专利名称:来自紫菜属的硝酸还原酶,组成及其使用方法
来自紫菜属的硝酸还原酶，组成及其使用方法
背景技术：
许多植物的驯化与产量的极大提高相关。负责驯化的植物中产量的极大差异的特定基因的鉴定已经成为农业研究的重要焦点。
影响产量的基因的一个群是硝酸还原酶基因。这些基因用于提高作物植物，尤其是玉蜀黍中的氮的利用。所述基因可以用于改变植物的遗传组成，使得它们以目前的施肥标准可以更多产，或者以显著减少的肥料输入维持它们的生产率。提高的氮应用效率可以起因于氮肥的增强的摄取和同化和/或积聚的氮储备的后来的再流通和再利用。因此包含这些基因的植物可以用于提高产量。在氮肥的获得受限的发展中国家中和在氮利用的水平维持较高的发达国家中，提高玉米中的氮利用效率将提高每个单位的输入氮肥的玉米可收获的产量。氮利用的提高还允许降低农场上的输入成本(on-farm input costs)、降低对氮肥生产所需的不可再 生能源的利用和依赖、以及降低氮肥制造和农业应用对环境的影响。
近来已经付出了很多努力来通过植物中硝酸还原酶(NR)的过表达改善作物植物的氮效率。有一组研究人员已经应用了白花丹叶烟草(Nicotiana plumbaginifolia)&拟南芥菜(Arabidopsis thaliana)NR cDNA或基因在不同启动子例如35S CaMV(白花丹叶烟草)控制之下的表达。Ferrario, et al., (1995) “Effects of constitutiveexpressionof nitrate reductase in transgenic Nicotiana plumbaginifoliaL.1nresponse to varying nitrogen SupplyT3Ianta 196:288-294 ；andLhcbl*3::Nial*2(Arabidopsis thaliana)Nejidat, et al., (1997) “Increased protein content intransgenic Arabidopsis Thalinaover-expressing nitrate reductase activity’TlantScience 130:41-49。(参考文献)。尽管利用白花丹叶烟草植物中的35S CaMV::Nia-2基因检测到NR表达水平增加最多2-5倍((Foyer, et al., (1994) “Adaptations ofphotosynthetic electron transport, carbon assimilationand carbon partionng intransgenic Nicotiana plumbaginifolia plants tochanges in nitrate reductaseactivity”Plant Physiol.104:171-178),但没有观察到改善的氮效率。所有这些过表达这种酶的努力都没有导致在较低氮肥力(nitrogen fertility)下改善的生长。
因此，尽管存在一些改善NR效率的努力，仍然没有提供导致生长，生产率和/或农业作物植物产量的改善的令人满意的组合物或方法。由于这些和其它原因，存在对于本发明的需要。
发明简述
本发明提供了当前NR序列的多核苷酸、相关多肽和所有保守修饰的变体。本发明提供了 NR基因的序列。
本发明提出了改变作物植物，尤其是玉蜀黍的遗传组成的方法，以便这样的作物可以以目前的施肥更多产和/或以显著减少的肥料输入同样多产。因而本发明的这类应用不仅产量提高，而且肥料成本降低，相应的对环境的影响减小。
因此，在一个方面，本发明涉及包含编码NR基因的分离的多核苷酸序列的分离的核酸。本发明的一个实施方式是包含选自由以下构成的组的核苷酸序列的分离的多核苷酸:(a)包含SEQ ID NO:1、2、3、4、5或6的核苷酸序列；；以及(c)包含与SEQ ID NO:U
2、3、4、5或6具有至少70%的序列同一性的核苷酸序列，其中所述多核苷酸编码具有增加的NR活性的多肽。
本发明的组成包括包含选自由下列组成的组的氨基酸序列的分离的多肽:(a)包含 SEQ ID NO:7、8、9、10、11 或 12 的氨基酸序列以及(b)包含与 SEQ ID NO:7、8、9、10、11或12具有至少70%的序列同一性的氨基酸序列，其中所述多肽具有增加的NR活性。
在另一方面，本发明涉及包含所述的核酸的重组表达盒。另外，本发明涉及包含所述重组表达盒的载体。此外，包含所述重组表达盒的所述载体可以促进宿主细胞中所述核酸的转录和翻译。本发明还涉及能够表达本发明的多核苷酸的宿主细胞。可以使用许多宿主细胞，例如但不限于，微生物、哺乳动物、植物、或昆虫。
在另一实施方式中，本发明针对转基因植物或植物细胞，包含本发明的核酸。包含本发明的多核苷酸的优选的植物包括而不限于:玉蜀黍(maize)、大豆、向日葵、高粱、油菜(canola)、小麦、苜猜、棉花、稻、大麦、番爺、及黍(millet)。在另一实施方式中,所述转基因植物是玉蜀黍植物或植物细胞。另一实施方式是来自可操作地连接到驱动在植物中的表达的启动子的本发明的转基因NR多肽的转基因种子。本发明的植物可以具有与对照植物相比改变的NR。在一些植物中，NR在营养组织、再生组织、或者营养组织和再生组织中是改变的。本发明的植物可以具有下列表型的至少一个，所述表型包括而不限于:提高的根质量、提闻的根长度、提闻的叶子大小、提闻的糖(ear)大小、提闻的种子大小、提闻的胚乳大小、和提闻的生物量。
本发明的另一 实施方式将是在基因组基因座处被遗传修饰的植物，其中所述基因组基因座编码本发明的NR多肽。
提供了用于提高植物中NR多肽的活性的方法。所述方法可以包括将本发明的NR多核苷酸引入植物中。
提供了用于减少或消除植物中NR多肽的水平的方法。所述多肽的水平或活性还可以在特定组织中被减少或消除，造成植物生长，生长速率或氮利用效率(NUE)的改变。减少NR多肽的水平和/或活性可以导致植物的较小的高度(stature)或较慢的生长。
附图简述
本发明可从下列详细描述和构成本申请一部分的所附附图和序列表被更充分地理解。
图l.Porphyra perforata(PpNR SEQ ID NO:5)和条斑紫菜(P.yezoensis) (PyNRSEQ ID NO: 10)之间的肽序列比较。PpNR和PyNR具有大约94%同一性。相同的氨基酸残基为粗体形式，类似的氨基酸为下划线形式。
图2.从Pichia angusta中基于已公开的序列(GenBank登录号Z69783)克隆的酵母硝酸转运蛋白YNTl。来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的组成性启动子甘油醛_3_磷酸脱氢酶(GAP)驱动的具有组氨酸营养缺陷型选择标记物的YNTl (p3.5GAP-YNT1)利用毕赤酵母EasyComp转化试剂盒(Invitrogen)被整合入巴斯德毕赤酵母菌株KM71 (Invitrogen)的His4基因座。通过PCR，重组菌株被确认为携带YNTl表达盒。包含YNTl的KM71系被利用被GAP启动子驱动的具有zeocin选择标记物的来自Porphyra perforate的硝酸还原酶基因PPNR(pAOXGAP-PPNR)重转化，所述基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组的AOXl基因座。体内测定硝酸还原酶活性。30°C下在丰富培养基(YPD)中培养四种转化体和KM71野生型过夜。收集酵母细胞并且用水洗涤两次，然后重悬浮在含有5mM NaNO3的20碰MOPS,pH6.5和1%葡萄糖中。30°C温育I小时之后，收集上清液用于亚硝酸盐测定，所述亚硝酸盐测定利用I %磺胺，0.01% N-(1-萘基)亚乙基-二胺二盐酸盐和15% (v/v)H3P04进行。与KM71野生型菌株相比，在携带PPNR的转化体中检测到强的NR活性。
图3.利用被GAP启动子驱动的具有Zeocin选择标记物的来自条斑紫菜的硝酸还原酶基因PYNR(pAOXGAP-PYNR)重转化包含YNTl的KM71系(见图2)，所述基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组的AOXl基因座。在本例子中，如前体内测定来自两种转化体和KM71野生型的硝酸还原酶活性。检测来自携带PYNR的转化体的NR活性，与KM71野生型菌株比较。然而，PYNR活性比巴斯德毕赤酵母中的PPNR弱得多。
图4.从Pichia angusta基于已公开的序列(GenBank登录号Z49110)克隆酵母硝酸还原酶YNR1。利用被GAP启动子驱动的具有Zeocin选择标记物的硝酸还原酶基因YNRl (pAOXGA P-YNRl)重转化包含YNT I的KM71系，所述基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组的AOXl基因座。具有最佳Vmax的转化体被用于动力学研究。
基于已公开的基因组序列(GenBank登录号AF153448)从玉蜀黍B73(从两种截短的EST组装)克隆玉蜀黍硝酸还原酶ZmNR。克隆的ZmNR相对于AF153448具有三个不同的氨基酸残基。利用被GAP启动子驱动的具有Zeocin选择标记物的硝酸还原酶基因ZMNR(pAOXGAP-ZMNR)重转化包含YNTl的KM71系，所述基因整合入巴斯德毕赤酵母基因组的AOXl基因座。具有最佳Vmax的转化体被用于动力学研究。
携带YNT1/YNR1，YNT1/ZMNR，或YNT1/PPNR的转化体和KM71野生型在丰富培养基(YPD)中在30°C下培养过夜。收集酵母细胞并且用水洗涤两次，然后重悬浮在包含从O直至 30mM 的 24 种不同浓度的 NaNO3(0,0.02,0.04,0.06,0.08,0.1,0.12,0.14,0.16,0.18，0.2,0.3,0.4,0.6,0.8，1,2,4,8,10，15，20，25 和 30mM)的具有 I % 葡萄糖的 20 μ M MOPS,pH6.5，*20yMMES，pH5.5，*20yMTris，pH7.5*。如上所述测定还原的亚硝酸盐。评价l/2Vmax时的底物浓度为Km。YNRl，ZMNR,和PPNR的Km和优选的PH (具有最佳Vmax)总结在表中。请注意尽管该图表显示了 YNRl为该表中最低的系，但仅仅只有十分之一体积的YNRl材料用于本实验，因此YNRl具有本实验中最佳的Vmax。
图5.建立了由UBI启动子和/或玉蜀黍硝酸还原酶ZMNR启动子驱动的PPNR和PYNR构建体。产生的构建体PHP27800，PHP27801, PHP28335，和PHP28334被用于玉蜀黍转化。对于UB1:Porphyraperforata NR 1:1分离的转基因玉蜀黍在维持ImM KNO3作为唯一氮源的水栽培养基中生长至开花。在生长过程中鉴定包含转基因的植物。所有植物在开花不久之后收获。分离穗和其余植物，在鼓风箱中在70°C干燥72hr并且称重。每一事件的转基因植物的平均穗干重与对应无效物(null)的穗干重进行比较。对于转基因平均植物干重与对应的事件无效物进行类似的比较。用*标记的比较是统计学显著的(P > t =
0.1)。该图是实施例10描述的数据的图示。
序列简述
本申请提供了如下表I所示的NR序列的细节。
表I
权利要求
1.一种分离的硝酸还原酶(NR)多核苷酸,其选自: (a).编码SEQID NO:7，8或9的多肽的多核苷酸； (b).SEQID NO:1，2或3所示序列组成的多核苷酸； (c).来自(a)或(b)的任一的分离的多核苷酸的简并物；和 (d).与(a)到(c)的任一的多核苷酸互补的多核苷酸。
2.根据权利要求
1的分离的多核苷酸，其编码NR多肽，所述NR多肽赋予在低肥力下增加的产量或氮利用效率。
3.—种载体,其包含至少一种权利要求
1的多核苷酸。
4.一种表达盒，其包含与启动子可操作连接的至少一种权利要求
1的多核苷酸，其中所述多核苷酸是有义方向的。
5.分离的多肽，其为SEQID NOS:7，8或9中的任一，所述多肽具有NR活性。
6.权利要求
5的分离的多肽，其中NR在植物中的表达导致与对照植物相比该植物产量增加，其中所述对照植物不包含编码NR的所述多核苷酸。
7.重组表达盒，其包含与启动子可操作连接的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码权利要求
5的多肽。
8.分离的多肽，其由SEQID NO:1，2或3的多核苷酸编码。
9.调节植物细胞中硝酸还原酶(NR)蛋白的水平的方法，其包括: (a)用与启动子可操作连接的NR多核苷酸转化植物细胞，其中所述多核苷酸是有义方向的；和 (b)表达所述多核苷酸充分的时间以调节所述植物细胞中的NR蛋白， 其中，所述NR多核苷酸为权利要求
1或2所述分离的多核苷酸，并且其中NR蛋白被增加。
10.调节植物中硝酸还原酶(NR)蛋白的水平的方法，其包括: (a)用与启动子可操作连接的NR多核苷酸稳定转化植物细胞，其中所述多核苷酸是有义方向的；和 (b)将所述转化的植物细胞再生为转化的植物，所述转化的植物表达足以调节该植物中NR蛋白水平的量的NR多核苷酸， 其中，所述NR多核苷酸为权利要求
1或2所述分离的多核苷酸，并且 其中与对照植物相比NR蛋白被增加，其中所述对照植物不包含编码NR的所述多核苷酸。
11.增加植物产量的方法，所述方法包括步骤: (a)将包含编码硝酸还原酶(NR)的多核苷酸的构建体导入植物细胞，其中所述NR多核苷酸与在植物细胞中有功能的启动子可操作地连接以产生转化的植物细胞，并且其中编码NR蛋白的所述NR多核苷酸选自: (1).编码SEQID NO:7，8或9的多肽的多核苷酸； (2).SEQ ID NO:7，8或9编码区中所示序列组成的多核苷酸；和 (3).来自(I)到(2)的任一的分离的多核苷酸的简并物； (4).与(I)到(3)的任一的多核苷酸互补的多核苷酸； (b)从所述转化的植物细胞再生转基因植物，其中所述NR在所述转基因植物的细胞中以足以保持或增加所述转基因植物产量的水平表达。
12.权利要求
11的方法，其中增加的产量包括增强的根生长，增加的种子大小，增加的种子重量，所述植物具有胚大小增加的种子，增加的叶大小，增加的幼苗活力，增强的吐丝，增加的穗大小或叶绿素含量。
13.权利要求
11的方法，其中所述植物在有限的氮肥力下生长。
14.权利要求
13的方法，其中所述植物的氮利用效率增加。
15.权利要求
13的方法，其中与所述植物的内源NR活性相比所述NR多核苷酸的NR活性增加。
16.权利要求
11的方法，其中所述NR多核苷酸的表达被磷酸烯醇丙酮酸脱羧酶(PEPC)启动子驱动。
17.权利要求
11的方法，其中编码NR的所述多核苷酸是组成性表达的。
18.权利要求
11的方法，其中编码NR的所述多核苷酸是诱导型表达的。
19.权利要求
11的方法，其中编码NR的所述多核苷酸以细胞特异，组织特异，或器官特异方式表达。
20.权利要求
11的方法，其中所述植物是双子叶植物。
21.权利要求
11的方法，其中所述植物是单子叶植物。
22.权利要求
11的方法，其中所述植物的产量与对照植物相比，其中所述对照植物不包含编码NR的所述多 核苷酸。
专利摘要
本文描述的NR酶发现于红藻Porphyra perforata(PpNR)和条斑紫菜(Porphyra yezoensis(PyNR))。本发明提供了涉及改变植物中的NR活性，氮利用和/或摄取的方法和组成。本发明涉及用于在低氮肥力的条件下具有保持的或增加的产量的植物生产方法。本发明提供了分离的硝酸还原酶(NR)核酸和它们编码的蛋白质。本发明进一步提供了重组表达盒、宿主细胞、和转基因植物。用编码NR酶的核苷酸序列转化的植物显示了改善的特性，例如增加的产量和生长。
文档编号C12N9/02GKCN101784656 B发布类型授权 专利申请号CN 200880103062
公开日2013年8月28日 申请日期2008年6月13日
发明者D·F·卢塞尔特, D·奥奈尔, C·R·西蒙斯, H·王 申请人:先锋高级育种国际公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (1),