在程序重排体细胞中的wnt途径刺激的制作方法

专利名称:在程序重排体细胞中的wnt途径刺激的制作方法
在程序重排体细胞中的WNT途径刺激
政府基金
本文描述的发明完全或部分地由对RJ的拨款5-R01-HD045022、5-R37-CA084198和5-R01-CA087869以及来自国立卫生研究院的NIH拨款HG002668支持。在本发明中美国政府具有某些权利。
对相关申请的交叉引用
本申请要求2007年8月31日提交的美国临时专利申请60/967，028和2008年8月6日提交的美国临时专利申请61/188，190的优先权利益，两者都通过引用在此并入。
发明背景
干细胞是能够自我更新并产生更多分化细胞的细胞。胚胎干(ES)细胞可以分化为共同构成身体的多种特化细胞类型。除巨大的科学兴趣之外，多能性的性质赋予人类ES细胞在再生医学(例如对于疾病的细胞/组织替换治疗)应用上巨大的临床希望。
当前若干不同的方法用于获得ES细胞。在一种方法中，ES细胞系源自于胚泡时期的正常胚胎内细胞团(参见美国专利号5，843，780和6，200，806，Thompson, J.A.etal.Science, 282:1145-7，1998)。第二种产生多能ES细胞的方法使用体细胞核转移(SCNT)。在该技术中，从正常卵移走细胞核，从而除去遗传物质。例如通过显微操作把供体二倍体体细胞的细胞核直接引入去核的 卵母细胞，或者把供体二倍体体细胞紧挨着去核的卵放置然后融合两种细胞。产生的细胞有发育成早期胚胎的潜能，从该早期胚胎中可以获得包含产生内细胞团的干细胞的部分。在第三种方法中，把人类细胞的细胞核移植进入不同于供体细胞的物种的去核动物卵母细胞。参见，例如美国专利公开号20010012513。产物嵌合细胞用于生产多能ES细胞，尤其是人类样多能ES细胞。该技术的缺点是这些嵌合细胞可能包含未知的病毒以及保留动物物种的线粒体。
当用于产生人类ES细胞时传统的ES细胞分离方法受到若干限制。这包括与细胞来源相关的伦理争议以及技术挑战。用于临床应用的ES细胞的生产性利用的一个显著限制是与产生与单个病人遗传匹配的ES细胞相关的困难。存在对产生多能细胞的可选方法的重大需要。
发明概述
本发明提供了用于程序重排体细胞为较少分化状态的组合物和方法。在某些实施方案中组合物和方法允许体细胞程序重排为多能的胚胎干细胞样细胞(“ES样细胞”)。
在一个方面，本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在有胞外信号分子的情况下培养细胞以便细胞变得程序重排。
在一个方面本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在Wnt条件细胞培养基中培养细胞以便细胞变得程序重排。在某些实施方案中该方法包括培养体细胞以便诱导细胞变成多能的。在某些实施方案中fct条件细胞培养基包括fct3a条件培养基(Wnt3a-CM)。
在另一个方面本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使细胞与增加Wnt途径活性的试剂接触以便诱导细胞变成多能的。在一些实施方案中该试剂是可溶的、生物活性的fct蛋白质，例如Wnt3a蛋白质。在一些实施方案中该试剂选自:(i)例如通过与fct的细胞受体相互作用，模拟Wnt3a条件培养基或可溶的、生物活性的Wnt蛋白质效果的小分子；(ii)调节β连环蛋白和TCF/LEF家族成员之间的相互作用和/或调节TCF/LEF家族成员的表达或活性的试剂；(iii)抑制fct途径的内源抑制剂的表达或活性的试剂。
本发明提供了使用本发明的方法程序重排的体细胞。
包含Wnt3a激活剂和能够替代0ct4、Klf4和/或Sox2 (或其任何组合)的改造的表达的另外的程序重排试剂的细胞培养基是本发明另外的方面。本发明进一步的方面是(I)组合物，包括:(i)已经修饰以增加其0ct4、Klf4和/或Sox2，或这些的任何亚组表达的细胞；和(ii)Wnt途径调节剂，例如Wnt途径激活剂；⑵组合物，包括:⑴已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自0ct4、Klf4、和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii)Wnt条件培养基；(3)组合物，包括:
(i)已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自0ct4、Nanog、Lin28和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii) Wnt途径激活剂；和(4)组合物，包括:(i)已经修饰以增加其一种或更多种程序重排因子表达或胞内水平的细胞，其中该程序重排因子任选地选自0ct4、Nanog、Lin28和/或Sox2，或这些的任何亚组；和(ii)ffnt条件培养基。
本发明还提供了用于鉴定与一种或更多种其它试剂联合程序重排体细胞为较少分化状态和/或促进这样的程序重排的试剂的方法。在某些方法中，把体细胞与增加fct途径活性的试剂以及候选试剂接触。评价细胞的多能性特征。至少一种亚组的多能性特征的存在表明该试剂能够程序重排体细胞为较少分化状态。通过本发明鉴定的试剂然后可以通过把体细胞与该试剂接触用来程序重排体细胞。
本发明进一步提供了用于在需要治疗状况的个体中治疗状况的方法。在某些实施方案中，从个体获得体细胞并通过本发明的方法程序重排。在培养中程序重排的细胞可以扩增。在适于该细胞发育成需要的细胞类型或细胞谱系的细胞的条件下维持多能的程序重排细胞(其指的是原始的程序重排细胞和/或它们保留多能性性质的后代)。在一些实施方案中，使用流程，例如本领域已知的那些在体外分化细胞。把需要的细胞类型的程序重排细胞引入个体以治疗该状况。在某些实施方案中，从个体获得的体细胞包含一种或更多种基因中的突变。在这些情况下，在某些实施方案中首先例如通过引入一种或更多种野生型拷贝的基因进该细胞以便产生的细胞表达该基因的野生型形式，处理从个体获得的体细胞以修复或补偿该缺损。然后把该细胞弓I入该个体。
在某些实施方案中，在它们从个体分离之后改造从个体获得的体细胞以表达一种或更多种基因。可以通过引入基因或包括基因的表达盒进细胞来改造该细胞。引入的基因可以是可用于鉴定、选择和/或产生程序重排细胞目的的基因。在某些实施方案中该引入的基因有助于启动和/或维持程序重排状态。在某些实施方案中该引入的基因的表达产物有助于产生程序重排状态但是对维持该程序重排状态不是必要的。[0019]在某些其它实施方案中，本发明的方法可用于治疗需要功能性器官的个体。在该方法中，从需要功能性器官的个体获得体细胞，并通过本发明的方法程序重排以产生程序重排的体细胞。然后在适于该程序重排的体细胞发育成为需要的器官的条件下培养上述程序重排的体细胞，然后把该需要的器官引入该个体。[0020]在进一步的概述中，本发明提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使哺乳动物体细胞与调节fct途径的试剂接触以便该哺乳动物体细胞变成程序重排的。在本发明的某些实施方案中该方法包括程序重排哺乳动物体细胞为多能状态。在某些方面，本发明提供了产生诱导的多能干(iPS)细胞的方法的改进。例如，在某些方面本发明增强程序重排体细胞为多能性，所述体细胞没有被改造以表达c-Myc。在某些方面，本发明的方法易于产生同质的ES样集落。在一些实施方案中，本发明的方法增强同质的ES样集落的形成，而没有利用需要初始体细胞遗传修饰的选择步骤。
在本发明的某些实施方案中，该方法包括在Wnt条件培养基中培养细胞。在某些实施方案中，该方法包括在fct3a条件培养基中培养细胞。在某些实施方式中，该细胞是人类细胞。在某些实施方式中，该细胞是小鼠细胞。在某些实施方式中，该细胞是非人灵长类细胞。在某些实施方式中，该哺乳动物体细胞是终末分化的细胞。在某些实施方案中该细胞是成纤维细胞或免疫系统细胞(例如B或T细胞)。在某些实施方式中，该哺乳动物体细胞不是终末分化的细胞。例如，该哺乳动物体细胞可以是前体细胞，例如神经前体或造血前体细胞。在某些实施方 案中，该方法在体外实施。在某些实施方案中，接触细胞包括在包含试剂的培养基中培养细胞。在某些实施方案中，接触包括在包含试剂的培养基中培养细胞至少10天。在某些实施方案中，接触包括在包含试剂的培养基中培养细胞至少12或至少15天或至少20天。在某些实施方案中，遗传修饰该体细胞以包含编码可选择标记的核酸序列，其与内源多能性基因启动子可操作地连接从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择，而在其它实施方案中不遗传修饰该体细胞以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择的编码可选择标记的核酸序列。在某些实施方案中，修饰体细胞以在高于通常存在于该类型的体细胞中的水平表达或包含至少一种程序重排因子。在一些实施方案中，该程序重排因子是0ct4。在一些实施方案中，该程序重排因子是Sox2。在一些实施方案中，该程序重排因子是Klf4。在一些实施方案中该程序重排因子是Nanog。在一些实施方案中该程序重排因子是Lin28。在一些实施方案中该程序重排因子是0ct4和Sox2。在一些实施方案中该程序重排因子是0ct4、Sox2和Klf4。在某些实施方案中，不遗传修饰体细胞以在高于通常存在于该细胞类型的体细胞中的水平表达c-Myc。在某些实施方案中，还把细胞与调节Wnt途径的第二种试剂接触。在某些实施方案中，在包含外源可溶的、生物活性的Wnt蛋白质的培养基中培养体细胞。在某些实施方案中，该Wnt蛋白质是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，该方法进一步包括确认该程序重排的细胞是多能的。在某些实施方案中，在细胞群上实施该方法并且该方法进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。在某些实施方案中，该方法进一步包括给药程序重排的细胞至受试者。在某些实施方案中，在程序重排该细胞之后该方法进一步包括体外分化该细胞至需要的细胞类型。在某些实施方案中，该方法进一步包括给药该分化的细胞至受试者。
本发明还提供了治疗需要其的个体的方法，其包括:(a)自个体获得体细胞；(b)通过包括把哺乳动物体细胞与调节fct途径的试剂(例如Wnt途径激活剂)接触的方法程序重排至少一些体细胞；和(c)给药至少一些程序重排的细胞至该个体，任选地在分化该细胞成为一种或更多种需要的细胞类型之后。在一些实施方案中，该个体是人类。在一些实施方案中中，该方法在细胞群上实施并且进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的细胞。在一些实施方案中，该方法进一步包括体外分化该细胞和，任选地，给药该分化的细胞至需要针对细胞治疗有用的状况治疗的个体。例如，可以沿着需要的细胞谱系分化细胞，例如神经谱系、肌肉谱系等。
本发明进一步提供了组合物，其包括(i)已经修饰或处理以便在高于没有上述修饰或处理的情况的水平上表达或包含至少一种程序重排因子的哺乳动物体细胞；和(ii)增加fct途径活性并且有助于程序重排体细胞至多能状态的试剂。在某些实施方案中，该试剂是fct3a蛋白质。在某些实施方案中，该试剂是小分子。
本发明进一步提供了鉴定能够用于调节程序重排哺乳动物体细胞至多能状态的试剂的方法，包括:(a)在包含调节Wnt途径活性的试剂和候选试剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；和(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。
在某些实施方案中，该特性选自:集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。在某些实施方案中，已经修饰该细胞以表达至少一种程序重排因子。在某些实施方案中，该培养基是fct条件培养基。
在某些实施方案中，该培养基是Wnt3a条件培养基。在某些实施方案中，调节Wnt途径活性的试剂是fct3a蛋白质。在某些实施方案中，调节Wnt途径活性的试剂是小分子。在某些实施方案中，候选试剂是小分子。在某些实施方案中，方法包括鉴定能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排的试剂，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于增强哺乳动物体细胞程序重排为多能状 态。在某些实施方案中，步骤(b)包括确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。在某些实施方案中，该细胞表达至少一种程序重排因子。
本发明还提供了鉴定能够用于程序重排哺乳动物体细胞为多能状态的试剂的方法，包括:(a)把哺乳动物体细胞群与增加fct途径活性的试剂和候选试剂接触；(b)在细胞培养系统中维持该细胞适当的时期；和(C)确定具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在于所述培养系统中，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以高于不与该候选试剂接触的细胞预期具有的水平存在，该试剂被鉴定为能够用于程序重排哺乳动物体细胞为ES样状态。
在本发明的某些实施方案中，该特性选自:集落形态，ES细胞选择性表达的内源基因的表达，与ES细胞选择性表达的基因的表达控制序列可操作地连接的可检测标记的表达，当注入到免疫妥协小鼠时分化成为具有内胚层、中胚层和外胚层特性的细胞的能力，和参与形成存活至足孕的嵌合体的能力。
在某些实施方案中，增加Wnt途径活性的试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中，候选试剂是小分子。在某些实施方案中，该细胞表达至少一种程序重排因子。在某些实施方案中，步骤(b)包括确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以不同于不包含该候选试剂的培养基预期具有的水平存在，该候选试剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。
本发明还提供了程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括在有胞外信号分子的情况下培养细胞以便细胞变成程序重排的。在某些实施方案中，所述胞外信号分子是其与细胞受体的胞外域的结合启动或修饰该细胞中的信号转导途径的分子。在某些实施方案中，该信号转导途径是fct途径。
本发明还提供了鉴定能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态的Wnt途径调节剂的方法，包括:(a)在包含该Wnt途径调节剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群；(b)在适当的时期之后，确定在培养中维持细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该fct途径调节剂的培养基预期具有的水平存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为多能状态。
在某些实施方案中，该方法包括(i)测试至少10种Wnt途径调节剂；和(ii)鉴定一种或更多种fct途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少50 %的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。在某些实施方案中，该方法包括测试至少20种，至少50种，或至少100种Wnt途径调节剂。在一些实施方案中，该方法包括鉴定一种或更多种fct途径调节剂为对程序重排速度或效率比测试的至少75%，或至少90%的其它Wnt途径调节剂具有显著更大的影响。在某些实施方案中，测试的fct途径调节剂是小分子。在某些实施方案中，测试的fct途径调节剂在结构上相关。例如，它们可以是一组化合物，例如基于共同的核心结构合成的组合的化合物文库的成员，或者它们可以是例如通过在一个或更多个位点产生取代或添加修饰核心结构或先导化合物获得的衍生物。在某些实施方案中，如果在适当的时期之后，具有一种或更多种ES 细胞特性的细胞以大于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的数量存在，该fct途径调节剂被鉴定为能够用于增加程序重排细胞为ES样状态的速度或效率。在某些实施方案中，如果在适当的时期之后，具有一种或更多种ES细胞集落特性的细胞集落以大于不包含该Wnt途径调节剂的培养基预期具有的数量存在，该fct途径调节剂被鉴定为能够用于增加程序重排细胞为多能状态的速度或效率。例如，该方法可以产生增加的百分数的具有ES细胞集落特征的集落和/或该集落比在没有该Wnt途径调节剂的情况下更同质。
本发明进一步提供了细胞培养组合物，其包括:(a)包含Wnt途径调节剂的细胞培养基；和(b)复数的哺乳动物体细胞，其中(i)该细胞被遗传修饰或瞬时转染以表达一种或更多种程序重排因子；(ii)该细胞被遗传修饰以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接的编码可选择标记的核酸序列，从而允许已经程序重排为多能性的细胞的选择；或(iii)该细胞培养基包含一种或更多种替代除c-Myc以外的程序重排因子的小分子、核酸或多肽。
在某些实施方案中，细胞培养基包括Wnt_3a CM。在某些实施方案中，该培养基包含调节Wnt途径的小分子。[0035]在某些实施方案中，该一种或更多种程序重排因子选自:0ct4、Nanog、Sox2、Lin28和Klf4。本发明进一步提供了组合物，其包括:iPS细胞和调节，例如活化，Wnt途径的试剂。在某些实施方案中，活化fct途径的试剂是Wnt3a蛋白质。在某些实施方案中活化Wnt途径的试剂是小分子。
在某些实施方案中，本发明提供了调节Wnt途径的试剂在制造用于程序重排哺乳动物体细胞的药剂中的用途。
预期本文描述的所有实施方案都适用于本发明的多个方面。还预期当适当的时候本发明的多个实施方案及其要素可以与一种或更多种其它这样的实施方案和/或要素组合。
附图简述

图1.Wnt3a促进后生的程序重排。a.实验时间线的示意图。用DOX可诱导的慢病毒感染MEF，分为有和没有Wnt3-CM处理的培养物，然后用DOX诱导(第O天)。诱导后在固定时间结点启动G418选择，并且维持Wnt3a-CM处理7天的选择。维持DOX和G418直到评价抗性集落。b.来自在标准ES细胞培养基中过表达0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc或用Wnt3a_CM处理的MEF中G418抗性集落计数。c.有和没有Wnt3a_CM处理形成的G418抗性集落的相位图象。d.来自用存在和不存在Wnt3a-CM的不同程序重排因子组合感染的MEF的G418抗性集落计数。在有fct3a-CM而没有c-Myc转导的情况下G418抗性集落出现。e.用Wnt3a_CM处理形成的Myc[-]G418抗性集落的相位图象。在该实验中，在没有Wnt3a-CM的情况下没有观察到Myc[_]细胞集落。f.来自在存在(红色条带)和不存在(灰色条带)Wnt3a-CM的情况下过表达 0ct4/Sox2/Klf4 (Myc [-])或 0ct4/Sox2/Klf4/c-Myc (Myc [+])的 MEF 中 G418抗性集落计数。按照指示在诱导后第5天或第10天时启动G418选择并且在第20天时评价集落(在32cm2的区域) g.在0ct4/SoX2/Klf4诱导后20天时在0ct4_GFP细胞中使用流式细胞术比较GFP强度与自发荧光的散布图，显示GFP表达细胞群(用箭头指示)仅仅是用Wnt3a-CM处理的。h.用Wnt3a_CM处理而没有任何遗传选择衍生的GFP表达Myc [-]细胞的相位图象。
图2.在Wnt刺激的细胞中多能性的诱导。a-d.免疫染色显示在Wnt3a_CM处理的Myc [-]细胞中多能性标记Nanog(a-b)和SSEA-1 (c_d)的诱导。e_g.当皮下注射入SCID小鼠时Wnt3a-CM处理的Myc[_]系形成畸胎瘤。来自0ct4/Sox2/Klf4/Wnt3aCM iPS系的畸胎瘤表明三种胚层的分化的细胞与由V6.5mES注射形成的畸胎瘤相似。箭头指示(e)中的神经组织，(f)中的软骨，和(g)中的内胚层细胞，h.未选择衍生的0ct4/Sox2/Klf4/Wnt3aCMiPS系产生具有野灰色毛色和着色的眼睛的嵌合小鼠(如左边所示)(与野生型Balb/c小鼠对比，右边)，提供了对体细胞的贡献的证据。后代的毛色确认这里产生的0ct4/Sox2/Klf4/ffnt3aCM iPS系是有种系能力的(数据未显示)。
图3.无c-Myc逆转录病毒时Wnt/β连环蛋白刺激增强iPS集落形成。a.显示在ES细胞培养基、MEF条件培养基、Wnt3a过表达条件培养基和具有ICG001 (4 μ M)的Wnt3a过表达条件培养基中培养的0ct4/SoX2/Klf4过表达MEF中的G418抗性集落的计数。在诱导后第15天时开始选择，而在第28天时评价集落。维持Wnt3a-CM处理直到第22天。来自三次重复实验的计数的平均数用指示S.D.的误差线显示。b.显示在ES细胞培养基、Wnt3a过表达条件培养基和具有ICG-001 (4 μ Μ)的Wnt3a过表达条件培养基中培养的0ct4/SoX2/Klf4/c-Myc过表达MEF中G418抗性集落(在32cm2区域)的计数。在诱导后第10天时开始选择，维持Wnt3a-CM直到第17天，并在第20天时评价集落。c.无c_Myc转导时Wnt刺激促进iPS细胞的形成。这可以归因于:i)由关键内源多能性因子，例如0ct4、Sox2和Nanog的Wnt途径的直接调控，如ES细胞中的基因组研究暗示的(Cole et al.，2008)，ii)Wnt途径诱导的内源Myc (He et al.，1998 ;Coleet al.，2008)，或其它细胞增殖基因活化，加速形成iPS集落的顺序进程。
图4.(a)原始实验的时间线显示Wnt3a条件培养基促进iPS细胞产生的能力。在第2天时诱导多能性诱导因子的表达。按照指示评价GFP表达和集落形成。(b).Wnt3a促进过表达0ct4、Sox2、Klf4和c-Myc的细胞中的iPS细胞形成；图4C.Wnt3a促进过表达0ct4、Sox2、Klf4而没有c-Myc的改造的表达的细胞中的iPS细胞形成；(c)ffnt3a促进过表达0ct4、SoX2、Klf4而没有c-Myc的改造的表达的细胞中的iPS细胞形成。
图5.1CG-001 的结构。
发明详述
介绍和定义
本发明涉及用于程序重排体细胞，例如体外程序重排体细胞为多能性的组合物和方法。本发明提供了用于程序重排体细胞为较少分化状态的方法。在此产生的细胞被称为“程序重排的体细胞” (“RSC”)，或者在一些实施方案中如果程序重排为多能状态则为诱导的多能干(iPS)细胞。术语“体细胞”指的是除生殖细胞、存在于或从植入前胚胎中获得的细胞、或者在体外由上述细胞增殖产生的细胞以外的任何细胞。在一些实施方案中体细胞是“非胚胎的体细胞”，其表示不存在于胚胎或从胚胎中获得并且不由上述细胞在体外增殖产生的体细胞。在一些实施方案中体细胞是“成体体细胞”，其表示存在于除胚胎或胎儿以外的生物体或从其中获得或由上述细胞在体`外增殖产生的细胞。除非另有陈述用于程序重排细胞为较少分化状态的方法在体外实施，即，它们使用培养中维持的分离的体细胞操作。
本发明包括调节内源ES细胞转录因子表达的天然存在的信号分子为增强程序重排的可溶试剂的有希望的候选者的认识。本发明还包括调节所述天然存在的信号分子相互作用的生物学途径对增强程序重排(例如增加其速度和/或效率)有用的认识。本发明还包括调节所述天然存在的信号分子相互作用的生物学途径的试剂(无论天然存在或合成的，例如小分子)是增强程序重排的可溶试剂的有希望的候选者的认识。
如以下更详细描述的，本发明的某些实施方案至少部分地基于调节，例如激活Wnt途径在程序重排体细胞中有用的认识上。某些方法包括在体细胞中增加fct途径的活性以便至少一些细胞变成程序重排的，例如为多能状态。某些方法包括在fct条件培养基中培养体细胞以便至少一些细胞变成程序重排的，例如为多能状态。
本文使用的，程序重排指的是改变或逆转体细胞分化状态的过程。在程序重排前细胞可以是部分或终末分化的。程序重排包括体细胞的分化状态完全回复为多能状态。如本领域已知的，“多能(pluripotent) ”细胞具有分化成为或产生来源于全部三种胚胎胚层(内胚层、中胚层和外胚层)的细胞的能力并且一般具有在体外长期分裂的潜能，例如大于一年或超过30次传代。ES细胞是多能细胞的例子。程序重排还包括体细胞分化状态部分回复为专能状态。“专能(multipotent) ”细胞是能够分化成为一些而不是所有来源于全部三种胚层的细胞的细胞。因此，专能细胞是部分分化的细胞。成体干细胞是专能细胞。成体干细胞包括，例如造血干细胞和神经干细胞。程序重排还包括体细胞分化状态部分回复为使得当经受另外的操作(例如在此描述的那些)时细胞对完全程序重排为多能状态更敏感的状态。这样的接触可能引起细胞特定基因的表达，其表达有助于程序重排。在本发明的某些实施方案中，体细胞的程序重排导致体细胞呈多能的、ES样状态。在此产生的细胞被提及为程序重排的多能体细胞或诱导的多能干(iPS)细胞。
程序重排包括核酸修饰(例如甲基化)、染色质凝聚、后生变化、基因组印记等可遗传模式至少一些的改变，例如反转，其发生于受精卵发育为成体的细胞分化期间。程序重排不同于简单地维持存在的已经是多能的细胞未分化状态或维持存在的已经是专能细胞(例如造血干细胞)的细胞不到完全分化的状态。程序重排也不同于促进已经是多能或专能的细胞的自我更新或增殖，虽然本发明的组合物和方法也可以用于这样的目的。本发明的某些组合物和方法有助于建立多能状态。该方法可以在完全分化和/或限制为仅仅产生特定类型细胞的细胞上操作，而不在已经是专能或多能的细胞上操作。
按照本发明的方法用任何多种方法处理体细胞以产生程序重排。处理可以包括使细胞与有助于程序重排的一种或更多种试剂(“程序重排试剂”)接触。这样的接触可以通过在包括该试剂的培养 基中维持该细胞来实施。在一些实施方案中体细胞被遗传改造。可以遗传改造体细胞以表达下面描述的一种或更多种程序重排试剂。
在本发明的方法中体细胞一般说来可以在温度、pH及其他环境条件的标准条件下培养，例如作为粘附细胞于37°C在包含5-10% CO2的大气中在组织培养板中培养。如此中描述的适当地改变细胞和/或培养基以实现程序重排。在某些实施方案中，在有模拟细胞外基质一种或更多种特性或包括一种或更多种细胞外基质或基膜组分的材料的情况下培养体细胞。在一些实施方案中使用Matrigel 。其它材料包括蛋白质或其混合物，例如凝胶、胶原、纤连蛋白等。在本发明的某些实施方案中体细胞在有饲养层细胞的情况下培养。这样的细胞可以，例如是鼠或人来源的。如果需要它们可以被辐照，用例如丝裂霉素C的化学灭活剂化学灭活，或另外处理以抑制它们的增殖。在其它实施方案中不用饲养细胞培养体细胞。
使用本发明的方法通过体细胞程序重排产生多能或专能细胞有许多优点。第一，本发明的方法允许产生自体的多能细胞，其是特异于一个个体并与该个体遗传匹配的细胞。细胞来源于从该个体中获得的体细胞。一般说来，自体细胞比非自体细胞更小可能经受免疫排斥。第二，本发明的方法允许技术人员产生多能细胞而不使用胚胎、卵母细胞和/或核转移技术。中请人的结果证明(i)体细胞可以程序重排为ES样状态而不需要改造该细胞表达例如c-Myc的癌基因；和(ii)体细胞的程序重排可以至少部分地受到除改造该细胞以表达程序重排因子以外的方法影响，即，被使细胞与除能够被吸收并导致该细胞稳定的遗传修饰的核酸或病毒载体以外的程序重排试剂接触影响。特别地，本发明包括胞外信号分子，例如当细胞外存在时与细胞表面受体结合并激活胞内信号转导级联的分子，对程序重排体细胞有用的认识。本发明进一步包括通过除胞外信号分子的应用以外的方法活化这样的信号传导途径也对程序重排体细胞有用的认识。此外，本发明的方法增强根据形态学标准可检测的ES样细胞集落的形成，而不需要使用可选择标记。本公开因此反映了体外体细胞程序重排技术领域：
的若干根本上重要的进步。虽然本发明的某些方面在此使用fct途径信号传导例证，本发明的方法包括为了程序重排体细胞的其它信号传导途径的活化。[0054]以下给出对理解本发明的方面有用的某些术语的定义:
本文使用的“试剂”表示任何化合物或物质例如，但不限于，小分子、核酸、多肽、肽、药物、离子等。
“细胞培养基”(也在此称为“培养培养基”或“培养基”)是包含维持细胞生存力并支持增殖的营养成分的用于培养细胞的培养基。细胞培养基可以以适当的组合包含任何下列:盐、缓冲剂、氨基酸、葡萄糖或其它糖、抗生素、血清或血清替代物、及其他组分例如肽生长因子等。通常用于特定细胞类型的细胞培养基为本领域技术人员所知。在此提供一些非限制性的例子。
“细胞系”指的是典型地来源于单个祖先细胞或来自确定的和/或实质上相同的祖先细胞群体的很大程度地或实质上相同的细胞群体。细胞系可能已经或者可能能够在培养中维持持久的时间(例如数月、数年、无限的时期)。它可能经历了赋予细胞上无限培养寿命的自发的或者诱导的转化过程。细胞系包括本领域中照此确认的所有细胞系。可以理解随着时间的过去细胞获得突变和可能地后生的变化以致于细胞系的单个细胞的至少一些性质可能彼此不一致。
术语“外源的”指的是存在于除其天然来源以外的细胞或生物体的物质。例如，术语“外源核酸”或“外源蛋白质”指的是已经通过涉及人工的过程引入例如细胞或生物体的生物系统(在其中正常不发现它或在其中以较低量发现它)的核酸或蛋白质。如果被引入细胞或遗传物质的细胞的祖先该物质将被认为是外源的。相反，术语“内源的”指的是对生物系统来说是天然的物质。
“表达”指的是涉及产生RNA和蛋白质以及视情况而定分泌蛋白质的细胞过程，可适用时包括，但不限于，例如转录、翻译、折叠、修饰和加工。“表达产物”包括从基因转录的RNA和通过从基因转录的mRNA翻译获得的多肽。
本文使用的“遗传修饰的”或“改造的”细胞指的是已经通过涉及人工的过程引入外源核酸的细胞(或该 细胞遗传了至少一部分该核酸的后代)。该核酸可以例如包含对该细胞来说是外源的序列，它可以包含天然序列(即在该细胞中天然发现的序列)但是为非天然存在的排列(例如与来自不同基因的启动子连接的编码区)，或者天然序列的改变的形式等。可以通过任何适当的技术完成核酸转移进入细胞的过程。适当的技术包括磷酸钙或脂质介导的转染、电穿孔和使用病毒载体的转导或感染。在一些实施方案中该多核苷酸或其部分整合进该细胞的基因组中。假如相对于未修饰但在别的方面相同的细胞这样的移去或切除在细胞中引起可检测的改变，随后可以从基因组中移去或切除该核酸。
“同一性”指的是两条或更多条核酸或多肽序列相同的程度。在一个评价窗口上，例如在所关心的序列的长度上，所关心的序列和第二序列之间的百分数同一性可以通过下列计算:比对该序列，允许引入缺口以使同一性达到最大，确定该评价窗口内在相同残基对面的残基(核苷酸或氨基酸)数目，除以所关心的序列或第二序列(无论哪个更长)落入该窗口的残基总数，并且乘以100。当计算达到特定百分数同一性需要的相同残基数时，把小数四舍五入到最接近的整数。可以借助于本领域已知的多种计算机程序计算百分数同一性。例如，计算机程序例如BLAST2、BLASTN、BLASTP, Gapped BLAST等产生比对并提供所关心的序列之间的百分数同一性。如Karlin andAltschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA90:5873-5877,1993 中修正的 Karlin 和 Altschul 的算法(Karlin and Altschul, Proc.Natl.Acad.Sc1.USA 87:22264-2268,1990)并入了 Altschul 等的 NBLAST 和 XBLAST 程序(Altschul, et al., J.Mol.Biol.215:403-410,1990)。为了获得用于比较目的的有缺口的比对，如 Altschul 等描述的利用 Gapped BLAST (Altschul, et al.Nucleic Acids Res.25:3389-3402，1997)。当利用BLAST和Gapped BLAST程序时，可以使用各个程序的缺省参数。可以使用PAM250或BL0SUM62矩阵。执行BLAST分析的软件可通过国立生物技术信息中心(National Center for Biotechnologylnformation, NCBI)公开地得到。对于这些程序参见具有URLwww.ncb1.nlm.nih.rov的网址。在一个特定的实施方案中，使用具有NCBI提供的缺省参数的BLAST2计算百分数同一性。
本文使用的“分离的”或“部分纯化的”在核酸或多肽的情况下指的是与至少一种其它组分(例如核酸或多肽)分离的核酸或多肽，所述其它组分与该核酸或多肽在在其天然来源中发现时一起存在和/或当通过细胞表达，或在分泌多肽的情况下分泌时将与该核酸或多肽一起存在。化学合成或使用体外转录/翻译合成的核酸或多肽被认为是“分离的”。“分离的细胞”是已经从它最初被发现的生物体移走的细胞或这样的细胞的后代。任选地该细胞已经在体外培养，例如在有其它细胞的情况下。任选地随后把该细胞引入第二生物体或重新引入其从中分离的生物体(或者传下其的细胞)。
本文使用的术语“其功能与多能性相关的基因”指的是在正常情况下(例如无用来改变基因表达的基因工程或其它操作时)其表达发生在且一般局限于多能干细胞，并且照此对它们的功能一致性是决定性的基因。可以理解由功能上与多能性相关的基因编码的多肽可以作为母体因子在卵母细胞中存在。该基因可以由胚胎的至少一些细胞，例如遍及至少一部分植入前时期和/或在成体的生殖细胞前体中表达。
“调节”与其在本领域的使用一致地使用，即表示引起或促进所关心的过程、途径或现象中的性质或数量的变化、改变或修饰。无限制地，这样的变化可以是过程、途径或现象的不同组分或分支的相对强度或活性方面的增加、减少或变化。“调节剂”是在所关心的过程、途径或现象中弓I起或促进性质或数量的变化、改变或修饰的试剂。
术语“多能性因子”用来指其功能与多能性相关的基因的表达产物，例如由该基因编码的多肽。在一些实施方案中多能性因子是在组成成体动物身体的体细胞类型(除生殖细胞或其前体外)中通常基本上不表达的。例如，多能性因子可以是其在ES细胞中的平均水平是其在存在于成体哺乳动物身体中的终末分化细胞类型中的平均水平的至少50倍或100倍。在一些实施方案中，多能性因子是对维持体内ES细胞和/或使用常规方法衍生出的ES细胞的生存力或多能状态是必需的。因此如果编码该因子的基因被敲除或抑制(即其表达被消除或基本地减少)，ES细胞不形成、死亡或在一些实施方案中分化。在一些实施方案中，在ES细胞中抑制功能与多能性相关的基因的表达(引起，例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的减少)产生有活力但不再多能的细胞。在一些实施方案中，该基因特征在于，当该细胞分化成为终末分化细胞时其在ES细胞中的表达减少(引起，例如由该基因编码的RNA转录物和/或蛋白质的平均稳态水平至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的减少)。
本文使用的“多能性诱导基因”指的是其表达促进程序重排体细胞为多能状态的基因。“多能性诱导因子”指的是多能性诱导基因的表达产物。多能性诱导因子可以，但不必是，多能性因子。外源引入的多能性诱导因子的表达可以是瞬时的，即它可以在程序重排过程的至少一部分期间被需要以便诱导多能性和/或建立稳定的多能状态但是之后不被需要来维持多能性。例如，该因子可以诱导功能与多能性相关的内源基因的表达。这些基因可以然后维持程序重排细胞于多能状态。
在此“多核苷酸”与“核酸”可互换地使用表不核苷的聚合物。一般地本发明的多核苷酸由通过磷酸二酯键连接的在DNA或RNA中天然发现的核苷(例如腺苷、胸苷、鸟苷、胞苷、尿苷、脱氧腺苷、脱氧胸苷、脱氧鸟苷和脱氧胞苷)组成。然而该术语包括包含含有化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等的核苷或核苷类似物的分子，不管是否在天然存在的核酸中发现，并且对于某些应用这样的分子可能是优选的。当该应用指的是多核苷酸的情况，应理解提供DNA、RNA两者，以及在每种情况下单和双链的形式两者(以及各单链分子的互补物)。本文使用的“多核苷酸序列”指的是多核苷酸材料本身和/或生化表征特定核酸的序列信息(即用作 碱基缩写的字母的序列)。除非另有指示在此给出的多核苷酸序列以5'至3'方向存在。
“多肽”指的是氨基酸聚合物。术语“蛋白质”和“多肽”在此可互换地使用。肽是相对短的多肽，长度一般在大约2和60氨基酸之间。在此使用的多肽一般包含氨基酸，例如在蛋白质中最通常发现的20种L氨基酸。然而，能够使用本领域已知的其它氨基酸和/或氨基酸类似物。多肽中的一个或更多个氨基酸可以被修饰，例如通过添加诸如碳水化合物基、磷酸基、脂肪酸基、用于缀合、功能化的接头等的化学实体。具有与其共价或非共价缔合的非多肽部分的多肽也被认为是“多肽”。示范性的修饰包括糖基化和棕榈酰化。多肽可以从天然来源纯化，使用重组DNA技术产生，通过诸如常规固相肽合成等的化学方法合成。本文使用的术语“多肽序列”或“氨基酸序列”指的是多肽材料本身和/或生化表征多肽的序列信息(即用作氨基酸名称缩写的字母或三字母代码的序列)。除非另有指示在此给出的多肽序列以N末端至C末端方向存在。
“多肽变体”指的是经氨基酸插入、缺失和/或取代的不同于天然存在的多肽的任何多肽。变体可以是天然存在的或使用例如重组DNA技术或化学合成产生的。在一些实施方案中氨基酸“取代”是用具有相似结构和/或化学性质的另一种氨基酸替换氨基酸，即保守氨基酸替换的结果。可以根据任何多种性质的相似性产生“保守的”氨基酸取代，例如涉及的残基的侧链大小、极性、电荷、可溶性、疏水性、亲水性和/或两亲性。例如，非极性的(疏水的)氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、甘氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性的(亲水的)、中性的氨基酸包括丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺。带正电荷的(碱性的)氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。带负电荷的(酸性的)氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。插入或缺失可以在从大约I至20氨基酸，例如I至10氨基酸的范围中。在有些情况下可以移去更大的结构域而基本不影响功能。在本发明的某些实施方案中可以通过对天然存在的酶的序列产生不超过总共5、10、15或20个氨基酸添加、缺失或取代获得变体序列。在一些实施方案中在多肽中不超过1%、5%、10%或20%的氨基酸是相对于原始多肽的插入、缺失或取代。可以通过比较特定多肽的序列与同源多肽(例如来自其它生物体)的序列并且使高同源区域(保守区域)中产生的氨基酸序列变化的数目达到最小值，或者通过用同源序列中发现的氨基酸替换氨基酸，因为在多种物种中保守的氨基酸残基很可能对于活性比不保守的氨基酸重要，从而获得确定哪些氨基酸残基可以被替换、添加或缺失而不消除或基本不降低所关心的活性的指导。[0070]本文使用的“纯化的”或“基本纯化的”表示指出的核酸或多肽在基本上没有其它生物大分子，例如多核苷酸、蛋白质等的情况下存在。在一个实施方案中，纯化多核苷酸或多肽以致它组成按重量计算至少90%，例如按重量计算至少95%，例如按重量计算至少99%的存在的多核苷酸或多肽(但是可以存在水、缓冲剂、离子和其它小分子，特别是具有小于1000道尔顿分子量的分子)。
在此“RNA干扰”与其在本领域的含义一致地用于指双链RNA(dsRNA)触发与该dsRNA的一条链具有互补性的相应的mRNA的序列特异性降解或翻译抑制的现象。可以理解dsRNA和mRNA链之间的互补性不需要为100%而是只需要足以介导基因表达抑制(也称为“沉默”或“敲低(knockdown)”)。例如，互补性程度是如此以至该链可以⑴指引RNA诱导的沉默复合物(RNA-1nduced silencingcomplex, RISC)中mRNA的断裂；或(ii)引起mRNA的翻译抑制。在某些实施方案中RNA的双链部分长度小于大约30核苷酸，例如长度在17至29核苷酸之间。在哺乳动物细胞中，可以通过把适当的双链核酸引入细胞或在细胞中表达此后胞内加工以在其中产生dsRNA的核酸实现RNAi。能够介导RNAi的核酸在此称为“RNAi试剂”。示范性的能够介导RNAi的核酸是短发夹RNA(shRNA)、短干扰RNA(siRNA)和微小RNA(microRNA)前体。这些术语是熟知的并且在此与它们在本领域的的含义一致地使用。siRNA—般包括彼此杂交形成双链体的两条分离的核酸链。它们可以体外合成，例如使用标准核酸合成技术。它们可以包括多种修饰核苷、核苷类似物并且可以包括化学或生物学修饰的碱基、修饰的主链等。本领域中已认识的用于RNAi的任何修饰都能够使用。一些修饰引起增加的稳定性、细胞摄取、效价等。在某些实施方案中siRNA包括长度大约19核苷酸的双链体以及长度1-5核苷酸的一或两个3'悬突，其可以由脱氧核糖核苷酸组成。shRNA包括包含由主要非自我互补区域分开的两个互补的部分的单一核酸链。互补的部分杂交以形成双链结构而非自我互补的区域形成连接该双链体的一条链的3'末端和另一条链的Y末端的环。shRNA经历胞内加工以产生siRNA。
微小RNA(miRNA)是以序列特异性方式抑制基因表达的大约21_25核苷酸(在哺乳动物系统中)的小的、非编码的单链RNA。它们在胞内由具有由包含经常包括一个或更多个不完全互补区域的双链体的短发夹(长度大约70核苷酸)组成的特征二级结构的前体产生。天然存在的miRNA 只与它们的目标mRNA部分互补并且一般通过翻译抑制起作用。在本发明中模仿内源微小RNA前体的RNAi试剂是有用的。在一些实施方案中，可以把编码茎-环结构茎部分或编码整个茎-环的序列插入包括至少一部分内源微小RNA初级转录物的核酸，例如代替编码内源微小RNA或最小的( 70核苷酸)微小RNA发夹的序列。
“程序重排因子”指的是例如在体外促进或有助于细胞程序重排的基因、RNA或蛋白质。在本发明与程序重排因子有关的方面中，本发明提供了其中程序重排因子是体外程序重排体细胞为多能性所关心的实施方案。体外程序重排体细胞为多能性所关心的程序重排因子的实例为0ct4、Nanog、Sox2、Lin28、Klf4、c-Myc,以及在体外程序重排体细胞的方法中可以替代一个或更多个这些因子的任何基因/蛋白质。“体外程序重排为多能状态”或“体外程序重排为多能性”在此用于指不要求并且一般不包括核或细胞质转移或细胞融合，例如与卵母细胞、胚胎、生殖细胞或多能细胞，的体外程序重排方法。本发明的任何实施方案或权利要求
可以明确地排除有关或涉及核或细胞质转移或细胞融合，例如与卵母细胞、胚胎、生殖细胞或多能细胞，的组合物或方法。[0074]“可选择标记”指的是当表达时给予细胞可选择的表型，例如对细胞毒性或细胞生长抑制试剂的抗性(例如抗生素抗性)、营养原养型或能够用作为从不表达该蛋白质的细胞中区分表达该蛋白质的细胞的基础的特定蛋白质的表达，的基因、RNA或蛋白质。其表达可以容易地检测的蛋白质，例如荧光或发光蛋白质或者作用于底物上产生有色、荧光或发光物质(“可检测标记”)的酶组成了可选择标记的亚组。与通常在多能细胞中有选择地或唯一地表达的基因天然的表达控制元件连接的可选择标记的存在使鉴别和选择已经程序重排为多能状态的体细胞成为可能。可以使用多种可选择标记基因，例如新霉素抗性基因(neo)、嘌呤霉素抗性基因(puro)、鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(gpt)、二氢叶酸还原酶(DHFR)、腺苷脱氨酶(ada)、嘌呤霉素-N-乙酰基转移酶(PAC)、潮霉素抗性基因(hyg)、多药抗性基因(mdr)、胸苷激酶(TK)、次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)和hisD基因。可检测标记包括绿色荧光蛋白(GFP)蓝色、青玉色、黄色、红色、橙色和青色荧光蛋白及其任何变体。发光蛋白质，例如萤光素酶(例如萤火虫或Renilla萤光素酶)也是有用的。对本领域技术人员明显的，本文使用的术语“可选择标记”可以指基因或该基因的表达产物，例如编码的蛋白质。
在一些实施方案中可选择标记赋予表达它的细胞相对于不表达它或以显著更低水平表达它的细胞增殖和/或生存优势。这样的增殖和/或生存优势一般当细胞在某些条件，即“选择性条件”下维持时存在。为了确保有效的选择，可以在一定条件下维持细胞群足够的时期以便不表达该标记的细胞不增殖和/或不生存并从群体中清除或者它们的数目减少到只有群体的很小部分。通过在选择性条件下维持细胞群以便大量或完全清除不表达该标记的细胞而选择表达赋予增殖和/或生存优势的标记的细胞的方法在此称为“正选择”，而该标记被称为是“对正选择有用的”。负选择和对负选择有用的标记也是在此描述的某些方法中所关心的。这样的标记的表达赋予表达该标记的细胞相对于不表达该标记或以显著更低水平表达它的细胞增殖和/或生存劣势(或者，考虑另一方面，不表达该标记的细胞相对于表达该标记的细胞具有增殖和/或生存优势)。因此当在选择性条件中维持足够的时期时表达该标记的细胞可以从细胞群中大量或完全清除。
当应用于分离的细胞时，术语“处理”等包括使该细胞经受任何种类的过程或条件或者在该细胞上实施任何种类的操作或`步骤。当应用于受试者时，该术语指的是对个体提供内科或外科的关注、照料或管理。该个体通常是生病的或受伤的，或相对于种群的平均水平的成员处于变为生病的增加的风险并且需要这样的关注、照料或管理。
本文使用的术语“Wnt”或“Wnt蛋白质”指的是具有Wnt蛋白质或其至少部分保留天然存在的蛋白质与fct受体结合并激活Wnt信号传导的能力的片段、变体或衍生物的天然存在氨基酸序列的多肽。除可能存在于种群中的Wnt序列的天然存在的等位变体之夕卜，可以理解事实上对于所有蛋白质，可以把多种改变引入在表I中的登录号下列出的序列(称为“野生型”序列)而基本不改变该多肽的功能(生物学)活性。这样的变体包括在术语“Wnt”、“Wnt蛋白质”等的范围中。
变体可以是，例如与全长Wnt至少80%、85%、90%、95%、98%或99% —致的多肽。变体可以是全长fct的片段。变体可以是天然存在的剪接变体。变体可以是与fct片段至少80%、85%、90%、95%、98%或99%—致的多肽，其中该片段长度为全长野生型多肽或其具有所关心的活性(例如与Wnt受体结合的能力)的结构域的至少50%、60%、70%、80%、85%、90%、95%、98%或99%。在一些实施方案中，从序列中的任何氨基酸位点开始并向C末端延伸，结构域长度为至少100、200、300或400氨基酸。优选避免本领域已知的消除或基本降低fct蛋白质活性的变异。在一些实施方案中，变体缺少全长多肽的N和/或C末端部分，例如缺少从任一末端的最多至10、20或50氨基酸。在一些实施方案中多肽具有成熟fct多肽的序列，由其表示在正常的胞内蛋白酶解加工期间(例如在共翻译或翻译后加工期间)除去一个或更多个部分(例如信号肽)的fct多肽。在一些实施方案中其中Wnt蛋白质不是以从天然表达它的细胞中纯化它的方式产生，该蛋白质是嵌合多肽，由其表示它包含来自两个或更多不同的物种的部分。在一些实施方案中其中fct蛋白质不是以从天然表达它的细胞中纯化它的方式产生，该蛋白质是fct衍生物，由其表示该蛋白质包括与fct不相关的另外的序列，只要那些序列基本不降低该蛋白质的生物活性。
使用本领域已知的试验，本领域技术人员会知道，或会容易地能够确定，特定的Wnt变体、片段或衍生物是否是功能性的。例如，可以使用标准蛋白结合测定评价fct多肽变体与Wnt受体结合的能力。适当的试验包括测定激活包含与编码可检测标记例如萤光素酶的核酸序列可操作地连接的TCF结合位点的报道构建体的转录的能力。一个试验涉及确定Wnt变体是否诱导β连环蛋白的磷酸化作用。可以使用任何适当的方法，例如免疫印迹法确定磷酸化状态。其它试验涉及测试变体或片段的Wnt的已知生物活性。参见，例如，Barker, N.andClevers, H., Nat Rev Drug Discov.5 (12):997-1014, 2006,其描述了适于鉴定调节Wnt途径活性的试剂的试验。这样的试验可以容易地适应于鉴定或证实激活fct途径活性的试剂的活性。在本发明的某些实施方案中功能性的变体或片段具有全长野生型多肽至少50%、60%、70%、80%、90%、95%或更多的活性。
“Wnt途径活性”或“Wnt信号传导”指的是刺激配体(例如Wnt蛋白质)与Wnt家族成员的受体结合之后跟着发生，最终导致基因转录中的改变，以及如果在体内，往往导致生物体中的特征生物学效应发生的一系列生化事件。
通过激活Wnt途径程序重排体细胞
本发明提供了激活Wnt途径对程序重排体细胞有用的认识。本发明提供了激活Wnt途径增加体细胞程序重排，例如当这样的细胞经受会引起至少一些细胞程序重排的处理时，的效率的另外的认识。“增加程序重排的效率”表示当细胞群经受程序重排处理时导致经历程序重排的细胞的百分比增加，一般在给定时期之后产生更大数目的程序重排细胞的单个集落。在本发明的一些实施方案中，按照本发明激活fct途径增加程序重排细胞的数目和/或程序重排细胞集落的数目和/或经历程序重排的细胞的百分比。本发明进一步提供了激活fct途径使没有遗传修饰的体细胞的程序重排能够增加它们的癌基因例如c-Myc的表达的认识。因此本发明提供了在另外涉及改造细胞以表达c-Myc的任何程序重排体细胞的方法中替代c-Myc的改造的表达的方法。在本发明的一些实施方案中，激活fct途径足以在否则程序重排不会发生的条件下允许程序重排。
本发明提供了用于产生程序重排体细胞的方法，包括调节，例如增加Wnt途径的活性。本发明进一步提供了在该方法中有用的组合物。在一个方面中，本发明提供了程序重排体细胞的方法，包括在该细胞中调节，例如增加fct途径活性。本发明进一步提供了用于体细胞程序重排的改进的方法，该方法包括使体细胞经受可以程序重排至少一些细胞的处理，其中改进包括在所述细胞中增加fct途径的活性。该处理可以是本领域已知的对程序重排体细胞有用的任何处理或被认为是能潜在用于该目的。在本发明的某些实施方案中使用fct途径激活剂，例如小分子、可溶Wnt蛋白质、或介导RNA干扰并由此抑制Wnt途径内源抑制剂的试剂增加fct途径活性。在某些实施方案中程序重排的体细胞在fct条件培养基中培养。在本发明的任何实施方案中，除非另有指示或从上下文显然的，“程序重排”可以指的是程序重排为多能状态。
Wnt是对一个广泛系列的发育和生理学过程重要的分泌蛋白质家族(Mikels，AJand Nusse, R.，Oncogene, 25:7461-7468,2006)。Wnts依次彼此相关并且在跨越多种物种的结构和功能中非常保守。因此在一个物种中显示活性的fct蛋白质可以用于其它物种以在这样的物种中激活fct途径并可以期望显示相似的活性。Wnt家族成员包括Wntl、Wnt2、Wnt2b(也称为 Wntl3)、Wnt3、Wnt3a、Wnt4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a、Wnt7b、Wnt7c、Wnt8、Wnt8a>ffnt8b>ffnt8c>ffntl0a>ffntl0b>ffntll>ffntl4>ffntl5 或 Wntl6。Wnt 基因和蛋白质的序列是本领域已知的。本领域技术人员可以在可公开得到的数据库(例如参见表I)中容易地发现Wnt家族成员及其他在此所关心的基因和蛋白质的基因ID、登录号和序列信息。
表1:Wnt途径蛋白质、效应物和调节剂
权利要求
1.一种程序重排哺乳动物体细胞的方法，包括使哺乳动物体细胞与下述接触: (I)包含分泌的fct蛋白的Wnt条件培养基；或选自下述的Wnt途径激活剂:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性Wnt蛋白，和激活Wnt途径的小分子GSK-3拮抗剂；和 (II)选自下述的程序重排因子:(i)0ct4;(ii)0ct4 和 Klf4 ;(iii)0ct4、Klf4和 Sox2， 由此将细胞程序重排为较少分化状态。
2.权利要求
1的方法，其中该方法包括: 在包含所述Wnt条件培养基或所述Wnt途径激活剂的培养基中培养该细胞至少10天。
3.权利要求
1的方法，其中使哺乳动物体细胞与fct途径激活剂和程序重排因子接触增加程序重排的体细胞集落的数目至至少5倍。
4.权利要求
1的方法，其中使哺乳动物体细胞与fct途径激活剂和程序重排因子接触增加程序重排的体细胞集落的数目至至少10倍。
5.权利要求
1的方法，其中所述fct条件培养基是Wnt3a条件培养基。
6.权利要求
1的方法,其中所述外源可溶的生物活性fct蛋白是Wnt3a。
7.权利要求
1的方法，其包含使哺乳动物体细胞与选自下述的第二种fct途径激活剂接触:结合Wnt受体并激活Wnt途径的第二种fct蛋白，和激活Wnt途径的第二种小分子GSK-3拮抗剂。
8.权利要求
1的方法，其中该细胞: a)是人类细胞； b)是终末分化细胞； c)是成纤维细胞； d)被修饰以在高于通常存在于该类型的细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子； e)不被遗传修饰；或 f)不被遗传修饰以在高于通常存在于该细胞类型的细胞中的水平上表达c-Myc。
9.权利要求
1的方法,进一步包括: a)确认该程序重排的哺乳动物体细胞是多能的；或 b)在程序重排该细胞后体外分化该程序重排的哺乳动物体细胞为需要的细胞类型。
10.权利要求
1的方法，其中该方法: a)进一步包括通过形态学标准鉴定程序重排的体细胞； b)不包括利用化学选择来选择程序重排的哺乳动物体细胞；或 c)进一步包括从未程序重排为多能状态的细胞中分离程序重排为多能状态的程序重排的哺乳动物体细胞。
11.一种组合物，包括(i)已经修饰或处理以便在高于没有上述修饰或处理的情况的水平上表达或包含至少一种程序重排因子的哺乳动物体细胞；和(ii)包含分泌的fct蛋白的fct条件培养基；或选自下述的fct途径激活剂:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性fct蛋白，和激活Wnt途径并有助于将体细胞程序重排为较少分化状态的小分子GSK-3拮抗剂。
12.权利要求
11的组合物，其中该哺乳动物体细胞:a)被修饰以在高于通常存在于该类型的哺乳动物体细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子； b)不被遗传修饰； c)不被遗传修饰以在高于通常存在于该类型的哺乳动物体细胞中的水平上表达c-Myc ;或 d)不被修饰以在高于通常存在于该类型的哺乳动物体细胞中的水平上表达或包含至少一种程序重排因子。
13.一种鉴定能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为较少分化状态的fct途径调节剂的方法，包括: (a)在包含该Wnt途径调节剂的培养基中培养哺乳动物体细胞群，其中所述细胞被遗传修饰或瞬时转染来表达0ct4、Sox2和Klf4 ;和 (b)在适当的时期之后，确定在培养中维持该细胞和它们的后代适当的时期后具有一种或更多种ES细胞特性 的细胞是否存在，其中如果具有一种或更多种ES细胞特性的细胞以不同于不包含该fct途径调节剂的培养基预期具有的水平存在，该Wnt途径调节剂被鉴定为能够用于调节哺乳动物体细胞程序重排为ES样状态。
14.一种组合物， 包括: (a)包含选自下述的Wnt途径激活剂的细胞培养基:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性Wnt蛋白，和激活Wnt途径的小分子GSK-3拮抗剂；和 (b)哺乳动物体细胞，其中(i)该细胞已被遗传修饰或瞬时转染以表达选自0ct4、Nanog、SoX2、Lin28和Klf4的一种或更多种程序重排因子；(ii)该细胞已被遗传修饰以包含与内源多能性基因启动子可操作地连接的编码可选择标记的核酸序列；或(iii)该细胞培养基包含一种或更多种替代除c-Myc以外的程序重排因子的小分子、核酸或多肽。
15.权利要求
14的组合物，其中: 该细胞培养基包括ffnt-3a CM。
16.一种组合物，包括:iPS细胞和包含分泌的Wnt蛋白的Wnt条件培养基或选自下述的Wnt途径激活剂:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性fct蛋白，和激活Wnt途径的小分子GSK-3拮抗剂。
17.Wnt途径激活剂在制备用于程序重排哺乳动物体细胞的组合物中的用途，其用于提供骨髓移植，用于治疗晚期癌症和恶性肿瘤、贫血、损害免疫系统的疾病和神经学疾病，其中所述fct途径激活剂选自下述:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性Wnt蛋白，和激活fct途径的小分子GSK-3拮抗剂。
18.Wnt途径激活剂在制备用于程序重排哺乳动物体细胞的组合物中的用途，其用于治疗选自下述的器官中的细胞的损害或缺乏:膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、肠、胆囊、肾、肝脏、肺、卵巢、胰腺、前列腺、脊髓、脾、胃、睾丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道和子宫，其中所述fct途径激活剂选自下述:结合Wnt受体并激活Wnt途径的外源可溶的生物活性Wnt蛋白，和激活fct途径的小分子GSK-3拮抗剂。
专利摘要
本发明提供了可用于程序重排体细胞的组合物及方法。本发明的组合物和方法对于例如产生或调节(例如增强)通过程序重排体细胞诱导的多能干细胞的产生有用。程序重排的体细胞能够用于许多目的，包括在个体中治疗或防止医学状况。本发明进一步提供了用于鉴定程序重排体细胞为多能状态和/或增强程序重排的速度和/或效率的试剂的方法。某些组合物和方法涉及调节Wnt途径。
文档编号A61K48/00GKCN101855338 B发布类型授权 专利申请号CN 200880112986
公开日2013年7月17日 申请日期2008年8月29日
发明者B·谢瓦利耶, A·马森, R·A·杨, R·富尔曼, R·耶尼施 申请人:怀特黑德生物医学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (2),