专利名称:碱性蛋白酶的制作方法
技术领域：
本发明涉及比活高且耐氧化性强、并且作为加入到洗涤剂中具有优良洗涤性的酶 的碱性蛋白酶。
背景技术：
蛋白酶常用于各种领域，例如包括洗衣用洗涤剂的各种洗涤剂、化妆品、沐浴剂、 食品改良剂、以及例如助消化剂和抗炎剂的药物。其中，洗涤剂用蛋白酶在工业上已大量生 产并且具有很大的市场规模。许多蛋白酶现已投放市场。
在大多数情况下，衣服上的污物不仅含有蛋白质，而且含有例如脂类和固体粒子 的多种组分。因此要求洗涤剂具有足够高的洗涤性，以便除去这些实际的复合污物。从这 一角度发现，碱性蛋白酶甚至在有高浓度脂肪酸的情况下能够保持酪蛋白水解活性，并且 即使污物不是仅由蛋白质组分组成，而是由例如蛋白质和脂类的多种组分组成时能够呈现 优良的洗涤性，并且其分子量为约43，000，本发明人对其申请了一专利(W099/18218)。
然而，已需要在比活、耐氧化性和洗涤性方面优于上述碱性蛋白酶并且可以用于 广泛组合物的洗涤剂的碱性蛋白酶。
发明内容
本发明人检索了这些主要来自酶变体的碱性蛋白酶。然而上述碱性蛋白酶在酶学 性能方面与以枯草杆菌蛋白酶为代表的丝氨酸蛋白酶完全不同，以致枯草杆菌蛋白酶的改 性位置没有提供有用信息。本发明人经过进一步研究发现，为了获得更好的比活、耐氧化稳 定性和洗涤性，同时保持上述碱性蛋白酶的性能的新型碱性蛋白酶，它们必需在其氨基酸 序列的预定位置具有一特定的氨基酸残基。
因此，本发明一方面提供了一种碱性蛋白酶，其中在SEQ ID N0:1的(a)84位、 (b) 104位、(c) 256位或(d) 369位或其相应位置的氨基酸残基缺失或者选自
在位置(a)
在位置(b)
在位置(c) 氨酸残基，和
在位置(d)
本发明另—
精氨酸残基， 脯氨酸残基， 丙氨酸、丝氨酸、
氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬
天冬氨酸残基。
方面还提供了一种碱性蛋白酶，其中在SEQ ID NO :1的(e)66或264 位、(f) 57、101-106 各位、136、193 或 342 位、(g) 46 或 205 位、(h) 54、119、138、148 或 195 位、(i) 247位、(j) 124位、(k) 107位或(1) 257位、或者在其相应位置的氨基酸残基缺失或 者选自[0013]在位置(e)谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫 氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，
在位置(f):赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸或丙 氨酸残基，
在位置(g):酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，
在位置(h):色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨 酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸或半胱氨酸残 基，
在位置(i):色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨 酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，
在位置(j)丙氨酸或赖氨酸残基，
在位置(k)赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，和
在位置(1)缬氨酸或异亮氨酸残基。
本发明又一方面还提供了一种编码该碱性蛋白酶的基因、含有该基因的重组载体 和含有该载体的转化体。
本发明再一方面还提供了 一种含有该碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。
附图简述
图1为描述碱性蛋白酶变体的洗涤性的图；图2为描述各个碱性蛋白酶变体的相 对比活的图；和图3为描述用氧化剂处理之后各个碱性蛋白酶变体的相对残余活性的图。
实施本发明的最佳方式
如上所述，在本发明的碱性蛋白酶中，在SEQ ID NO 1的(a)84位、(b) 104位、 (c) 256位或(d) 369位或者其相应位置的氨基酸残基缺失或选自在位置(a)精氨酸残 基，在位置(b)脯氨酸残基，在位置(c):丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬 酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基，和在位置(d)天冬氨酸残基；或者在SEQ ID NO 1的(e)66 或 264 位、(f) 57、101-106 各位、136、193 或 342 位、(g) 46 或 205 位、(h) 54、119、138、148 或 195位、(i) 247位、(j) 124位、(k) 107位或(1) 257位或者在其相应位置的氨基酸残基缺失 或者选自在位置(e)谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫 氨酸、半胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，在位置(f)赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、 苯丙氨酸、缬氨酸、精氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨 酸、天冬氨酸、谷氨酸、组氨酸、脯氨酸或丙氨酸残基，在位置(g)酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、 天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、 甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(h)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨 酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨 酸或半胱氨酸残基，在位置(i)色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬 氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基，在位置(j) 丙氨酸或赖氨酸残基，在位置(k)赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，和在位置(1)缬 氨酸或异亮氨酸残基。[0027]尤其是，本发明的碱性蛋白酶意思是具有SEQ ID NO 1所代表的氨基酸序列的碱 性蛋白酶，其中在选自上述(a)-(d)和(e)-(l)的位置的氨基酸残基已缺失或预定，或者意 思是另一碱性蛋白酶，其中在其相应位置的氨基酸残基已缺失或预定。它们可以是野生型 酶、野生型变体或人工变体。
“另一碱性蛋白酶”可以是野生型酶或野生型变体。优选具有耐氧化性和通过 SDS-PAGE测定的分子量为43，000士2，000的那种，其中更优选具有与SEQ ID NO 1的氨 基酸序列有至少60%同源性的氨基酸序列的那种。特别优选的是具有与SEQ ID N0:1的 氨基酸序列有至少60%同源性的氨基酸序列、具有耐氧化性的那种，在碱性范围(pH 8或 更大)工作，在PH 10下甚至在50°C处理10分钟时稳定地具有至少80%残余活性，受氟 磷酸二异丙酯(DFP)和苯甲烷磺酰氟(PMSF)抑制，并且通过SDS-PAGE测定的分子量为 43，000士2，000。本文所用的术语“具有耐氧化性”意思是当它在50mM过氧化氢溶液(含 5mM氯化钙)中在pH 10 (20mM
Britton-Robinson缓冲液)和20°C下处理20分钟时具有至少50%的残余活性 (合成底物试验)。
“具有SEQ ID NO :1所代表的氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括KP43[源 自芽孢杆菌菌株 KSM-KP43 (FERM BP-6532)，W099/18218]，而“具有与 SEQ ID N0:1 的氨 基酸序列有至少60%同源性的氨基酸序列的碱性蛋白酶”的例子包括具有SEQ ID NO 2 所代表的氨基酸序列的蛋白酶KP9860 [源自芽孢杆菌菌株KSM-KP9860 (FERM BP-6534)， W099/18218]、具有SEQ ID NO :3所代表的氨基酸序列的蛋白酶E-I [源自芽孢杆菌菌株号 D-6 (FERM P-1592)，JP740710]、具有SEQ ID NO :4所代表的氨基酸序列的蛋白酶Ya[源自 芽孢杆菌菌株Y(FERM BP-1029)，JP861210)、具有SEQ ID NO :5所代表的氨基酸序列的蛋白 酶 SD521 [源自芽孢杆菌菌株 SD-521(FERM BP-11162), JP910821]、具有 SEQ IDNO :6 所代 表的氨基酸序列的蛋白酶A-I (源自NCIB12289，W08801293)和具有SEQ ID NO :7所代表的 氨基酸序列的蛋白酶A-2(源自NCIB12513，W08801293)。其中，优选选自SEQ ID N0S. 2-7 的氨基酸序列或者与其有至少80%，更优选至少90%，特别是至少95%同源性的碱性蛋白 酶。
氨基酸序列的同源性是由Lipman-Pearson法计算的(Science，227， 1435(1985))。
“在相应位置的氨基酸残基”可以通过使用已知的算法，例如Lipman-Pearson算法 比较氨基酸序列来鉴定。在各蛋白酶的序列中“相应位置的氨基酸残基”的位置可以这种 方式通过对比该蛋白酶的氨基酸序列来确定。假定该相应位置存在于SEQ ID N0:1的氨基 酸序列中的三维相同位置，并且存在于该相同位置的氨基酸残基对该蛋白酶的特定功能带 来相似效果。
具体地说，(a)在SEQ ID NO=I的84位的氨基酸残基为赖氨酸残基。通过使用上 述方法，在其相应位置的氨基酸残基可以确定为SEQ ID NO :3的83位的赖氨酸残基。该氨 基酸残基优选为精氨酸。
(b)尽管SEQ ID NO=I的104位的氨基酸残基为亮氨酸残基，但是该氨基酸残基 或其相应氨基酸残基优选为脯氨酸残基。
(c)尽管SEQ ID NO 1的256位的氨基酸残基为甲硫氨酸残基，但是特别优选该氨基酸残基为丙氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、缬氨酸、亮氨酸、天冬酰胺、谷氨酸或天冬氨酸残基。
(d)尽管SEQ ID NO=I的369位的氨基酸残基为天冬氨酸残基，但是该氨基酸残 基或其相应的氨基酸残基优选为天冬酰胺残基。
(e)尽管SEQ ID NO=I的66或264位的氨基酸残基为天冬酰胺残基，但是该氨基 酸残基优选为谷氨酰胺、天冬氨酸、丝氨酸、谷氨酸、丙氨酸、苏氨酸、亮氨酸、甲硫氨酸、半 胱氨酸、缬氨酸、甘氨酸或异亮氨酸残基，并且特别优选天冬氨酸、丝氨酸或谷氨酸残基。更 优选的情况是在66位的氨基酸残基为天冬氨酸残基并且在264位的氨基酸残基为丝氨酸残基。
(f)尽管在SEQ ID NO :1的57、101-106、136、193和342的各自位置的氨基酸残基
为甘氨酸残基，但是该氨基酸残基优选为赖氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、苯丙氨酸、缬氨酸、精 氨酸、酪氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、色氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、 组氨酸、脯氨酸或丙氨酸残基。特别优选的情况是在57、136、193或342位置的氨基酸残基 为丙氨酸残基，或者在103位的氨基酸残基为精氨酸残基。
(g)尽管在SEQ ID NO 1的46或205位的氨基酸残基为苯丙氨酸残基，但是该氨 基酸残基优选为酪氨酸、色氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮 氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基。特别优选的情况是在 46位的氨基酸为亮氨酸残基。
(h)尽管在SEQ ID NO 1的54、119、138、148或195位的氨基酸残基为酪氨酸残
基，但是该氨基酸残基优选为色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨 酸、组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸或半胱 氨酸残基。特别优选的情况是在195位的氨基酸残基为丙氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、谷氨酰 胺、缬氨酸、色氨酸、甘氨酸、赖氨酸、苏氨酸、甲硫氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、丝氨 酸、精氨酸、天冬酰胺或组氨酸残基。
(i)尽管在SEQ ID NO 1的247位的氨基酸残基为赖氨酸残基，但是该氨基酸残 基优选为色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、 组氨酸、丝氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸或半胱氨酸残基。作为247位的该氨基酸残基，特别优 选精氨酸或苏氨酸残基。
(j)尽管在SEQ ID NO=I的124位的氨基酸残基为精氨酸残基，但是该氨基酸残 基优选为丙氨酸或赖氨酸残基。
(k)尽管在SEQ ID NO=I的107位的氨基酸残基为亮氨酸残基，但是该氨基酸残 基优选为赖氨酸、精氨酸、丙氨酸或丝氨酸残基，并且特别优选赖氨酸残基。
(1)尽管在SEQ ID NO=I的257位的氨基酸残基为丙氨酸残基，但是该氨基酸残 基优选为缬氨酸或异亮氨酸残基，并且特别优选为缬氨酸残基。
关于上面例证中优选的“另一碱性蛋白酶”，下面显示了相应于蛋白酶KP43的氨 基酸序列(SEQ ID NO 1)的(a)-(d)和(e)-(l)的位置和氨基酸残基的特定例子(表l_a， 表 1-b)。
表 1-a
权利要求
一种碱性蛋白酶，其中在SEQ ID NO1的195位的氨基酸残基选自色氨酸、苯丙氨酸、丙氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、苏氨酸、缬氨酸、组氨酸、丝氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、甘氨酸、天冬氨酸、脯氨酸、精氨酸或半胱氨酸残基。
2.一种编码权利要求
1所述的碱性蛋白酶的基因。
3.一种含有权利要求
2中所述基因的重组载体。
4.一种含有如权利要求
3中所述重组载体的转化体。
5.如权利要求
4的转化体，其中将微生物用作宿主。
6.一种洗涤剂组合物，它含有如权利要求
1中所述的碱性蛋白酶。
专利摘要
本发明提供了一种碱性蛋白酶；一种编码该碱性蛋白酶的基因；一种含有该基因的重组载体；一种含有该重组载体的转化体；和一种含有该碱性蛋白酶的洗涤剂组合物。本发明能够提供甚至在有高浓度脂肪酸下具有活性、具有高的比活性和洗涤性，并且可用作加入到洗涤剂中的酶的碱性蛋白酶。
文档编号C12R1/07GKCN101560509 B发布类型授权 专利申请号CN 200910007668
公开日2011年1月26日 申请日期2001年11月22日
发明者住友伸行, 佐伯胜久, 佐藤刚, 奥田光美, 小川晃范, 影山泰, 秦田勇二, 荒木裕行 申请人:花王株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1),