专利名称:一种非水相制备手性3r,5s-双羟基化合物的方法
技术领域：
本发明属于生物催化法不对称制备手性医药中间体领域，具体涉及一种以3， 5_二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，还原制备单一光学 纯度的3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法。
背景技术：
3R，5S_ 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯结构中的两个手性中心与3_羟基_3_甲基 戊二酰辅酶A还原酶的抑制剂他汀类降血脂药物的手性侧链立体构型相同，因此它是合成 他汀类药物的关键手性中间体。
目前该类化合物的制备主要是通过化学合成来完成，但是存在下列问题需用手 性催化剂，生产成本高；总得率低于50% ；产物的光学纯度很难达到要求；大量使用有机试 剂，造成环境污染严重。
因为生物催化方法具备高度立体选择性、温和的反应条件和不造成环境污染等优 势，所以如何采用生物催化技术制备3R，5S-双羟基化合物已经受到研究者高度关注和广 泛研究，例如
(I)Wolberg 等(参见Angew. Chem. Int. Ed. 200，39 :4306_4308 ；Chem. Eur. J. 2001,7 4562-4571)利用细菌 Lactobacllus brevis 将一种 β，δ-双羰基底物中 的S-羰基还原成δ-羟基，但产物的非对映体过量值(enantiomericexcess，ee)只有 98. 1%，且需用其他方法引入另一个手性中心。
(2)去氧核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)能够以乙醛和氯乙醛为底物，通过两步 醛缩反应同时引入两个手性中心得到3R，5S-双羟基产物(ee > 99.9，de = 96. 6 % ) (参见 J. Am. Chem. Soc. 1994，116 :8422_8423 J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2004，101 5788-5793)，但该方法的缺点是酶用量较大、底物抑制作用很强并且初始反应原料为易燃 易爆试剂，故难以用于工业生产。
(3) Guo 等(参见Tetrahedron :Asymmetry 2006，17 1589-1602)禾Ij 用 Acinetobacter species SC13874还原3R，5S_ 二羰基_6_节氧基-己酸乙酯制备得到3R， 5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯，但63. 3%的非对映体过量值阻碍了该方法的应用。
(4)腈基水解酶亦可以用于3R，5S_双羟基化合物的制备，但底物的合成难度大， 产物分离困难(Org. Process. Res. Dev. 2006，10 661-665)。
(5)公开号为CN 101429514A的中国发明专利申请公开说明书公开了一种应用双 羰基还原酶在制备3R，5S-双羟基化合物的方法，是一个最为成功的生物催化方法，所述双 羰基还原酶能够催化3R，5S- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯还原成3R，5S- 二羟基-6-苄氧 基_己酸乙酯，产物的de和ee值均高于99. 5%，且底物转化率高达99. 9%，不过该方法的 不足之处是反应的底物浓度较低(10g/L)。
发明内容
本发明目的是提供一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种非水相制备手性化合物3R， 5S-双羟基化合物的方法，以3R，5S-双羰基化合物为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂， 催化还原底物得到3R，5S-双羟基化合物；具体包括以下步骤
(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体 系，10 50°C条件下，振荡反应至少1小时；
其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液，有机溶剂和缓冲液的体积比 为1 9 9 1;所述缓冲液的PH值为4.0 8.0;所述底物的浓度为10 100g/L;所 述双羰基还原酶的用量为0. 5 9U/mL ；所述甲酸脱氢酶用量为1 5U/ml ；
(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，单一光学异构体3R，5S_双羟基化合 物；
其中，3R，5S_双羰基化合物的通式为
3R，5S_双羟基化合物的通式为
式中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷 杂烷基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基R2为烷基、环烷基、商烷基或商环烷基。
优选的技术方案中，R1选自苯基、吡啶基、呋喃基、吡咯基、碳原子数1 6的烷 基、碳原子数3 8的环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂烷基、环状杂 烷基或环状杂烷化烷基；R2为碳原子数1 6的烷基、碳原子数3 8的环烷基、卤烷基或 卤环烷基。
上述技术方案中，所述双羰基还原酶为公开号为CN101429514A的中国发明专利 申请公开说明书中所述双羰基还原酶，所述双羰基还原酶由与SEQ IDN0. 1具有80%以上 的同源性的氨基酸序列组成。
优选的技术方案中，所述的双羰基还原酶由SEQ ID NO. 1所示的氨基酸序列组成。
上述技术方案中，所述由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系属于本领域技术人 员公知的常规现有技术，通常包括甲酸盐、辅酶NAD+和甲酸脱氢酶，本领域技术人员可以根 据实际情况选择合适的组分和用量。
上述技术方案中，所述溶剂选自乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲苯和 正己烷中的一种或一种以上的混合物。
上述技术方案中，所述步骤(1)中的振荡反应的转速一般在100 300rpm，优选 150 250rpm。
上述技术方案中，所述步骤(2)的分离提纯方法可以是将反应液用有机溶剂萃
4取，合并有机相，减压蒸干，纯化后即得到所述产物。
优选的技术方案中，步骤(1)中所述有机溶剂选自甲苯或正己烷；步骤(1)中所 述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液，所述缓冲液的制备均为现有技术。
上述技术方案所述反应过程可用如下反应式表示
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.由于本发明采用双羰基还原酶，同时结合非水相溶剂体系和辅酶再生系统，催 化合成了 3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯，其光学纯度ee和de值均大于99. 5%，底 物浓度高达150g/L，具有广泛的实际应用价值。
2.本发明的制备方法简单、过程可控，效率极高，具有良好的应用前景。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例一
一种制备3R，5S_ 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤在Iml的 反应体系中，依次加入甲酸钠9. 5-140mg, 3，5- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10 150mg， 0. IM (pH = 6. 0)磷酸钾缓冲液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脱氢酶27. 2mg(4U/ml)，双羰基还 原酶上清65μ l(6U/ml)，最后加入正己烷500 μ 1 ；在常温、振荡速度为200rpm条件下反应 18小时，停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在底物浓度小于等于100g/L时转化率大于99%，125g/L时的转化率为95. 1%，并 且产物3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99. 5%。
上述双羰基还原酶可以通过以下方法得到将含有诱导表达的双羰基还原酶的大 肠杆菌细胞用0. IM (pH = 6. 0)磷酸钾缓冲液，按20%的比例重悬，高压破细胞，12000rpm 离心15 20min获得双羰基还原酶上清，其酶活力为90U/ml。
上述甲酸脱氢酶可以采用如下方法制备将含有诱导表达的甲酸脱氢酶的大肠杆 菌细胞用0. 05M(pH = 7. 0)磷酸钾缓冲液，按20%的比例重悬，高压破细胞，12000rpm离心 15 20min获得甲酸脱氢酶上清，冷冻干燥，使用时粉末加入反应体系。
3，5- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯的转化率和产物3R，5S- 二羟基_6_苄氧基-己 酸乙酯纯度用反相C18柱(5ym，4. 6X25(kim，Shimadzu, Japan)进行高效液相(Shimadzu 2010A HT, Japan)分析(Chirality, 2008, 20 51-53 ；Acta. Biochim. Biophys. Sin. 2009, 41 163-170)。产物的 ee 和 de 值用手性液相色谱柱 Chiralcel OD-RH(5 μ m, 150X4. 6mm,Daicel,USA)进行分析(Chirality, 2008, 20 :51_53 ；Acta. Biochim. Biophys. Sin. 200941 163-170)。
实施例二
一种制备3R，5S_ 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤在Iml的 反应体系中，依次加入甲酸钠9. 5mg，3，5- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10mg，0. IM (pH = 6.0)磷酸钾缓冲液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脱氢酶27. 2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清 65μ l(6U/ml)，最后加入正己烷500 μ 1 ；在40°C、振荡速度为200rpm条件下反应18小时， 停止反应后，分离提纯，样品进行高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
底物转化率为76. 4%，产物3R，5S- 二羟基_6_苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均 高于99. 5%。
实施例三
一种制备3R，5S_ 二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯的方法，包括如下步骤在Iml 的反应体系中，依次加入甲酸钠140mg(2M)，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10g/L， 0. IM (pH = 6. 0)磷酸钾缓冲液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脱氢酶27. 2mg(4U/ml)，双羰基还 原酶上清65μ l(6U/ml)，最后加入乙醇100 400 μ 1，在常温、振荡速度为200rpm条件下 反应18小时，停止反应后，分离纯化，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学 纯度。
在乙醇含量为20% (ν/ν)时转化率为95. 0%，30%时转化率为3.3%，产物3R， 5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的ee和de值均高于99. 5%。
实施例四
一种制备3R，5S_二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤在Iml的反 应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10 150g/L，0. IM (pH =6. 0)磷酸钾缓冲液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脱氢酶27. 2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清 65 μ 1 (6U/ml)，最后加入二甲基亚砜500 μ 1，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小 时，停止反应后，分离提纯，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在当底物浓度低于等于125g/L时转化率为99. 2%，150g/L时的转化率为84. 1%。 产物ee和de值均高于99. 5 %。
实施例五
一种制备3R，5S_二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤在Iml的反 应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯10 150g/L，0. IM(pH =6. 0)磷酸钾缓冲液，NAD+20 μ 1 (0. 5mM)，甲酸脱氢酶27. 2mg(4U/ml)，双羰基还原酶上清 65 μ 1 (6U/ml)，最后加入甲苯400 μ 1，在常温、振荡速度为200rpm条件下反应18小时，停止 反应后，分离提纯，样品利用高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。
在当底物浓度低于等于75g/L时转化率为99. 5%,100g/L时的转化率为90. 5%。 产物ee和de值均高于99. 5 %。
实施例六
一种制备3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，包括如下步骤在50ml的 反应体系中，依次加入甲酸钠140mg，3，5- 二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯5g，0. IM (pH = 6. 0) 磷酸钾缓冲液，NAD+Iml (0. 5mM)，甲酸脱氢酶1. 36g (4U/ml)，双羰基还原酶上清3. 25ml (6U/ml)，最后加入正己烷25ml ；在常温，200rpm条件下进行反应，在反应进行了 2小时和4小 时时，分别再加入双羰基还原酶100U和50U。反应中每隔1小时取样，乙醇停止反应后，用 高效液相色谱分析底物转化率和产物光学纯度。底物转化率在反应12小时后达到恒定，为 94. 8%。停止反应，反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相用无水硫酸钠干燥，过滤，旋转 蒸发有机溶剂，减压浓缩得到油状产物混合物，产物混合物用65/35乙酸乙酯/石油醚(ν/ ν)的硅胶层析柱纯化，旋转蒸发洗脱剂得到白色粉末状3R，5S- 二羟基-6-苄氧基-己酸乙 酯产物，其纯度为99 %，ee和de值均高于为99. 5 %，产物收率为83.9%。
<110>陈依军[0055]<120> 一种非水相制备手性化合物3R，5S--双羟基化合物的方法[0056]<160>1[0057]<210>1[0058]<211>283[0059]<212>PRT[0060]<213> 双羰基还原酶(diketoreductase)[0061]<400>1[0062]Met ThrGlylieThrAsnValThrValLeuGlyThrGlyValLeuGly[0063]151015[0064]Ser GlnIleAlaPheGlnThrAlaPheHisGlyPheAlaValThrAla[0065]202530[0066]Tyr AspIleAsnThrAspAlaLeuAspAlaAlaLysLysArgPheGlu[0067]354045[0068]Gly LeuAlaAlaValTyrGluLysGluValAlaGlyAlaAlaAspGly[0069]505560[0070]Ala AlaGlnLysAlaLeuGlyGlylieArgTyrSerAspAspLeuAla[0071]65707580[0072]Gln AlaValLysAspAlaAspLeuVallieGluAlaValProGluSer[0073]859095[0074]Leu AspLeuLysArgAsplieTyrThrLysLeuGlyGluLeuAlaPro[0075]100105110[0076]Ala LysThrliePheAlaThrAsnSerSerThrLeuLeuProSerAsp[0077]115120125[0078]Leu ValGlyTyrThrGlyArgGlyAspLysPheLeuAlaLeuHisPhe[0079]130135140[0080]Ala AsnHisValTrpValAsnAsnThrAlaGluValMetGlyThrThr[0081]145150155160[0082]Lys ThrAspProGluValTyrGlnGlnValValGluPheAlaSerAla[0083]165170175[0084]lie GlyMetValProlieGluLeuLysLysGluLysAlaGlyTyrVal[0085]180185190[0086]Leu Asn Ser Leu
195
Val Asp Gly Ile
210
Gly Thr Gly Ala
225
Leu Thr Thr Ala
Glu Phe Ala Ala
260
Gly Leu Ala Thr
275
Leu Val Pro Leu Leu Asp 200
Ala Asp Pro Glu Thr lie 215
Pro Lys Gly Pro Phe Glu 230
Tyr Asn lie Ser Ser Val 245250
Tyr Leu Lys Glu Asn Tyr 265
Gly Glu Gly Phe Tyr Arg 280
Ala Ala Ala Glu Leu Leu 205
Asp Lys Thr Trp Arg lie 220
lie Phe Asp lie Val Gly 235240
Ser Gly Pro Lys Gln Arg 255
lie Asp Lys Gly Lys Leu 270
Tyr
权利要求
一种非水相制备手性3R，5S-双羟基化合物的方法，以3R，5S-双羰基化合物为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，催化还原底物得到3R，5S-双羟基化合物；其特征在于，具体包括以下步骤(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，10～50℃条件下，振荡反应至少1小时；其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液，有机溶剂和缓冲液的体积比为1∶9～9∶1；所述缓冲液的pH值为4.0～8.0；所述底物的浓度为10～100g/L；所述双羰基还原酶的用量为0.5～9U/mL；所述甲酸脱氢酶用量为1～5U/ml；(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，得单一光学异构体3R，5S-双羟基化合物；其中，3R，5S-双羰基化合物的通式为3R，5S-双羟基化合物的通式为式中，R1选自芳香基、烷基、环烷基、烷基取代的芳香基、卤素取代的芳香基、芳烷杂烷基、环状杂烷基或环状杂烷化烷基R2为烷基、环烷基、卤烷基或卤环烷基。F2009102320802C00011.tif,F2009102320802C00012.tif
2.根据权利要求
1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其 特征在于，所述溶剂选自乙醇、四氢呋喃、二甲基亚砜、乙酸乙酯、甲苯和正己烷中的一种 或一种以上的混合物。
3.根据权利要求
1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其 特征在于，步骤(1)中所述振荡反应的转速在100 300rpm。
4.根据权利要求
1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其 特征在于，步骤(1)中所述缓冲液选自磷酸盐缓冲液或醋酸盐缓冲液。
5.根据权利要求
2所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其 特征在于，步骤(1)中所述有机溶剂选自甲苯或正己烷。
6.根据权利要求
3所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法，其 特征在于，步骤(1)中所述振荡反应的转速在200rpm。
7.根据权利要求
1所述的一种非水相制备手性化合物3R，5S-双羟基化合物的方法， 其特征在于，所述双羰基还原酶由与SEQ ID NO. 1具有80%以上的同源性的氨基酸序列组 成。
专利摘要
本发明属于生物催化法不对称制备手性医药中间体领域，具体涉及一种以3，5-二羰基-6-苄氧基-己酸乙酯为底物，以双羰基还原酶为生物催化剂，还原制备单一光学纯度的3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸乙酯的方法，具体包括以下步骤(1)在反应液中加入底物、双羰基还原酶和由甲酸脱氢酶介导的辅酶循环再生体系，振荡反应至少1小时，其中，所述反应液为有机溶剂和缓冲液的混合溶液；(2)将步骤(1)得到的产物进行分离纯化，单一光学异构体3R，5S-双羟基化合物。由于本发明采用双羰基还原酶，同时结合非水相溶剂体系和辅酶再生系统，催化合成了3R，5S-二羟基-6-苄氧基-己酸酸乙酯，其光学纯度ee和de值均大于99.5％，底物浓度高达150g/L，具有广泛的实用价值。
文档编号C12P7/18GKCN101880694SQ200910232080
公开日2010年11月10日 申请日期2009年12月1日
发明者吴旭日, 陈依军 申请人:陈依军导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan