专利名称:一种微生物间歇供氧补料发酵生产丁醇的工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化工技术领域：
，特别涉及一种微生物间歇供氧补料发酵生产丁醇的工艺。
背景技术：
丁醇是一种重要的有机溶剂和化工原料，广泛应用于喷漆、炸药、皮革处理、香料、 塑料、制药、植物抽提取及有机玻璃、合成橡胶、农用化学品等方面，可用作油漆和表面涂料的溶剂，用于生产邻苯二甲酸二丁酯(DBP)和邻苯二甲酸丁苄酯(BBP)等增塑剂，用来制造醋酸丁酯、甲基丙烯酸丁酯、丙烯酸丁酯、正丁胺、氨基树脂、乙二醇醚等。近年来受世界石油资源、价格、环保和全球气候变化的影响，发展生物燃料已成为许多国家提高能源安全、 减排温室气体、应对气候变化的重要措施。目前市场上以燃料乙醇和生物柴油最为常见。生物丁醇与乙醇相似，可以和汽油混合用于清洁能源，并具有能量密度高、腐蚀性小、对水的宽容度大等许多优于乙醇之处，因此，生物丁醇的研究开发日益受到许多国家的重视。2006 年杜邦和BP公司宣布研制成功了一种新型生物燃料丁醇，以替代逐年价格上涨和供应量有限的汽油[钱明.BP和杜邦加快生产生物丁醇.中国石化报，2007-3-14，(5)]。英国有关机构与企业也计划利用英格兰东部的甜菜生产生物丁醇，并将其与传统汽油混合，用作车辆驱动燃料[焦瑞身主编.微生物工程[M].北京化学工业出版社，2003，148—155 ；功能材料信息.英计划用甜菜生产生物丁醇.用作车辆驱动燃料.2006，3 :47]。
工业上生产丁醇的方法有以下几种[化学工业出版社组织编写.中国化工产品大全·北京化学工业出版社，1998，511-512]
(1)羰基合成法丙烯与CO和H2在加压加温及催化剂存在下羰基合成正、异丁醛， 加氢后分馏得正丁醇。这是工业上生产丁醇的主要方法。
(2)醇醛缩合法，乙醛经缩合成丁醇醛，脱水生成丁烯醛，再经加氢后得正丁醇。
(3)发酵法以淀粉等为原料，接入丙酮-丁醇菌种，进行丙酮丁醇(ABE)发酵，发酵液精馏后得产品正丁醇。
近几十年来丁醇工业的生产大多以石油资源为原料，采取化学法合成，此法受世界石油短缺和价格飙升所限，且投资大，技术设备要求高，显然不具有扩展优势，于是在上世纪曾经一度兴盛而后遭受石油工业冲击并衰退的丁醇发酵工业再度复苏，重新成为各国研究的焦点。
发酵法生产丁醇的优势
(1)化工合成法以石油为原料，投资大，技术设备要求高；而微生物发酵法一般以淀粉质、纸浆废液、糖蜜和野生植物等为原料，利用丙酮丁醇菌所分泌的酶来分解淀粉成糖类，再经过复杂的生物化学变化，生成丙酮、丁醇和乙醇等产物，同时还产生大量的C02和 H2等化工产品，其工艺设备与酒精生产相似，原料价廉，来源广泛，设备投资较小；
(2)发酵法生产条件温和，一般常温操作，不需贵重金属催化剂；
(3)选择性好，安全性高，副产物少，易于分离纯化；
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(4)降低了对有限石油资源的消耗和依赖。
目前对丁醇发酵工艺的研究主要集中在以下几个方面
(1)间歇发酵
工业发酵多以玉米为原料。其工艺流程为玉米一粉碎一配料一蒸煮一后熟 —料冷却一接种一在一定温度和时间下完成发酵一蒸馏，得到丁醇、乙醇、丙酮[张益芬，杨蕴刘，陈军，焦瑞身.高丁醇比丙酮丁醇梭菌及其培养方法与应用.专利公开号 CN1063483C]。
⑵连续发酵
1960年，丙酮丁醇连续发酵已经工业化实施。多以玉米、糖蜜为原料。用6 11 个发酵罐组进行发酵，还有在活化罐采用不同的培养溶液，以便使梭菌总是保持其活性阶段，以溢流的方式进行丙酮丁醇的连续发酵生产，其产量与间歇法相比，提高约20% [颜方贵主编.发酵微生物学.北京化学工业出版社，1991,89-98]。
以玉米或糖蜜为原料的丙酮丁醇发酵工艺在我国以及许多其它国家已使用了几十年。但无论间歇发酵还是连续发酵，因菌种自身生理生化特性，使得发酵培养都维持在厌氧条件下，培养基一般处在静止或低速搅拌下进行，在大规模培养时，不利于发酵初期菌体对营养基质的吸收以及传质的进行，特别是在非玉米的合成培养基中菌株难以生长。同时， 要采用制氮设备维持发酵的厌氧环境，也增加了固定设备的投资及能耗。
发明内容
本发明的目的是提供一种微生物间歇供氧补料发酵生产丁醇的工艺，间歇供氧分段调控，并在发酵过程中进行补料的发酵生产丁醇的方法，丁醇浓度可显著提高。
本发明所述有氧补料发酵生产丁醇的方法是在菌体发酵的指数生长期10 — 20h 通入0. 1-0. 5vvm空气，并在指数生长中期以碳氮比20—100 1进行碳源和氮源的补加。具体工艺过程如下
(1)将拜氏梭菌，丙酮丁醇梭菌等丁醇产生菌接入种子培养基培养10— 20h，将种子液在60-100°C下热激5-15min后加入初始葡萄糖浓度为20—50g/l的半合成发酵培养基或4-7%的玉米醪培养基，在发酵温度35—40°C条件下发酵生产丁醇。
(2)发酵起始至进入指数生长期10—1 静态发酵，不需通气和搅拌。进入指数生长期10 — 18h至进入稳定期24— 36h，通入0. 1—0. 5vvm空气，并进行搅拌，搅拌转速20— 200rpm,菌体生长进入稳定期至发酵结束36 — 7 停止搅拌和通气，直至发酵结束。
(3)在发酵进入指数生长中期18 — 2 进行补料，补加5 — 30g/l淀粉、葡萄糖或纤维素水解液，并以碳氮比20—100 1进行酵母粉，硫酸氨，乙酸氨等氮源的补加。
(4)发酵结束，通过蒸馏和真空精馏步骤将丁醇分离、提纯，制备产品。
本发明的有益效果采用间歇供氧分段调控，并在发酵过程中进行补料的发酵生产丁醇的方法，丁醇浓度可显著提高。同时降低了固定设备的投资及能耗，降低了对设备的要求，节约了成本。
具体实施方式
本发明的目的是提供一种间歇供氧分段调控，并在发酵过程中进行补料的发酵生产丁醇的方法，丁醇浓度可显著提高。其特征在于所述有氧补料发酵生产丁醇的方法是在菌体发酵的指数生长中期10—20h通入0. 1-0. 5vvm空气，并在指数生长中期18—2 以碳氮比20—100 1进行碳源和氮源的补加。发酵结束时通过蒸馏和真空精馏步骤将丁醇分离、提纯，制备产品。
下面再举具体实施例对本发明予以进一步说明。
实例1
(1)菌种拜氏梭菌(Clostridium, beijerinckii)
(2)培养基
(A)固体培养基(g/L)
RCM培养基酵母浸粉3，牛肉膏10，胰蛋白胨10，可溶性淀粉1，葡萄糖5，L_半胱氨酸0.50，NaCI 5，NaAc 3，琼脂15，调节pH 8.5。用于拜氏梭菌菌种的短期保藏及活化。
(B)种子培养基(g/L)
玉米粉培养基质量分数6. 5%玉米醪培养基。称取过40目筛的玉米粉65g，加IL 自来水，煮沸50min后，补足挥发水分。
(C)发酵培养基(g/L)
玉米培养基(g/L)质量分数6. 5%玉米醪培养基。称取过40目筛的玉米粉70g， 加IL自来水，煮沸50min后，补足挥发水分。
(3)种子培养将甘油管保藏的菌种转接至斜面，37°C下活化12h。种子培养采用使用500ml三角瓶，装液量300ml。培养温度37°C，摇床转速50rpm，然后置于75°C水浴中热激lOmin，快速冷却后使用。
(4)发酵将种子培养基按照5%接种量移至发酵培养基中，发酵采用IL发酵罐， 发酵温度37°C，发酵18h，通入0. 2vvm
空气，搅拌转速IOOrpm，发酵30h停止搅拌和通气至发酵4 停止发酵。在发酵的 18h补加20g/L淀粉并加入0. 5g/L硫酸铵。
(1) 发酵结果
总溶剂24. 79g/L，丁醇 16. 68g/L，乙醇 2. 91g/L，丙酮 5. 2g/L。
各溶剂所占比例丁醇67. 29%，乙醇11. 74%，丙酮20. 97%
实例2
(1)菌种同实例一
(2)培养基
(A)固体培养基(g/L)
同实例一
(B)种子培养基(g/L)
同实例一
(C)发酵培养基(g/L)
半合成培养基
权利要求
1. 一种微生物间歇供氧补料发酵生产丁醇的工艺，其特征在于工艺步骤如下(1)将拜氏梭菌或丙酮丁醇梭菌接入种子培养基培养10-20h，将种子液在60-10(TC下热激5-15min后加入含初始葡萄糖浓度为20_50g/l的半合成发酵培养基或含4_7 %玉米醪培养基，在发酵温度35-40°C条件下发酵生产丁醇；(2)发酵起始至进入指数生长期10-1 静态发酵，进入指数生长期10-1 !至进入稳定期对-3他，通入0. 1-0. 5vvm空气，并进行搅拌，搅拌转速20_200rpm，菌体生长进入稳定期至发酵结束36-7 停止搅拌和通气，直至发酵结束；(3)在发酵进入指数生长后期20-3 进行补料，补加5-30g/l淀粉或葡萄糖，并以碳氮比20-100 1进行酵母粉、硫酸氨或乙酸氨的补加；(4)发酵结束，通过蒸馏和真空精馏步骤将丁醇分离、提纯，制备出产品丁醇。
专利摘要
一种微生物间歇供氧补料发酵生产丁醇的工艺，属于生物化工技术领域：
。在菌体发酵的指数生长期10—20h通入0.1-0.5vvm空气，并在指数生长后期18—20h以碳氮比20—1001进行碳源和氮源的补加。发酵结束时通过蒸馏和真空精馏步骤将丁醇分离、提纯，制备产品。本发明的优点在于，丁醇浓度可显著提高。同时降低了固定设备的投资及能耗，降低了对设备的要求，节约了成本。
文档编号C12R1/145GKCN101429527 B发布类型授权 专利申请号CN 200810225373
公开日2012年5月23日 申请日期2008年10月31日
发明者刘娅, 刘宏娟, 周玉杰, 张建安, 程可可 申请人:清华大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3),