死，降低产 量和影响品质。例如颇具代表性的朱砂叶螨(又名红叶螨、棉红蜘蛛等)，能危害全球100 多种大田作物和经济植物，造成巨大经济损失。
叶螨对农作物的明显危害始见于20世纪60年代以后，一般认为是化学杀虫剂大 量使用而导致的再增猖獗。自此以来，化学防治是大面积螨害控制的主要手段，有机氯(如 三氯杀螨醇)和有机锡(如螨完锡)制剂是常用的高效杀螨剂，但因其高毒高残留而在许 多作物(尤其瓜果、蔬菜、茶叶)上被禁用。由于螨类特殊的生态对策和环境适应性，螨类 的抗药性问题越来越突出。叶螨对有机氯杀螨剂的抗药性可在6 16代内增强数十至上 百倍；对有机磷、有机氮类化学杀虫剂很不敏感或抗药性极强，菊酯类杀虫剂甚至对其种群 繁衍具有助增作用。目前被广泛用于常见害虫防治的低毒低残留杀虫剂吡虫啉也被发现具 有刺激叶螨产卵的作用。由此可见，叶螨的危害和抗药性问题十分突出。如何有效控制植 食性叶螨的问题已成为国内外共同关注的焦点。
绿僵菌、白僵菌、拟青霉等丝孢类生防真菌是一类能侵染昆虫和螨类的虫生真菌， 为半知菌亚门丝孢纲真菌。该类生防真菌对土壤环境具有良好的适应性，寄主范围广泛， 生产工艺和剂型化技术已趋成熟，因而真菌杀虫剂研发的较理想菌种。自1995年以来， 欧美国家先后登记注册了球孢白僵菌Beauveria bassiana的系列制剂，如Mycotrol-ES、 Mycotrol-WP、Mycotrol_0、BotaniGuard-ES、BotaniGuard-WP、CornGuard-ES、ComGuard-G、 Naturalis (美国)、Ago BiocontrolBassiana 50 (哥伦比亚)、0strinil (法国)、Beauveria Schwerzer (瑞典)及Engerlingspliz (德国)等产品，主要用于防治各种不允许化学农药 残留存在的高附加值有机蔬菜瓜果等经济作物上的的蚜虫、粉虱等刺吸式口器害虫，还用 于防治地下害虫和蝗虫。玫烟色拟青霉也是国外90年代以来研究开发的重点，问世的商品 制剂包括 Biocon (荷兰)、Pae-sin (墨西哥)、Ago Biocontrol Paecilomyces 50 (哥伦比 亚)、Bemisin (委内瑞拉)以及美国和欧洲研制的制剂PFR-97和PreFeRal等，它们也主要 用于防治粉虱等刺吸式口器害虫。还有在南非注册生产的绿僵菌制剂GreenMuscle，主要用 于大面积蝗虫防治。国外近年这些成就的取得，主要得益于不断加大的研发投入与接种体 生产、剂型加工及应用配套技术的不断进步。
在害螨微生物防治研究中，直接侵染螨类的少数病原菌长期受到优先关注，如汤 普森被毛孢和佛州新接霉。遗憾的是这些螨类专性病原真菌很难开发成为具有商品意义的
3制剂，只能在特定作物生态系统(如果园)考虑利用它们的自然流行而起到一定程度的控 制作用，很难作为正常干预手段使用。国外一些学者于是转向几种经典的害虫生防真菌，希 望它们也能在害螨防治中发挥作用。但是，由于成螨个体很小，又非常活跃，以高效杀螨菌 种菌株筛选为目的的生物测定技术难度很高，相关的研究报道却寥寥无几，目前仍处于初 级探索阶段。筛选获得高效杀螨菌株，并研制出成本低、应用方便的高纯度孢子粉生产工艺 和孢子制剂的配方和配制工艺，并成功应用于田间害螨防治的案例则更为罕见。

发明内容
本发明首先提供了两种丝孢类真菌，它们分别为金龟子绿僵菌ZJUIM24-562菌 株(拉丁学名为Metarhizium anisopliae)，其保藏号为CGMCC No. 2375。球孢白僵菌 ZJUIM17-340 菌株(拉丁学名为 Beauveria bassiana)，其保藏号为 CGMCCNo. 2374 ；它们的 保藏时间均为2008年2月25日，保藏单位均为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生 物中心。它们分别为可以高效杀灭多种农作物上的植食性害螨的高效高毒力丝孢类真菌菌 株。
本发明的金龟子绿僵菌个体形态特征为菌落在SDAY平板上培养呈绒毛状， 最初白色，产孢时橄榄绿色，后期为灰绿色至深绿色；菌丝具分隔和分枝，透明，直径为 1. 5-2. 0 μ m。分生孢子梗很难与菌丝区别，直径约2 μ m，其末端产生瓶形小梗，通常从瓶梗 的末端以向基式连续形成长链的分生孢子。分生孢子单细胞，呈长椭圆形至圆柱状，两端钝 截形或钝园，大小变化大，5 9X2 4. 5 μ m。单个存在时色亮，成堆时橄榄绿色。
本发明的球孢白僵菌个体形态特征为菌落在SDAY平板上培养菌落呈绒状，背面 呈浅紫红色；产孢细胞浓密簇生于菌丝、分生孢子梗或膨大的泡囊，球形至瓶形，颈部明显 延长成粗1 μ m、长达20 μ m左右的产孢轴，轴上具小齿突，呈膝状弯曲；分生孢子球形或近 球形，光滑透明，大小为2 3X2 2. 5μπι。
本发明另一个所要解决的技术问题是克服现有技术的上述缺陷，针对目前农业生 产中为害性较大、抗药性突出、一般药剂防治效果差的植食性害螨，提供具有高效的叶螨控 制效果、能显著减少化学杀螨剂的实用而且具有环境友好特点的丝孢类真菌杀螨制剂。为 此，本发明采用以下技术方案它为以丝孢类真菌孢子粉为活性成分的油悬剂，其连续相为 矿物油或植物油。
所述的丝孢类真菌孢子粉可以是由金龟子绿僵菌CGMCC 2375或球孢白僵菌 CGMCC 2374采用两相发酵工艺制成的高纯度孢子粉，孢子粉含孢量大于1000亿个/克粉， 活孢率大于90%，含水量小于8%;在矿物油中可再加入抗坏血酸(紫外保护剂)和羧甲基 纤维素纳(稳定剂)，搅拌混合均勻制成真菌孢子油悬剂，所述高纯度孢子粉与矿物油的投 料比为100 150克/升，所述抗坏血酸和羧甲基纤维素纳与矿物油的投料比分别为1 5克/升和5 10克/升。
所述油悬剂中所用的载体油为工业石蜡油或工业石蜡油的复合配方。
本发明再一个所要解决的技术问题是提供一种用上述丝孢类真菌杀螨制剂制成 的真菌孢子悬乳剂，它将上述的丝孢类真菌杀螨制剂与具备生物相容性的乳化剂按照5 10 100的体积比混合而成。
所述的生物学相容性良好的乳化剂可以采用非离子性乳化剂，比如脂肪醇聚氧乙
4烯醚和羟基聚环氧乙烷嵌段共聚物复合物。但由于长期混贮对真菌分生孢子具有一定的影 响，故作临用时混合配制处理。
经过对所述丝孢类真菌杀螨菌株对以朱砂叶螨为代表的植食性叶螨的室内杀螨 活性进行测定，金龟子绿僵菌ZJUIM24-562和球孢白僵菌ZJUIM17-340对朱砂叶螨具有 很强的侵染杀虫活性。采用Potter喷塔法按从低至高的顺序接种朱砂叶螨卵和雌成螨两 个生长阶段，在25V 12L: 12D的培养箱中培养观察7 9天，统计分析获得所述金龟子绿 僵菌ZJUIM24-562菌株对朱砂叶螨卵和成螨的半致死剂量(LC5tl)分别为179(99-325)和 135(75-224)个孢子/mm2 ；所述球孢白僵菌ZJUIM17-340菌株对朱砂叶螨卵和成螨的半致 死剂量(LC50)分别为 191(80-450)和 42(22-82)个孢子/mm2。
所述丝孢类真菌杀螨菌株在田间对于柑桔红蜘蛛和棉花红蜘蛛等植食性叶螨同 样具有优异的控螨效果。先将所述丝孢类真菌杀螨菌株的分生孢子粉按上述方法配制成 孢子悬乳剂进行机动弥雾，机具为1. 6马力WFB-18AC型背负式机动弥雾器，按5000转/ min的额定功率，孢子悬乳剂浓度标准化为1 X IO10个孢子/mL，使用时用水稀释100倍， 按150L/ha的用液量机动定功率运行，隔15天喷雾1次，共喷雾2次。35天内金龟子绿僵 菌ZJUIM24-562菌株处理后的棉花红蜘蛛平均虫口减退率和相对防效分别达到80. 7%和 85. 8%；球孢白僵菌ZJUIM17-340菌株所致的棉花红蜘蛛平均虫口减退率和相对防效分别 达到69. 8%和77. 9%。同样的试验方法下，近45天的试验观察期内，所述两种杀螨菌株对 柑桔红蜘蛛的相对防效均达到85%以上。
试验表明，本发明的丝孢类真菌杀螨制剂，对植食性叶螨具有较好的控制效果，能 大量减少化学杀螨剂的使用，提高农产品的安全性。
具体实施方式
实施例1、丝孢类生防真菌的保存与培养
金龟子绿僵菌ZJUIM24-562和球孢白僵菌ZJUIM17-340等丝孢类生防真菌以干燥 分生孢子粉和灭菌白沙混合的形式保存于_72°C超低温冰箱中。保藏菌种均在萨氏培养基 SDAY平板上于25°C下活化7天左右，用于孢子粉的生产。其中萨氏培养基SDAY配方(W/W) 为葡萄糖4%、蛋白胨1%、酵母和琼脂2%。
实施例2、高纯度分生孢子粉的生产
丝孢类生防真菌的高纯度分生孢子粉的生产采用一种立式多层产孢箱(专利公 开号CN 1710059A)，以低值陈米作为主要原料的液-固两相发酵方法(专利公开号CN 1415736)生产，具体按照以下步骤进行
1)将所述丝孢类高效杀螨菌株，使用萨氏培养液或麦麸浸提液进行液相发酵，获 得菌丝液。
2)选用低值稻米洗净浙干后经蒸汽灭菌并熟化至5 6成熟，冷却后作为固相发
酵基质。
3)在上述固相发酵基质中按8 12升/100公斤米的比率混入上述液相发酵所得 的菌丝液，机器搅拌均勻即成接种物料。
4)将接种物料放入产孢箱进行封闭式发酵产孢，产孢箱内的温度控制在 25士2°C，依靠加湿器保持产孢箱内相对湿度> 95%，接种物料在产孢箱内发酵反映72
596小时。
5)关闭加湿器，是产孢箱保持密封状态控制产孢箱内温度为25士2°C，继续发酵 反应72 120小时，得发酵物料；
6)表面长满所述杀螨菌株孢子粉的发酵物料在不超过35°C下通风干燥至含水量 40 %以下，用MK-V型收孢机收获孢子粉。所获孢子粉含孢量达1000亿/克，活孢率大于 90 %。再经常温真空抽干后，孢子粉的含水量小于8 %。
实施例3、丝孢类生防真菌的杀螨活性测定
将实施例2中获得的高纯度孢子粉用0. 02% Tween 80溶液稀释成高、中、低三个 孢子剂量孢子悬浮液，以仅含0. 02% Tween 80的水溶液为空白对照。试验采用Potter喷塔 法按从低至高的顺序，在0. 7kg/cm2的压力下将2ml的孢子水悬液喷雾到直径Ilcm的载物 台的载满叶螨雌成螨或者螨卵的叶片上。各浓度下的实际接种剂量用平放于叶片旁的盖玻 片(20CmX20Cm)收集孢子，棉兰染色后在显微镜下5点取样镜检(0. 2165mm2/视野)孢子 数，从而将降沉降到螨体及其叶片上的孢子附着量标准化为孢子数/mm2。接种后将雌成螨 或螨卵置于25°C 12L: 12D的培养箱中培养观察7 9天，所获数据进行统计分析，计算获得 供试生防真菌对朱砂叶螨雌成螨和螨卵的杀灭活性。其中，所述金龟子绿僵菌ZJUIM24-562 菌株对朱砂叶螨卵和成螨的半致死剂量(LC5tl)分别为179(99-325)和135(75-224)个孢子 /mm2;所述球孢白僵菌ZJUIM17-340菌株对朱砂叶螨卵和成螨的半致死剂量(LC5tl)分别为 191 (80-450)和 42(22-82)个孢子 /mm2。
实施例4、丝孢类真菌杀螨菌株孢子油悬剂的制备
采用市售的工业石蜡油或工业石蜡油复合物作为惰性液相介质，加入实施例2中 所制得的高效杀螨丝孢类真菌菌株高纯度分生孢子粉、作为稳定剂的羧甲基纤维素纳和作 为紫外保护剂的抗坏血酸。其中高纯度孢子粉与矿物油的投料比为100 150克/升，羧 甲基纤维素纳与矿物油的投料比为1 5克/升，抗坏血酸与矿物油的投料比也为1 5 克/升，搅拌混合均勻后即制成丝孢类真菌杀螨菌株的孢子油悬剂。所用的工业石蜡油经 长期贮存试验测定有利于菌剂的贮存，并且生物学相容性良好。
配制的金龟子绿僵菌ZJUIM24-562和球孢白僵菌ZJUIM17-340孢子油悬剂的有效 孢子含量不低于100亿个/毫升，含水量不超过2%。混合均勻的金龟子绿僵菌孢子油悬剂 为墨绿色或近黑色液体，而球孢白僵菌孢子油悬剂为淡黄色或土黄色。
实施例5、丝孢类真菌杀螨菌株孢子悬乳剂的配制
将实施例4所制得的孢子油悬剂与生物学相容性良好脂肪醇聚氧乙烯醚和羟基 聚环氧乙烷嵌段共聚物复合物，按照5 10 100的体积比混合，搅拌均勻即制成金龟子 绿僵菌和球孢白僵菌孢子悬乳剂。
真菌杀螨孢子悬乳剂可以用水稀释进行常规容量(500 1000倍稀释液)或低容 量(100 150倍稀释液)喷雾。
实施例6、丝孢类真菌杀螨菌株孢子悬乳剂在田间的应用及杀螨效果
1)新疆棉花红蜘蛛防治试验
于2006年7月至8月在新疆阿拉尔市塔克拉玛干沙漠北缘中段棉区选择螨害较 重的两块棉田进行了棉花红蜘蛛的田间药效试验。试验将实施例5所制得的孢子悬乳剂用 水稀释100 150倍进行低容量的机动喷雾。稀释液中的用菌量是使其内含的孢子油悬
6剂用量达到1. 5 2. 3公升/公顷。
试验间隔10 15天连续用菌2次，都能有效地控制棉红蜘蛛对棉花的为害。用 菌后5 10天的所述两株丝孢类杀螨菌株对棉红蜘蛛的相对防效都达到了 70 %以上，第二 次用菌后则稳定在75% 95%之间。
2)浙江柑桔红蜘蛛防治试验
于2007年10月至11月在衢州市和台州市两个浙江柑桔主产区选取具有代表性 的桔园进行了为期45天的柑桔红蜘蛛田间药效试验。试验同样将实施例5所制得的孢子 悬乳剂用水稀释100 150倍进行低容量的机动喷雾。
试验也间隔10 15天连续用菌2次，结果发现所述丝孢类真菌杀螨制剂对柑桔 红蜘蛛的田间控制效果显著，有效地控制柑桔红蜘蛛对柑桔的危害。在衢州和台州两地用 菌后第5天的相对防效为64. 5% 72. 7%和58. 9% 72. 2%，而到第2次用菌后近30天 内两地的相对防效分别达到了 85%和90%以上，显著高于化学农药哒螨灵的防治效果。而 且菌剂的持效期很长，截止至次年的3月份仍没有明显地种群密度反弹的迹象，表明所述 丝孢类真菌杀螨制剂的跨季节效应显著。
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权利要求
金龟子绿僵菌ZJUIM24 562菌株(Metarhizium anisopliae)，其保藏号为CGMCC No.2375。
2.丝孢类真菌杀螨制剂，其特征在于它为以丝孢类真菌孢子粉为活性成分的油悬 剂，其连续相为矿物油或植物油，所述丝孢类真菌为权利要求
1所述的金龟子绿僵菌 ZJUIM24-562 菌株。
3.如权利要求
2所述的丝孢类真菌杀螨制剂，其特征在于孢子粉与连续相的投料比为 100 150克/升。
4.如权利要求
2所述的丝孢类真菌杀螨制剂，其特征在于所述油悬剂中加入有抗坏血 酸作为紫外保护剂，抗坏血酸与连续相的投料比分别为1 5克/升。
5.如权利要求
2所述的丝孢类真菌杀螨制剂，其特征在于所述油悬剂中加入有羧甲基 纤维素纳作为稳定剂，羧甲基纤维素纳与连续相的投料比分别为5 10克/升。
6.一种用权利要求
2所述丝孢类真菌杀螨制剂制成的真菌孢子悬乳剂，其特征在于它 将权利要求
2所述的丝孢类真菌杀螨制剂与具备生物相容性的乳化剂按照5 10 100 的体积比混合而成。
7.如权利要求
6所述的真菌孢子悬乳剂，其特征在于所述具备生物相容性的乳化剂为 脂肪醇聚氧乙烯醚和羟基聚环氧乙烷嵌段共聚物复合物。
专利摘要
本发明公开了一种能有效控制植食性害螨、减少化学农药使用、提高农产品安全性的高效丝孢类真菌杀螨制剂。本发明的金龟子绿僵菌ZJUIM24-562菌株(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌ZJUIM17-340菌株(Beauveria bassiana)于2008.2.25保藏，保藏编号分别为CGMCC No.2375和CGMCC No.2374。所述的制剂由丝孢类真菌分生孢子、矿物油、乳化剂、紫外保护剂和稳定剂成分组成。室内外试验结果表明，本发明的丝孢类真菌杀螨制剂对各类植食性害螨均具有十分理想的杀灭活性和田间防治效果。因此，本发明将填补国内真菌杀螨剂研究知识和技术上的空白。
文档编号A01P7/02GKCN101338279 B发布类型授权 专利申请号CN 200810061575
公开日2011年3月16日 申请日期2008年5月7日
发明者冯明光, 施卫兵 申请人:浙江大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),