专利名称:单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
单核细胞增生李斯特菌(Listeria monocytogenes, Lm)(以下简称“单增李斯特菌”)是一种重要的人畜共患病致病菌，广泛存在于土壤、动物和水产品等，主要通过奶及奶制品、蔬菜、水产品、肉制品等食物传播。该菌已被列为90年代4大食品致病菌之一，成为许多国家食品卫生的必检项目。
传统的单增李斯特菌生化检测方法全过程至少需要7 10d，检出限较低，费时费力。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR或荧光定量PCR方法快速，特异、灵敏度很高，但需要昂贵的PCR仪。国外曾有少量文献报道利用mRNA模板针对iap基因以RT-PCR检测活体单增李斯特氏菌，但需要以膜杂交来显示检测结果，时间长、技术复杂、费用高，不易推广应用。荧光染色技术可以对活菌进行检测，但技术复杂，需要高端仪器。因此建立一种简便、灵敏、快速、特异的方法很有必要。
环介导等温扩增基因技术(loop-mediatedisothermal amplication,简称LAMP)(国际专利公开号W000/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNApolymerase)在65°C左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增,扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选SYBR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。
中国发明专利(申请号为:200710030435.0,200710030437. X,200710132320. 2,200710026389. 7,200810052321. 0,200810015001. 8,200810093986. 6)分别公开了采用环介导等温扩增基因技术检测病菌的方法。但是，目前还没有用环介导等温扩增基因技术检测单增李斯特菌的试剂盒的报道。
发明内容
为了解决现有单增李斯特菌的检测方法不简便、灵敏低、时间长、特异性差的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种单增李斯特菌环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplication,LAMP)技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒检测方法。本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异好的特点，可广泛用可广泛用于食品、水产品、化妆品与医疗卫生等领域。[0007]为了实现上述的第一个目的，本发明采用以下的技术方案
单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，所述的引物为一套单增李斯特菌特征性引物组，一套引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物，共有六套引物，序列分别为
弓丨物组一
外引物I :CAAGCACTGTAGTAGTCGA外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
内引物 I :GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG
内引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG
或引物组二
外引物I :GGTGATACTCTTTGGGGTAT
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
内引物 I :GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
内引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物组三
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
内引物 I :CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGITTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
内引物 2 GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物组四
外引物I :ACTGGITTCGTTAACGGTAA
外引物2 : TGTCACCGCTTTTGACAG
内引物 I :AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTITTGCAGTAAGCACTCCAGTTG
内引物 2 CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 或弓I物组五
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
内引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
内引物 2 CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物组六
外引物I :GGTAACGGACCAACTACA
外引物2 : TCATTTGACCATTACCAACAT
内引物 I : TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT
内引物 2 : TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用以下的技术方案
单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括上述技术方案中的任意一组引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液和阳性对照液。
作为优选，所述的引物组由体积比为I :1 4 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、内引物I与内引物2组成。
作为优选,所述的反应液是由体积比为5 2 1 2的IOXThermopol反应缓冲液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4与25 37. 5M甜菜碱组成。作为再优选，所述的IOXThermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为I %曲拉通X-100。[0039]作为优选，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8 16个活性单位。
作为优选，所述的样品预处理液是由20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,体积百分比浓度为I. 2%曲拉通X-100。
作为优选，所述的该试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料。优选荧光染料为SYBR Green I ；
作为优选，所述的阳性对照液为单增李斯特菌标准菌株基因组DNA。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用以下的技术方案
单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测方法，采用上述的任意一个技术方案所述的试剂盒，该方法包括以下的步骤
I)单增李斯特菌DNA的提取A、取50ul过夜培养的增菌液于印pendorf管中， IOOOrpm离心2min，弃上清；B、加入80ul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均勻；C、沸水中煮IOmin后立即冷却IOmin ;D、IOOOOrpm离心2min,上清即可作为待检的模板DNA ；
2)反应体系为2. 5μ L引物组、5μ L反应液、I μ LBst DNA聚合酶、2 μ L待检模板DNA或阳性对照液和14. 5 μ L ddH20 ；
3)单增李斯特菌的环介导等温扩增将配制好的PCR管于60 65V反应I
I.5h，80°C终止反应；
4)分析判断反应产物结果在反应产物中加入2. 5ul荧光染料，混匀，静置5min，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
本发明所说的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermalamplication,简称LAMP)，快速检测样品单增李斯特菌的方法是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，从dNTP
析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物-----焦磷酸镁乳白色沉淀，即
可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65°C左右)条件下45至90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析和血清学分型鉴定的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；采用本发明中的基因诊断试剂盒检测仅需2小时。并且，本发明的反应液中添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。
本发明的优点是本发明的优点是(I)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99.9%，假阳性率小于O. 1% ; (3)、快速、高效扩增检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高扩增模板仅需10拷贝或更少，最低检测极限达到10CFU/ml ;标本的检出率达到99% ； (5)、鉴定简便通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，可通过肉眼观察鉴定；加入荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠；￠)、用途广可广泛用于食品、水产品、化妆品与医疗卫生等领域安全快速检测
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例I试剂盒的制备
本发明所提供的基因诊断试剂盒是由一套引物组，一套引物组包括两对引物，BstDNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色剂与阳性对照液等组成。
(I)其中所说的引物有6套，分别为
引物组一
外引物I :CAAGCACTGTAGTAGTCGA
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
内引物 I : GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG
内引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物组二
外引物I : GGTGATACTCTTTGGGGTAT
外引物2 : CGTAATAATACTGTTATCAACACC
内引物 I :GACCTGGTACGATITTATCTGTTGTITTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
内引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 或弓丨物组三
外引物I :TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
内引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
内引物 2 GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物组四
外引物I :ACTGGITTCGTTAACGGTAA
外引物2 : TGTCACCGCTTTTGACAG
内引物 I :AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTITTGCAGTAAGCACTCCAGTTG
内引物 2 CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 或弓I物组五
外引物I TTAAACGTCCGTACTGGC
外引物2 : CACTTCTTGTGTTGGTGC
内引物 I : CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA
内引物 2 CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 或弓丨物组六
外引物I :GGTAACGGACCAACTACA
外引物2 TCATTTGACCATTACCAACAT
内引物 I : TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT[0079]内引物 2 : TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC
引物由I 1 4 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、内引物I与内引物2组成
(2)反应液为由 5 :2 1 2 的 IOXThermopol 反应缓冲液、7. 5-12. 5mMdNTP,100-200mM MgS04与25-37. 5M甜菜碱组成；其中，10 X Thermopol反应缓冲液含有200mMpH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为I %曲拉通X-100 ；
(3) Bst DNA聚合酶为Bst DNA polymerase,每微升含8个活性单位；
(4)样品预处理液为20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,体积百分比浓度为I. 2%曲拉通x-100组成；
(5)显色剂为荧光染料，优选SYBR Green I ；
(6)阳性对照液为单增李斯特菌基因组DNA。
实施例2检测方法
被检样品将少许食品或体液等被检样品置于增菌液中37°C培养。
(I)、对被检样品的预处理按常规方法提取DNA基因
A、取50ul过夜培养的增菌液于eppendorf管中，IOOOrpm离心2分钟，弃上清；
B、加入80ul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均匀；
C、沸水中煮10分钟后立即冷却10分钟；
D、IOOOOrpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。
(2)、环介导等温扩增技术反应过程
A、在200ulPCR管配制反应体系引物混合物2. 5ul，反应液5. Oul,BstpolymeraseLarge Fragmentlul (8U),准备好的模板 DNA2ul,加 14. 5ul ；
B、将配制好的PCR管于65°C反应1-1. 5h，80°C终止反应。
(3)、分析判断反应产物结果在反应产物中加入2. 5ul荧光染料(SYBRGREENI)，混匀，静置5min，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
序列表
〈110〉中国计量学院
〈120〉单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
<160>24
<210>1
<211>19
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>1
CAAGCACTGTAGTAGTCGA 19
<210>2
<211>24
<212>DNA[0111]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>2
CGTAATAATACTGTTATCAACACC 24<210>3
<211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>3
GTTTGCTTTTTTAATTGCGTCAACATTTTAGCTGGTGATACTCTTTGG 48
<210>4
<211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>4
ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 48
<210>5
<211>20
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>5
GGTGATACTCTTTGGGGTAT 20
<210>6
<211>24
<212>DNA
>213〉人工序列
〈223〉引物
<400>6
CGTAATAATACTGTTATCAACACC 24
<210>7
<211>47
<212>DNA[0146]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>7
GACCTGGTACGATTTTATCTGTTGTTTTTCGCACAAAGTAAAGGGAC 47
<210>8〈211>45
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400>8
ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTG 48
<210>9
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>9
TTAAACGTCCGTACTGGC 18
<210>10
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>10
CACTTCTTGTGTTGGTGC 18
<210>11
<211>51
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>11
CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA 5I
<210>12
<211>48
<212>DNA[0181]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>12
GCTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 48
<210>13
<211>20
<212>DNA〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>13
ACTGGTTTCGTTAACGGTAA 20
<210>14
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>14
TGTCACCGCTTTTGACAG 18
<210>15
〈211 >46
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉15
AGGTGCAGCTTGTTGAGTAGTAGTTTTGCAGTAAGCACTCCAGTTG 46
<210>16
<211>47
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>16
CCTGCGCCTAAAGTAGCAGAATTTTGTGTGTAGTAGCATTTTGATCT 47
<210>17
<211>18
<212>DNA[0216]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>17
TTAAACGTCCGTACTGGC 18
<210>18[0221]<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉18
CACTTCTTGTGTTGGTGC 18
<210>19
<211>51
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
〈400〉19
CGTTAGATTCGGTTGTTTCAACAGTTTTAACAGTATTATTACGTCCATCAA 5I
〈210>20
〈211>48
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>20
CTGGCACAAAATTACTTACAACGATTTTTTGGAGTGCTTACTGCTTTG 48
<210>21
<211>18
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>21
GGTAACGGACCAACTACA 18
<210>22
<211>21
<212>DNA[0251]〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>22
TCATTTGACCATTACCAACAT 21
〈210>23
<211>44
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物
<400>23
TGTACGTGGAAGGGAGATACCTTTTTGATTGCTCTGGTTACACT 44
<210>24
<211>47
<212>DNA
〈213〉人工序列
〈223〉引物<400>24
TCTGAATCTCAAGCAAAACCTGGTTTTTCGTGAGAAATTCCGCTACC 47
权利要求
1.单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，其特征在于所述的引物为一套单增李斯特菌特征性引物组，一套引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物，序列分别为 外引物 I GGTGATACTCTTTGGGGTAT 外引物 2 CGTAATAATACTGTTATCAACACC
内引物 I :GACCTGGTACGATITTATCTGTTGTITTTCGCACAAAGTAAAGGGAC
内引物 2 ACAAGTAAATAATGAGGTTGCTGCTTTTTCGGACGTTTAACCAAGTTGo
2.单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如权利要求
I所述的引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液和阳性对照液。
3.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于所述的引物组由体积比为I : I : 4 : 4的20-30 μ M外引物I、外引物2、内引物I与内引物2组成。
4.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于所述的反应液是由体积比为5 : 2 : I : 2的IOXThermopol反应缓冲液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100-200mM MgSO4 与 25 37. 5M 甜菜碱组成。
5.根据权利要求
4所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于所述的IOXThermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为I %曲拉通X-100。
6.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于Bst DNA聚合酶每微升含8 16个活性单位。
7.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于样品预处理液是由20mM pH 8. O Tris_HCl，2mM EDTA，体积百分比浓度为I. 2%曲拉通X-100组成。
8.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料。
9.根据权利要求
2所述的单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于阳性对照液为单增李斯特菌标准菌株基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。单增李斯特菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，所述的引物为一套单增李斯特菌特征性引物组，一套引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物，共有六套引物。本发明的试剂盒由一套引物、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液、显色剂和阳性对照液等组成；检测方法包括细菌DNA的提取、环介导等温核酸扩增和显色检测等。使用本试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中的单增李斯特菌，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、通过肉眼即可判定结果等优点。
文档编号C12Q1/04GKCN101368203 B发布类型授权 专利申请号CN 200810121029
公开日2012年8月8日 申请日期2008年9月16日
发明者傅小伟, 刘军, 唐乔, 张明洲, 方结红, 方美明, 胡华军, 陈宗伦, 龚云飞 申请人:中国计量学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (2),