专利名称:阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物和试剂盒的制作方法
技术领域：
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。
背景技术：
阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)，又名黄色阴沟肠杆菌，为肠杆菌属的一种革兰氏阴性菌，1980年后改名为阪崎肠杆菌，是奶及奶制品加工过程及成品中近几年新发现的引起广泛关注的一种致病菌，可引起婴幼儿及成人疾病包括婴儿脑膜炎、脓血症、败血症和小肠结肠炎等，并可能引起神经功能紊乱，造成严重的后遗症和甚至死亡。 2002-2003年美国某知名奶粉生产企业曾自发召回了含有阪崎肠杆菌的婴儿配方奶粉，此后奶粉中阪崎肠杆菌成为世界瞩目的焦点。1961年至2003年研究报告已表明阪崎肠杆菌引起婴幼儿及早产儿总体死亡率高达80%。FA0/WH0(联合国粮农组织/世界卫生组织) 于2004年2月在日内瓦召开的专家咨询会上将阪崎肠杆菌列入导致婴幼儿感染、疾病和死亡的主要原因的“A”类微生物范畴，严重威胁人类(尤其是婴幼儿)的健康，并给食品(尤其是奶及奶制品)工业带来重大经济损失。
因此，各国政府对食品(尤其是奶及奶制品)中的阪崎肠杆菌都作出严格的要求。 2002年美国FDA在世界范围内率先建立了阪崎肠杆菌的检测标准；我国先后发布了 “奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第1部分分离与计数方法” (SN/T1632. 1-2005)、“奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第2部分PCR方法”(SN/T1632. 2-2005)和“奶粉中阪崎肠杆菌检验方法第3 部分荧光PCR方法”(SN/T1632. 3-2005)等行业标准，对大部分进口的奶及奶制品都要求进行阪崎肠杆菌的检验，并要求不得检出。因此，阪崎肠杆菌已成为许多国家食品卫生的必检项目，其检测方法正日益引起人们的关注。
经典的常规细菌生理生化检验方法全过程至少需要6 10d，检出限较低，费时费力。免疫法比较快，但单克隆抗体制备比较困难，易产生交叉反应，特异性差。而PCR或荧光定量PCR方法快速，特异、灵敏度很高，但需要昂贵的PCR仪、技术复杂、费用高，不易推广应用。荧光染色技术可以对活菌进行检测，但技术复杂，需要高端仪器。因此建立一种简便、 灵敏、快速、特异的方法很有必要。
环介导等温扩增基因技术(loop-mediatedisothermal amplication，简称LAMP) (国际专利公开号W000/28082)是2000年Notomi等开发出的一种核酸扩增新技术，针对待测靶基因序列的6个区域设计一套两对特异引物，利用链置换DNA聚合酶(Bst DNA polymerase)在65°C左右等温条件下能够特异性、高效、快速的进行核酸扩增，扩增结果可直接对扩增副产物焦磷酸镁沉淀通过肉眼进行判断或检测其浊度，也可用结合双链的荧光染料优选STOR Green I染色，即可通过肉眼判定。由于LAMP技术扩增的两对引物是针对靶基因的6个区段，因而具有比PCR更高的特异性，同时是等温条件下即不需PCR仪等特殊仪器，且样品的前处理非常简单、单位时间内扩增效率更高等优点，已引起人们的关注。
中国发明专利(申请号为:200710030435. 0,200710030437. X,200710132320. 2,200710026389. 7,200810052321. 0,200810015001. 8,200810093986. 6)分别公开了采用环
介导等温扩增基因技术检测病菌的方法。但是，目前尚无利用环介导等温扩增基因技术检测阪崎肠杆菌的试剂盒和检测方法的报道。
发明内容
为了解决现有阪崎肠杆菌(Enterobacter sakazakii)的检测方法不简便、灵敏低、时间长、特异性差的技术缺陷。本发明的一个目的是提供一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增(loop-mediatedisothermal amplication, LAMP)技术快速检测用引物；本发明的第二个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒；本发明的第三个目的是提供使用上述检测用引物的试剂盒检测方法。本发明的试剂盒和检测方法具有简便、灵敏、快速、特异好的特点， 可广泛用于食品(尤其是奶及奶制品)、水产品、化妆品与医疗卫生等领域。
为了实现上述的第一个目的，本发明采用以下的技术方案
阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，所述的引物为一套阪崎肠杆菌特征性引物组，一套引物组由两对引物成，一对引物为外引物，一对为内引物，共有6套引物，序列分别为
引物组一
外引物1 :GCAATATTCCCCACTGCTGC
外引物2 GGAGGGGGATAACTACTGGA
内引物 1 :CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT
内引物 2 :TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 或引物组二
外引物1 AGTGTGGCTGGTCATCCT
外引物2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT
内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG
内引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 或弓丨物组三
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
内引物 2 :TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 或引物组四
外引物1 TCCTCCCCGCTGAAAGT
外引物2 TGCCCAGATGGGATTAGCT
内引物 1 GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG
内引物 2 :CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 或引物组五
外引物1 ACTTTACAACCCGAAGGCC
外引物2 AGCTAGTAGGTGGGGTAACG
内引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG
内引物 2 :CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 或引物组六
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
内引物 1 GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC[0034]内引物 2 TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG。
为了实现上述的第二个目的，本发明采用以下的技术方案
阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，该试剂盒包括上述技术方案中的任意一组引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液和阳性对照液。
作为优选，所述的引物组由体积比为1 1 :4:4的20-30 μ M外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成。
作为优选，所述的反应液是由体积比为5 2 1 2的lOXThermopol反应缓冲液、 7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4与25 37. 5M甜菜碱组成。作为再优选，所述的 lOXThermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、 IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为1 %曲拉通X-100。
作为优选，所述的Bst DNA聚合酶每微升含8 16个活性单位。
作为优选，所述的样品预处理液是由20mM pH8. OTris-HCl, 2mM EDTA,体积百分比浓度为1. 2%曲拉通X-100。
作为优选，所述的该试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料。优选荧光染料为 SYBR Green I ；
作为优选，所述的阳性对照液为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA。
为了实现上述的第三个目的，本发明采用以下的技术方案
阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测方法，采用上述的任意一个技术方案所述的试剂盒，该方法包括以下的步骤
1)阪崎肠杆菌DNA的提取A、取50ul过夜培养的增菌液于印pendorf管中， IOOOrpm离心2min，弃上清；B、加入SOul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均勻；C、沸水中煮IOmin后立即冷却IOmin ；D、IOOOOrpm离心anin，上清即可作为待检的模板 DNA ；
2)反应体系为2. 5μ L引物组、5μ L反应液、IyLBst DNA聚合酶、2 μ L待检模板 DNA或阳性对照液和14. 5 μ LddH20 ；
3)阪崎肠杆菌的环介导等温扩增将配制好的PCR管于60 65°C反应1 1. 5h， 80°C终止反应；
4)分析判断反应产物结果在反应产物中加入2. 5ul荧光染料，混勻，静置5min， 若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性；或者，通过肉眼观察鉴定，与阴性对照管比较显示，检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
本发明所说的环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplication, 简称LAMP)快速检测样品阪崎肠杆菌的方法是利用Bst DNA聚合酶和根据靶基因序列设计的两对特殊的内、外引物，特异性识别靶序列上的六个独立区域，启动循环链置换反应，在靶标DNA区启动互补链合成，结果在同一链上互补序列周而复始形成有很多环的花椰菜结构的茎一环DNA混合物。进行环介导等温扩增反应(简称LAMP反应)过程中，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的Mg2+结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，即可通过肉眼观察判定结果。LAMP反应是在恒温(65°C左右)条件下45至90分钟内完成。这种比较温和的温度条件以及没有温度循环使所需仪器简单化，克服了传统PCR固有的检测时间长、容易污染及检测成本高等缺点。此外，这种检测方法对检测人员的技术素质要求较低，实际操作极为简便，不需要特殊的试剂和仪器设备，有利于建立成本低廉的快速筛选体系。LAMP法是一种简便、快速、高度特异性的基因扩增法。将恒温基因扩增技术与PCR技术(包括荧光实时定量PCR技术)进行比较，可以发现该技术在灵敏度、特异性和检测范围等方法学指标上相当于或优于PCR技术，且不依赖任何专门的仪器设备即可实现现场高通量快速检测，而且检测成本远低于荧光定量PCR技术。国内目前尚未有这方面的试剂盒出售。目前国家标准中以微生物分离培养和形态学鉴定为主、结合生化分析、血清学分型和 PCR鉴定等的通行方法，初步鉴定需2-3天，完成鉴定报告需10至15天；采用本发明中的基因诊断试剂盒检测仅需2小时。并且，本发明的反应液中也可以添加了荧光染料，鉴定结果更为直观清晰。
本发明的优点是(1)、不需要特殊试剂与设备；(2)、高特异性应用六个区段，四条引物，根据是否扩增就能判断靶标物质的存在与否，阳性率可达大于99. 9%，假阳性率小于0. ； (3)、快速、高效扩增检测时间2小时左右；(4)、灵敏度高扩增模板仅需10拷贝或更少，最低检测极限达到10CFU/ml ；标本的检出率达到99% ； (5)、鉴定简便通过肉眼观察鉴定，无需电泳等其他任何分析步骤，从dNTP析出的焦磷酸根离子与反应溶液中的M2+ 结合，产生副产物——焦磷酸镁乳白色沉淀，可通过肉眼观察鉴定；加入荧光染料后，阳性结果显色为绿色，阴性结果为橙色，更加明显可靠；(6)、用途广可广泛用于食品(尤其奶及奶制品)中阪崎肠杆菌的安全快速检测。
具体实施方式
下面提供具体实施例进一步阐述本发明的技术方案，但本发明技术的应用不限于实施例。
实施例1试剂盒的制备
本发明所提供的基因诊断试剂盒是由一套引物组，一套引物组包括两对引物，Bst DNA聚合酶，反应液，样品预处理液，显色剂与阳性对照液等组成。
(1)其中所说的引物组有6套，分别为
引物组一
外引物1 :GCAATATTCCCCACTGCTGC
外引物2 GGAGGGGGATAACTACTGGA
内引物 1 CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT
内引物 2 :TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 或引物组二
外引物1 AGTGTGGCTGGTCATCCT
外引物2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT
内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG
内引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 或弓丨物组三
外引物1 TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 TGCTGCTCTGCTGACGA
内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
内引物 2 :TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 或引物组四
外引物1 TCCTCCCCGCTGAAAGT[0069]外引物2 TGCCCAGATGGGATTAGCT
内引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG
内引物 2 :CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 或引物组五
外引物1 ACTTTACAACCCGAAGGCC
外引物2 AGCTAGTAGGTGGGGTAACG
内引物 1 :GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG
内引物 2 :CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 或引物组六
外引物1 :TGTGGCTGGTCATCCTCTC
外引物2 :TGCTGCTCTGCTGACGA
内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC
内引物 2 TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG
引物组由1 1 :4:4的20-30 μ M外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成；
(2)反应液为由 5 :2 :1 :2 的 IOXThermopol 反应缓冲液、7. 5-12. 5mM dNTP, 100-200mM MgS04与25-37. 5M甜菜碱组成；其中，10 X Thermopol反应缓冲液含有200mM pH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、IOOmM氯化钾、IOOmM硫酸铵、20mM硫酸镁和体积百分比浓度为曲拉通X-100 ；
(3) Bst DNA聚合酶为Bst DNA polymerase,每微升含8-16个活性单位；
(4)样品预处理液为20mM pH8. OTris-HCl，2mM EDTA,体积百分比浓度为1. 2%曲拉通X-100组成；
(5)显色剂为荧光染料，优选STOR Green I ；
(6)阳性对照液为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA。
实施例2检测方法
被检样品将少许食品或体液等被检样品置于增菌液中37°C培养。
(1)、对被检样品的预处理按常规方法提取DNA基因
A、取50ul过夜培养的增菌液于印pendorf管中，IOOOrpm离心2分钟，弃上清；
B、加入SOul样品预处理液于离心管中，与沉淀所得菌体混合均勻；
C、沸水中煮10分钟后立即冷却10分钟；
DUOOOOrpm离心2分钟，上清即可作为待用的模板DNA。
(2)、环介导等温扩增技术反应过程
A、在200ulPCR管配制反应体系引物混合物2. 5ul，反应液5. Oul,Bstpolymerase Large Fragmentlul (8U)，准备好的模板 DNA(或阳性对照液)2ul，加 ddH2014. 5ul ；
B、将配制好的PCR管于65°C反应1_1. 5h，80°C终止反应。
(3)、分析判断反应产物结果在反应产物中加入2. 5ul荧光染料(STORGREENI)， 混勻，静置5min，若显现绿色则为阳性，橙色则为阴性。
序列表
<110>中国计量学院
<120>阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法
<160>24
<210>1[0102]<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>1
GCAATATTCCCCACTGCTGC 20
<210>2
<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>2
GGAGGGGGATAACTACTGGA 20
<210>3
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>3
CGACGATCCCTAGCTGGTCTGATTTTTCTGGACCGTGTCTCAGTT 45
<210>4
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>4
TCCCATCTGGGCACATCTGATGTTTTAACGTCTACGGACCAAAGTG 46
<210>5
<211>18
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>5
AGTGTGGCTGGTCATCCT 18
<210>6[0137]<211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>6
CGGACGGGTGAGTAATGTCT 20
<210>7
<211>46
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>7
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG 46
<210>8
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>8
AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG 45
<210>9
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>9
TGTGGCTGGTCATCCTCTC 19
<210>10
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>10
TGCTGCTCTGCTGACGA 17
<210>11[0172]<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>11
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC 45
<210>12
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>12
TTGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 45
<210>13
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>13
TCCTCCCCGCTGAAAGT 17
<210>14
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>14
TGCCC AGATGGGATTAGCT 19
<210>15
<211 >45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>15
GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTGGCCTTCTTCATACACGCG 45
<210>16[0207]<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>16
CCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGGTTTTGGTGGGGTAACGGCTCA 43
<210>17
<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>17
ACTTTAC AACCCGAAGGCC 19
<210>18 <211>20
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>18
AGCTAGTAGGTGGGGTAACG 20
<210>19
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>19
GGCAGCAGTGGGGAATATTGCATTTTTTCATACACGCGGCATGG 44
<210>20
<211>44
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>20
CGTAGGAGTCTGGACCGTGTCTTTTTTCACCTAGGCGACGATCC 44
<210>21
11[0242]<211>19
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>21
TGTGGCTGGTCATCCTCTC 19
<210>22
<211>17
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>22
TGCTGCTCTGCTGACGA 17
<210>23
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>23
GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTAGACCAGCTAGGGATCGTC 45
<210>24
<211>45
<212>DNA
<213>人工序列
<223> 引物
<400>24
TGGTCCGTAGACGTTATGCGGTTTTTATGTCTGGGAAACTGCCTG 45
权利要求
1.阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，其特征在于所述的引物为一套阪崎肠杆菌特征性引物组，一套引物组由两对引物组成，一对引物为外引物，一对为内引物，序列分别为外引物 1 :AGTGTGGCTGGTCATCCT外引物 2 CGGACGGGTGAGTAATGTCT内引物 1 :GCCATCAGATGTGCCCAGATGGTTTTCTCAGACCAGCTAGGGATCG内引物 2 :AGGTCCCCCACTTTGGTCCGTATTTTGGAAACTGCCTGATGGAGG。
2.阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒包括如权利要求
1所述的引物组、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液和阳性对照液。
3.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于所述的引物组由体积比为1 1 4 4的20-30 μ M外引物1、外引物2、内引物1与内引物2组成。
4.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于反应液是由体积比为5 2 1 2的IOXThermopol反应缓冲液、7. 5 12. 5mM dNTP, 100 200mM MgSO4与25 37. 5M甜菜碱组成。.
5.根据权利要求
4所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于=IOXThermopol反应缓冲液含有200 mM pH8. 8三羟基甲基氨基甲烷盐酸盐、100 mM氯化钾、100 mM硫酸铵、20 mM硫酸镁和体积百分比浓度为曲拉通X-100。
6.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于Bst DNA聚合酶每微升含8 16个活性单位。
7.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于样品预处理液是由20mM pH 8.0 Tris_HCl，2mM EDTA，体积百分比浓度为1.2%曲拉通X-100组成。
8.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于该试剂盒还包括显色剂，显色剂为荧光染料。
9.根据权利要求
2所述的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测试剂盒，其特征在于阳性对照液为阪崎肠杆菌标准菌株基因组DNA。
专利摘要
本发明涉及生物检测试剂，具体涉及一种阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物、试剂盒和检测方法。本发明的阪崎肠杆菌环介导等温扩增技术快速检测用引物，引物为一套阪崎肠杆菌特征性引物组，一套引物组由两对引物成，一对引物为外引物，一对为内引物，本发明共有6套引物；本发明的试剂盒由一套引物、反应液、Bst DNA聚合酶、样品预处理液、显色剂和阳性对照液等组成；检测方法包括细菌DNA的提取、环介导等温核酸扩增和显色检测等。使用本试剂盒通过对样品简单的处理便可快速检测样品中阪崎肠杆菌，具有灵敏度高、特异性强、操作简单、通过肉眼即可判定结果等优点。
文档编号C12N15/11GKCN101368204 B发布类型授权 专利申请号CN 200810121030
公开日2011年8月31日 申请日期2008年9月16日
发明者傅小伟, 刘军, 张明洲, 方美明, 胡华军, 陈宗伦 申请人:中国计量学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (5), 非专利引用 (3),