专利名称:以戊糖片球菌生物合成γ-氨基丁酸的方法
技术领域：
本发明涉及利用微生物合成Y-氨基丁酸的方法，特别是利用戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)合成Y -氨基丁酸的方法，属于生物技术领域：
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背景技术：
Y-氨基丁酸(γ-Aminobutyric acid, GABA)，又叫氨酪酸，是一种非蛋白质组成的天然氨基酸，是哺乳动物中枢神经系统一种主要的抑制性神经递质，具有重要的生理功能，如降低血压、利尿、镇痛安神、改善脑机能、增进脑活力、促进长期记忆、营养神经细胞、 改善更年期综合症等。当大脑长期缺乏GABA将会导致癫痫、帕金森等疾病。同时GABA还与脑衰老有关，其缺乏将导致老年人“耳不聪、目不明”。另外，GABA能促进精子的穿卵能力， 提高受精率，用于掩饰或降低具有不愉快味道的物质的不愉快风味印象的用途以及可以提高饲料利用率和日增重。Y-氨基丁酸正被广泛运用于医药、食品保健、化工及农业等行业。 GABA的生产主要可以通过化学合成和生物合成两条途径。化学合成反应条件剧烈，采用的化学溶剂具有毒性和腐蚀性，副产物多，缺乏安全性，主要应用于化工行业；生物合成法较化学合成法具有条件温和、环境污染相对较低、安全性高等优点。另外，由于微生物具有生长速度快、生长条件较简单、代谢过程特殊和分布广等特点，因此利用微生物生产GABA，不受资源、环境和空间的限制，具有显著的优点。
目前已经有一些利用不同种属的微生物生产GABA的报道。
陆兆新、杨胜远等在中国专利(专利号ZL 200510040758. 9)中公开了一种Y-氨基丁酸的生产方法，它是以唾液链球菌嗜热亚种(Str印tococcus thermophilus)为菌种， 作用于谷氨酸、谷氨酸盐、含谷氨酸或谷氨酸盐的物质，使谷氨酸的α-羧基发生脱羧作用，从而生成Y-氨基丁酸。
吴天祥等在中国专利(公开号CN101240301)中公开了固态发酵制备Y _氨基丁酸的方法，包括如下步骤首先以腐乳为原料筛选出红曲霉菌种；接着将红曲霉ΜΡ1104菌种置于斜面培养基上培养7d，使菌种活化；然后发酵菌种转接到培养基中，在温度30°C、转速150r/min下将活化菌种摇床培养2d，制备发酵种子，优选固态发酵条件和培养基；最后将菌种在上一步骤中优选的培养基和培养条件下进行培养生产GABA。该方法以大米为发酵原料，以红曲霉为菌种，具有食用安全性，可以作为保健食品直接食用；该方法的GABA产量和纯度均高，在最佳发酵条件与培养基下，GABA产量由初始的0. 21mg/g可达到0. 35mg/g, 最终产品的纯度可以达到45 %。
焦庆才等在中国专利(专利号ZL 200410064813. 3)中公开一种Y-氨基丁酸的酶法转化制备方法，该制备方法用L-谷氨酸和L-天冬氨酸两种混合酸性氨基酸作为原料， 将具有高活力L-谷氨酸脱羧酶的埃希氏菌hcherichia coli ASl. 505的菌体细胞与含有 L-谷氨酸和L-天冬氨酸混合物的转化液混合，28-45°C下进行酶促反应，然后用等电点结晶法或等电点结晶与离子交换树脂相结合的方法分离转化产物，得到高纯度的Y-氨基丁酸和L-天冬氨酸。该方法解决了两种酸性混合氨基酸高效分离的难题，得到了附加值较高的Y -氨基丁酸，并具有原料价格低廉，操作简便，转化时间短，生产成本低等优点。
梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187. 5)中公开了一种生物合成 Y-氨基丁酸的方法，其特征在于保藏编号为CGMCC NO. 1306的短乳杆菌(LactcAaci Ilus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基或MRS种子培养基，培养10 30小时后，以0. 5 % 5 %的接种量接种于GYP或MRS发酵培养基中，在25°C 35°C下静置培养4 120h，即得含菌体的发酵液，菌体离心分离收集；离心后的菌体再以灭过菌的去离子水洗涤，取0. 25 2g湿菌体，悬浮于15 50mL的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲体系中， L-谷氨酸钠含量为5mM 60mM，反应1 10小时，反应液离心即得含Y -氨基丁酸的溶液。梅乐和等在中国专利(专利号ZL 200510049187. 5)中还公开了一种控制pH发酵生产 Y-氨基丁酸的方法。其特征在于保藏编号为CGMCC NO. 1306的短乳杆菌(LactcAaci Ilus brevis)，经琼脂斜面培养基活化后，转接于GYP种子培养基中，培养25 35小时后，以 5 10%的接种量接种于发酵罐中，发酵罐装液量为1 3L，搅拌转速为50 150r/min， 在30°C下静置培养，对其进行pH控制发酵，发酵培养约25 40小时，待菌体生长进入稳定期，PH值回升后，连续流加1 3mol/L的盐酸，发酵培养基pH控制在5. 0 5. 6，继续培养约40 60h，即得含γ -氨基丁酸的发酵液。
郭晓风等在中国专利(专利公开号CN101102683)中公开了一种涉及含有Y-氨基丁酸的食品的生产方法，其包括使酵母或其处理物作用于糖和/或糖代谢中间体，或者是作用于糖或糖代谢中间体和谷氨酸或其盐，其中，上述酵母具有在糖或糖代谢中间体存在下通过发酵反应生产Y-氨基丁酸的能力。
蒋冬花等在中国专利(专利公开号CN101302480)中公开了一种高产Y _氨基丁酸红色红曲霉Mr-5菌株及其筛选方法和用途。该发明的高产GABA红色红曲霉(Monascus ruber Mr-5)菌株，其保藏编号为CCTCC NO :M208043，保藏地为中国典型培养物保藏中心。另外还公开了上述的红色红曲霉Mr-5菌株的筛选方法以及用途和用于Y-氨基丁酸的合成的方法，采用生物法合成Y-氨基丁酸的方法所得的发酵液中含6 9g/L的γ-氨基丁酸。
崔晓俊等在中国专利(专利公开号CN101311273)中公开了一种生物合成的 Y-氨基丁酸制剂的方法，该产品按重量百分比含有5%至60%的Y-氨基丁酸。上述的生物合成的Y-氨基丁酸制剂的制备方法按以下步骤进行首先将乳酸链球菌种接种到250mL由葡萄糖、玉米浆粉、脱脂豆粕粉、味精组成的发酵种子培养基，形成发酵液，将发酵液引入高速离心机中离心形成清液，将清液在40°C下，加入250mg/L壳聚糖，搅拌絮凝， 将经絮凝的待滤发酵液通过板框过滤机，得到滤清液，滤清液经阳离子树脂交换床进行离子交换，待离子交换树脂饱和后，去离子水洗脱，将谷氨酸全部洗脱，然后用氨水洗脱提取 Y-氨基丁酸。
曹郁生等在中国专利(专利公开号CN101333508)中公开了一种高产Y _氨基丁酸的短乳杆菌，其特征和工艺方法步骤为经鉴定为Lactobacillus brevis (短乳杆菌)， 国家菌种保藏号LactcAacillus brevisCCTCCM 208054。将保藏于MRS琼脂斜面的短乳杆菌，转接于MRS液体培养基，经活化后，以2-5 %的接种量接种于MRSG液体培养基，于 25-30°C培养60-90h，发酵液中的Y -氨基丁酸达到50_145mM。曹郁生等还在中国专利(专利公开号CN101333M8)中公开了一种利用短乳杆菌制备Y _氨基丁酸的方法，其工艺方法
4步骤为1.利用MRS液体培养基将短乳杆菌活化后，以5%的接种量接种于MRSG发酵培养基，34°C培养40-60h，4°C离心收集菌体；2.利用无菌生理盐水洗涤2次后悬于含IO-IOOmM 谷氨酸钠、PH5. 2的醋酸缓冲液中，34°C反应1 8h，离心后即为含Y -氨基丁酸的溶液。
赵景联等在文摘(生物工程学报，1989，5( :124-128)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，与1 %谷氨酸溶液进行间歇反应、连续搅拌式反应及连续柱式反应生产GABA。间歇反应证转化率达到了 100%;连续搅拌式反应在三角瓶反应器中进行，以6ml/h的流速输入底物溶液和输出反应液，转化率达85% ；连续柱式反应器中进行，控制流速12ml/h，转化率达95%。
章汝平等在文摘(长沙电力学院学报(自然科学版)，1998，13 (4) :433-435)中报道了用海藻酸钙包埋法将大肠杆菌细胞制成固定化细胞，对后道味精母液提取谷氨酸后的废液进行转化生产GABA，获得了 GABA含量达到了 98. 94%，收率为49. 65%。
Kono I 等在文摘(Biosci. Biotechnol. Biochem.，2000，64 (3) :617-619)中介绍了对Koji制作中GABA的变化，GABA含量达到了 120 μ g/g。
Wang JJ 等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol，2003，30 :669-676)中报道了利用 Monascus purpureus NTU601 进行固体发酵，GABA 含量达到了 5004mg/kg。
Su YC 等在文摘(J Ind Microbiol Biotechnol, 2003, 30 (1) :41-46)中报道了采用 Monascus purpureusCCRC31615 进行固体发酵，GABA 含量达到了 1200mg/kg。
Nomura M等在文摘(J Dairy Sci. , 1998,81 :1486-1491)中介绍了从生产奶酪的菌株中分离到一株Lactococcus Iactis 01_7，用于奶酪生产，奶酪的GABA的含量达到了 383mg/kg。
许建军在其博士学位论文(江南大学，2004年2月)中报道了从乳酸菌中筛选到了高产GABA的Lactococcus Iactis菌株，25L罐发酵72h，发酵液的GABA达到了 250mg/100ml。
刘清等在文摘(氨基酸和生物资源，2004，26 (1) 40-43)中也对高产GABA乳酸菌筛选和发酵条件进行了报道，发酵液中的GABA达到3. lg/1。
Yokoyama S 等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2002, 93(1) :95-97)中报道了利用 Lactobacillus brevis IF0-12005 对酒糟进行发酵，GABA 的含量达到了 10. 18mM，通过离心、絮凝、脱色和脱臭处理获得了较好的GABA溶液，可用于食品强化GABA。
爱宕世高等在文摘(食品i科学，2001，No. 8,81-85)中报道了采用 Lactobacillus plantarum利用含有米糠抽提液的培养基发酵生产GABA，在干粉含量达到了 5%。
Komatsuzaki N 等在文摘(Food Microbiology, 2005, 22 :497-504)中报道了从日本传统发酵食品中分离到了 Lactobacillus paracasei用于GABA生产，GABA浓度达到了 302mMo
Takahashi T 等在文摘(Journal of Bioscience and Bioengineering, 2004, 97(6) :412-418)中报道筛选到了 Saccharomyces cerevisiae UT-1 的 GABA 转氨酶和琥珀酸半醛脱氢酶缺陷突变型菌株GAB7-1和GAB7-2，其发酵液中GABA浓度分别达到了 0. 4mM 和0. 42mM，较野生株分别提高了 2. O和2. 1倍。[0024]Ijsseldijk 等在美国专利(United States Patent, US5472718A)中公开了利用含有保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的酸奶加入到牛奶中，生产奶酪，所获得的奶酪具有较大的多孔性结构，质地大大改善，并在其中检测到了微量GABA。
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)是一种革兰氏阳性、兼性厌氧、不运动、 能进行发酵代谢产生乳酸、不产气、不能还原硝酸盐、不液化明胶的无芽孢的片球菌，已广泛应用于香肠、畜产品、水产品、黄瓜、青豆、豆奶、干酪和青贮饲料等产品的发酵，具有较好的安全性。虽然Pediococcus pentosaceus在食品和饲料上已经获得广泛使用，但目前尚未见有关于利用戊糖片球菌生物合成Y-氨基丁酸的报道。
发明内容
本发明的目的在于提供利用戊糖片球菌细胞或其谷氨酸脱羧酶转化外源谷氨酸或谷氨酸钠生产Y-氨基丁酸的方法和通过在发酵培养基中添加外源谷氨酸或谷氨酸钠利用戊糖片球菌深层发酵合成Y-氨基丁酸的方法，可以生产高含量的Y-氨基丁酸，大大降低生产成本，属于生物技术领域：
。转化液成分简单，无毒副产物，只需对其GABA进行简单的提取和纯化即可做为食用添加剂。
本发明人通过自行从泡菜中分离或从微生物菌种保藏中心经过购买戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)进行试验’结果均发现戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)都具有较高的谷氨酸脱羧酶活性。通过进一步研究确定了利用戊糖片球菌 (Pediococcus pentosaceus)细胞转化法禾口以戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)为菌种深层发酵生物合成γ-氨基丁酸溶液的生产工艺。
本发明的方法是
一、利用含有高谷氨酸脱羧酶活性的戊糖片球菌细胞直接转化底物，只需提供合适的缓冲条件或通过滴加酸碱控制反应PH，转化体系中成分少，副产物少，无有害物质存在，作为食品、药品的原材料安全、可靠。整个工艺流程消耗的物质和能量少，产生的废弃物少，有利于环保。
二、通过对戊糖片球菌进行培养，离心收集菌体，对菌体进行破碎，取破碎后的悬浊液或再次离心后的上清液与谷氨酸或谷氨酸钠混合，然后在合适的缓冲条件或通过滴加酸碱控制反应PH和在一定温度下进行生化反应，从而获得Y-氨基丁酸。酶催化反应体系中成分少，副产物少，无有害物质存在，作为食品、药品的原材料安全、可靠。整个工艺流程消耗的物质和能量少，产生的废弃物少，有利于环保。
三、通过以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)为菌种，通过逐级活化和放大，接入发酵罐进行分步控制发酵条件，使高谷氨酸脱羧酶活力细胞获得最大限度的增殖， 然后在适宜发酵条件下作用于外源谷氨酸或谷氨酸钠，深层发酵生产高含量Y -氨基丁酸。采用分步控制发酵条件可以解决细胞繁殖与发酵产物累积的发酵条件不一致的矛盾， 深层发酵生产Y-氨基丁酸的方法，可以生产高含量的Y-氨基丁酸，大大降低生产成本， 简化发酵工艺。
本发明的获得的Y-氨基丁酸的分子量为103. 1，结构式为[0033]本发明是这样实现的通过戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)或其谷氨酸脱羧酶作用于谷氨酸或谷氨酸钠，使谷氨酸或谷氨酸钠发生脱羧基作用生成Y -氨基丁酸。或者通过以戊糖片球菌(Pediococcuspentosaceus)为菌种进行深层发酵合成高含量 Y-氨基丁酸。
γ -氨基丁酸的生产方法有如下形式
1、菌禾中戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)。
2、培养基
MRS培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸膏5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵 2g/L，乙酸钠 5g/L，葡萄糖 20g/L，MgSO4 · 7H20 0. 58g/L，MnSO4 · H2O 0. 19g/L，吐温 80 1ml， 调节 ρΗ7· 0，121°C 灭菌 15min。
MRS固体培养基蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母浸膏5g/L，K2HPO4 2g/L，柠檬酸二铵 2g/L，乙酸钠 5g/L，葡萄糖 20g/L，MgSO4 · 7H20 0. 58g/L，MnSO4 · H2O 0. 19g/L，吐温 80 1ml，调节 pH7. 0，琼脂 10g/L。121°C 灭菌 15min。
TYG培养基胰蛋白胨5g/L，酵母浸膏5g/L，葡萄糖10g/L，乙酸钠5g/L，调节 ρΗ7· 0，121°C 灭菌 15min。
马铃薯汁复合增殖培养基马铃薯200g于IL水中煮沸30min，纱布过滤去渣。在清液中加入葡萄糖20g/L，10g/L蛋白胨，5g/L酵母膏，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，调节 ρΗ7· 0，121°C 灭菌 15min。
黄豆芽汁复合增殖培养基黄豆芽200g于IL水中煮沸30min，纱布过滤去渣。 在清液中加入西红柿汁(按GB/T16347-1996.乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验制备)50ml，葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，调节 ρΗ7· 0，121°C 灭菌 15min。
麦芽汁复合增殖培养基在IL麦芽汁(5波美度)(参照中国科学院微生物研究所《常见与常用真菌》编写组的《常见与常用真菌》进行制备)中加入西红柿汁(按GB/ T16347-1996《乳酸菌饮料中乳酸菌的微生物学检验》制备)50ml，葡萄糖20g/L，蛋白胨 10g/L，酵母膏5g/L，柠檬酸二铵2g/L，乙酸钠5g/L，调节pH7.0，121°C灭菌15min。
3、细胞转化方法通过将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)经活化后， 接种于MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基等培养基，于25 37°C培养12h，作为种子液，再接种到MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、 麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基等培养基进行扩大培养M 36h，于 6000 lOOOr/min离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的溶液或悬浊液混合， 在pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，从而获得含、-氨基丁酸的溶液。
4、酶法转化方法通过将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)经活化后，接种于MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基等培养基，于25 37°C培养12h，作为种子液，再接种到MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基等培养基进行扩大培养M 36h，于6000 lOOOr/min离心收集菌体，然后参照《酶工程》(郭勇主编，中国轻工业出版社，2000年)所述方法对戊糖片球菌的谷氨酸脱羧酶进行提取。再将酶液与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合， 在pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应Ih 2d，从而获得含Y -氨基丁酸的溶液。
7[0045]5、深层发酵方法以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)为生产菌种，先进行活化，后接入种子培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌培养12 Mh，将种子液按 4 10%接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基等发酵培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌下通过控制pH6. 0 7. 0培养 24 36h，再解除pH控制继续发酵12 18h，然后按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4. 0 5. 0于30 45 °C继续发酵M 96h，从而获得含Y -氨基丁酸的发酵醪。
有益效果本发明的优点
1、本发明首次发现戊糖片球菌具有很高的谷氨酸脱羧酶活性，利用其作为菌种， 作用于外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠，不仅可以生产出高含量的GABA(最高浓度可达 30% )，可以大大降低生产成本，而且具有较高的安全性。可用于食品、饲料和医药等行业。
2、本发明中的细胞转化方法和酶法转化法生产的含GABA的转化液中成分较简单，便于后提取工艺的简化。细胞转化反应可在高浓度谷氨酸或谷氨酸钠底物中进行，底物浓度高，可提高设备的利用率，产物浓度高，可节约能耗，大大降低生产成本。
3、本发明深层发酵方法的优点是采用分步控制发酵条件，通过外加谷氨酸或谷氨酸钠底物，发酵生产GABA。该发明解决了戊糖片球菌的细胞繁殖与发酵产物累积的发酵条件不一致的矛盾。发酵工艺简单，操作方便，GABA产量高。
具体实施方式
实施例1
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，参照《酶工程》(郭勇主编，中国轻工业出版社， 2000年)所述方法对戊糖片球菌的谷氨酸脱羧酶进行提取。然后将酶液与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应Ih 3d，即可得到浓度为 20% Y-氨基丁酸溶液。
实施例2
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在 pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 4d，离心分离菌体，即可得到浓度为1 % 30% 的Y-氨基丁酸溶液。
实施例3
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3. 2 5. 5，20 45°C 下进行搅拌反应1 4d，离心分离菌体，即可得到浓度为 30%的Y-氨基丁酸溶液。
实施例4
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 4d，离心分离菌体，即可得到浓度为1^-30 ^^ Y-氨基丁酸溶液。
实施例5
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应 1 4d。整个反应中，滴加消泡剂进行消泡。反应结束后，离心分离菌体，即可得到浓度为 1^-30 ^^ Y-氨基丁酸溶液。
实施例6
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，离心分离菌体，即可得到浓度为1^-30 ^^ Y-氨基丁酸溶液。
实施例7
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，加入适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在 pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，离心分离菌体，即可得到浓度为1 % 30% 的Y-氨基丁酸溶液。
实施例8
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，加入适量吐温(Tween)、 蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂，在pH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，离心分离菌体，即可得到浓度为 30%的Y-氨基丁酸溶液。
实施例9
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，整个反应中，滴加消泡剂进行消泡。反应结束后，离心分离菌体，即可得到浓度为1^-30 ^^ Y-氨基丁酸溶液。
实施例10
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，以PH3. 2 5. 5的谷氨酸或谷氨酸钠溶液，于20 45°C反应， 离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含Y-氨基丁酸的溶液，或者将固定化细胞装柱，在通过流加谷氨酸或谷氨酸钠溶液(PH3. 2 5. 5)，于20 45°C下进行连续或间歇式反应， 可得到浓度为 10% Y-氨基丁酸溶液。
实施例11 [0071]戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在PH3. 2 5. 5条件下，于20 45°C反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含Y -氨基丁酸的溶液，或者将固定化细胞装柱，在通过流加谷氨酸或谷氨酸钠溶液 (pH3. 2 5. 5)，于30 45°C下进行连续或间歇式反应，可得到浓度为 10% Y -氨基丁酸溶液。
实施例12
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，采用0. 5 10 %的甲苯处理，再离心收集菌体，然后将菌体进行固定化，与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在PH3. 2 5. 5条件下，于 20 45°C反应，离心或过滤分离固定化细胞，即可得到含Y-氨基丁酸的溶液，或者将固定化细胞装柱，在通过流加含适量吐温(Tween)、蔗糖酯或特里顿(Triton)等表面活性剂的谷氨酸或谷氨酸钠溶液(PH3. 2 5. 5)，于20 45°C下进行连续或间歇式反应，可得到浓度为 10% Y-氨基丁酸溶液。
实施例13
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，当反应液中无谷氨酸颗粒存在时，采用滴加HCl和NaOH溶液控制pH在3. 2 5. 5之间，继续反应Ih 2d。整个反应中，滴加消泡剂进行消泡。反应结束后，离心分离菌体，即可得到浓度为 30% 的Y-氨基丁酸溶液。
实施例14
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的悬浊液混合(半固体状态)，在PH3. 2 5. 5，20 45 °C下进行搅拌反应1 6d。整个反应中，滴加消泡剂进行消泡。反应结束后，离心分离菌体，即可得到浓度为 30%的Y-氨基丁酸溶液。
实施例15
戊糖片球菌经过MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基扩大培养后，离心收集菌体，然后将菌体与麸酸(发酵法生产的谷氨酸粗提物)悬浊液混合(半固体状态)，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d。整个反应中，滴加消泡剂进行消泡。反应结束后，离心分离菌体，即可得到浓度为 30% 的Y-氨基丁酸溶液。
实施例16
将戊糖片球菌保藏菌种采用MRS斜面进行活化，接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌培养12 Mh，然后按4 10%接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 180rpm搅拌下通过流加Imol/LNaOH控制 pH6. 0 7. 0培养Mh，然后解除pH控制，继续发酵12 18h，按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，于30 45°C，pH4. 0 5. 0继续发酵M 96h，从而获得Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。
实施例17
以戊糖片球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于25 37°C，IOOrpm摇床培养1 进行活化，然后按4 10%的接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌培养12 Mh，然后按4 10 %接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌下通过流加 Imol/LNaOH控制pH6. 0 7. 0培养Mh，然后解除pH控制，继续发酵12 18h，按15 40g/ L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在4. 0 5. 0于 30 45°C继续发酵M 96h，从而获得Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。
实施例18
以戊糖片球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于25 37°C，IOOrpm摇床培养1 进行活化，然后按4 10%的接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌培养12 Mh，然后按4 10 %接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌下通过流加 Imol/LNaOH控制pH6. 0 7. 0培养M 36h，按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在4. 0 5. 0于30 45 °C继续发酵M 96h， 从而获得Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。
实施例19
以戊糖片球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于25 37°C，IOOrpm摇床培养12 24h进行活化，然后按4 10%的接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C， 100 ISOrpm搅拌培养12h，然后按4 10 %接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌下通过流加 Imol/LNaOH控制pH6. 0 7. 0培养Mh，然后解除pH控制，继续发酵12 18h，按15 40g/ L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，通过流加NaOH和HCl控制pH值在4. 0 5. 0于 30 45°C继续发酵M 96h，从而获得Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。
实施例20
以戊糖片球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，再以三角瓶MRS液体培养基于25 37°C，IOOrpm摇床培养12 24h进行活化，然后按4 10%的接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C， 100 180rpm搅拌培养12 Mh，然后按4 10%接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，pH6. 0 7. 0，100 180rpm 搅拌下培养Mh，然后解除pH控制，继续发酵12 18h，按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，然后控制pH值在4. 0 5. 0于30 45 °C继续发酵M 96h，从而
11获得Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。
实施例21
以戊糖片球菌为生产菌种，先采用MRS斜面进行活化，接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，pH6. 0 7. 0， 100 ISOrpm搅拌培养12h，然后按4 10%接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，pH6. 0 7. 0，100 180rpm搅拌下培养Mh，然后解除pH控制，继续发酵12 18h，按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，然后控制pH值在4. 0 5. 0于30 45°C继续发酵M 96h，从而获得 Y -氨基丁酸含量为10 20g/L的发酵醪。经过灭菌排放，即可进行GABA提取和精制。
权利要求
1. 一种以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)生物合成Y _氨基丁酸的方法，其特征为以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)作为生产菌种，通过细胞转化方法、酶法转化方法或深层发酵法生产Y-氨基丁酸的方法；细胞转化法的特征为通过将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)经活化后，接种于MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C培养12h，作为种子液，再接种到MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基进行扩大培养M 36h，于6000 lOOOr/min离心收集菌体，然后将菌体与谷氨酸或谷氨酸钠的溶液或悬浊液混合，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应1 6d，从而获得含Y -氨基丁酸的溶液；酶法转化方法的特征为通过将戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus) 经活化后，接种于MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C培养12h，作为种子液，再接种到MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基进行扩大培养M 36h，于6000 IOOOr/ min离心收集菌体，然后对戊糖片球菌的谷氨酸脱羧酶进行提取，再将酶液与谷氨酸或谷氨酸钠溶液混合，在PH3. 2 5. 5，20 45°C下进行搅拌反应Ih 2d，从而获得含Y -氨基丁酸的溶液；深层发酵法的特征为以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)为生产菌种，先进行活化，后接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 ISOrpm搅拌培养12 Mh，作为种子液，将种子液按 4 10%接种量接入MRS、马铃薯汁复合增殖培养基、麦芽汁复合增殖培养基或豆芽汁复合增殖培养基，于25 37°C，100 180rpm搅拌下通过控制pH6. 0 7. 0培养M 36h，再解除PH控制继续发酵12 18h，然后按15 40g/L的终浓度的比率加入谷氨酸或谷氨酸钠，控制pH值在4. 0 5. 0于30 45°C继续发酵M 96h，从而获得含、-氨基丁酸的发酵醪。
专利摘要
本发明阐述了一种生物合成γ-氨基丁酸的方法，它是以戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)为菌种，通过发酵工程技术、细胞转化法和酶工程技术将外源添加的谷氨酸或谷氨酸钠进行转化，生产高含量的γ-氨基丁酸(转化液γ-氨基丁酸含量达1～30％)。该法属于生物技术领域：
，无需高温高压反应条件和有毒有害原料，专一性高，副产物少，而且戊糖片球菌为食品级微生物，安全性高，因此可用于化工、食品、饲料或纯化后用于医药等行业。
文档编号C12P13/00GKCN101654689 B发布类型授权 专利申请号CN 200910192105
公开日2011年11月16日 申请日期2009年9月4日
发明者李云, 杨胜远, 韦锦 申请人:韩山师范学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (1), 非专利引用 (3),