包含枯草杆菌蛋白酶变体的组合物和方法

专利名称:包含枯草杆菌蛋白酶变体的组合物和方法
包含枯草杆菌蛋白酶变体的组合物和方法
本申请要求于2008年11月11日提交的美国临时专利申请系列号61/113，561的优先权，其通过引用整合到本文中。
发明领域
本发明提供了芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含该丝氨酸蛋白酶变体的自动化洗碗组合物。
发明背景
一般而言，传统的家用和工业用洗碗组合物依赖于高碱度去垢剂洗涤和氯漂白剂的组合，用于清洁和消毒餐具。此类系统一般对可漂白的污渍作用良好。然而，去除含蛋白质的污垢则是棘手的，所述污垢通常存在于家庭、医院、食堂和餐饮业的餐具上。此外，认为很高碱性的和含氯的组合物不是对消费者和环境友好的。
已进行了各种尝试来产生有效去除蛋白质性污垢的洗碗组合物。这类组合物典型的包括碱性条件(例如，至少9.5的pH)下的蛋白酶活性。然而，此类组合物具有显著的缺陷，即，难以配制成消费者通常偏爱的液体或凝胶形态洗碗去垢剂。此外，通常认为碱性洗碗组合物是刺激性的。
已做出了一些尝试来生产低pH(例如，小于9. 5的pH)的洗碗组合物。这类组合物更安全，对环境更友好，并且能够配制成凝胶和液体形态。然而，现有的低PH洗碗组合物已证实对于去除蛋白质性污垢是效率很低的，即使当所述洗碗组合物质配制了高浓度的酶 (例如，蛋白酶)时。
因而，本领域仍然需要从餐具上有效去除蛋白质性污垢的洗碗组合物。此外，仍然需要对环境和消费者更友好并且易于使用和低成本的洗碗组合物。
发明概述
本发明提供了芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含该丝氨酸蛋白酶变体的自动化洗碗组合物。
本发明还提供了包含SEQ ID NO :8所述氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体。在一些优选的实施方案中，本发明提供了包含具有SEQ ID NO :8所述氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体的自动化洗碗去垢剂组合物。在一些实施方案中，所述自动化洗碗去垢剂组合物是液体去垢剂，而在一些备选的实施方案中，所述自动化洗碗去垢剂组合物是凝胶、片剂、粉末或颗粒状去垢剂。在一些进一步的实施方案中，所述自动化洗碗去垢剂组合物不含磷酸盐。在一些仍进一步的实施方案中，所述自动化洗碗去垢剂组合物含有至少一种漂白剂。在一些仍额外的实施方案中，所述自动化洗碗去垢剂组合物进一步包含至少一种其他的酶。在一些优选的实施方案中，所述至少一种其他的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、 果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、 漆酶和淀粉酶，或其混合物。[0011]本发明还提供了清洁餐具的方法，包括提供待清洁的餐具物品和包含具有SEQ ID NO :8所述氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，并将所述物品或表面与所述组合物接触。在一些实施方案中，所述方法进一步包括清洗所述待清洁的餐具物品的步骤。
在仍进一步的实施方案中，本发明提供了编码所述枯草杆菌蛋白酶变体的分离的核酸。在一些优选的实施方案中，提供了包含与启动子有效组合的分离核酸的表达载体。此外，提供了包含表达载体的宿主细胞。
发明详述
本发明提供了芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含该丝氨酸蛋白酶变体的自动化洗碗组合物。
除非另外指出，本发明的实施涉及分子生物学、微生物学、蛋白质纯化、蛋白质工程、蛋白质和DNA测序、重组DNA领域、和工业酶用途和开发中常用的常规技术，所有所述技术都落入本领域技术人员的知识范围内。本文提及的所有专利、专利申请、文章和出版物， 无论在上文还是下文中，都通过引用明确的整合到本文中。
此外，本文提供的标题并不限制本发明的多个方面或实施方案，其可参照说明书整体。因此，通过整体参照说明书可以更完整的定义下文定义的术语。尽管如此，为了便于理解发明，下文仍定义了多个术语。
除非本文中另外提及，本文使用的所有技术和科学术语都具有本发明所属领域普遍技术人员常规理解的相同含义(例如，Singleton和Minsbury，Dictionary of Microbiology and Molecular Biology,第 2 版,John Wiley and Sons, NY, 1994 ；以及Hale 禾口 Markham,The Harper Collins Dietionary of Biology,Harper Perennial,NY,1991)。 虽然与本文所述相似或等价的方法和材料也可用于本发明的实施，但本文描述了优选的方法和材料。因此，通过整体参考说明书，可以更全面的描述下文定义的术语。此外，除非文中明确地另外指出，本文中使用的单数形式“一个”和“这个”包含了复数含义。除非另外指出，核酸序列按从5’至3’方向由左至右的书写；氨基酸序列按从氨基至羧基方向由左至右的书写。可以理解，发明不限于所描述的特定方法、方案和试剂，本领域技术人员可以根据所使用的情况而进行变动。
可以理解，该说明书全文给出的每个数值上限包括了每个较小的数值下限，如同此类数值下限明确的书写在本文中。而该说明书全文给出的每个数值下限包括了每个较大的数值上限，如同此类数值上限明确的书写在本文中。该说明书全文给出的每个数值范围包括了落入该较大数值范围中的较小的数值范围，如同此类较小的数值范围明确的书写在本文中。
本文使用的术语“相容的”意指清洁组合物材料不使本文提供的蛋白酶的酶活性降低至这样的程度，所述程度使所述蛋白酶在正常使用状态的过程中不如所期望的有效。 后文详细的示例了特定的清洁组合物材料。
本文使用的“有效量的酶”指达到特定应用所需酶活性必需的酶量。此类有效量易于为本领域技术人员确定，并取决于多种因素，例如所使用的特定蛋白酶变体、清洁应用、 清洁组合物的特定组成，以及需要液体组合物还是干燥组合物(例如，颗粒状)，等。
本文使用的“具有改善的特性”与“变体蛋白水解酶”关联使用，指相对于相应的野生型蛋白酶，具有改善的性能和/或保留性能而具有改善的稳定性的蛋白水解酶。在一些特别优选的实施方案中，改善的特性选自改善的洗碗性能和改善的稳定性，以及改善的洗碗性能和改善的稳定性的组合。
本文使用的短语“去垢剂稳定性”指去垢剂组合物的稳定性。在一些实施方案中， 在使用去垢剂的过程中评估稳定性，而在其他实施方案中，所述术语指去垢剂组合物在储藏过程中的稳定性。
术语“改善的稳定性”用于表示组合物中的变体蛋白酶在储藏过程中更好的稳定性，和/或在泡沫(sud)中更好的稳定性。在优选的实施方案中，相对于相应的野生型酶， 变体蛋白酶表现出在储藏过程中在碗碟护理去垢剂中改善的稳定性，和/或在泡沫中改善的稳定性，包括对氧化剂、多价螯合剂、自溶、表面活性剂和高碱度的稳定性。
本文使用的短语“对蛋白水解的稳定性”指蛋白质(例如，酶)抵抗蛋白水解的能力。该术语并非意在限于使用任何特定的蛋白酶来评估蛋白质的稳定性。
本文使用的“氧化稳定性”指蛋白质在氧化条件下发挥功能的能力。具体而言，术语指蛋白质在存在各种浓度的H2O2、过氧酸和其他氧化剂的条件下发挥功能的能力。可以通过本领域技术人员已知的标准方法和/或本文描述的方法，测量在各种氧化条件下的稳定性。氧化稳定性的实质改变的证据是，相比位于缺少氧化性化合物的条件下存在的酶活性，酶活性半衰期至少约5%或更大的增加或减少(在大部分实施方案中，优选是增加)。
本文使用的“pH稳定性”指蛋白质在特定的pH下发挥功能的能力。一般而言，大部分酶具有可以发挥功能的有限的PH范围。除了在中性范围pH(约pH 7)中发挥功能的酶以外，存在能够在具有非常高或非常低的PH的条件下工作的酶。可以通过本领域技术人员已知的标准程序和/或本文所述的方法，测量各种PH下的稳定性。pH稳定性的实质改变的证据是，相比在酶的最优PH条件下的酶活性，酶活性半衰期至少约5%或更大的增加或减少(在大部分实施方案中，优选是增加)。然而，本发明并非意在限于任何PH稳定性水平或PH范围。
本文使用的“热稳定性”指蛋白质在特定温度下发挥功能的能力。一般而言，大部分酶具有可以发挥功能的有限的温度范围。除了在中等范围温度(例如，室温)下工作的酶以外，存在能够在具有非常高或非常低的温度下工作的酶。可以通过本领域技术人员已知的标准程序和/或本文所述的方法，测量热稳定性。热稳定性的实质改变的证据是，当暴露在给定的温度下时，变体的催化活性半衰期至少约5%或更大的增加或减少(在大部分实施方案中，优选是增加)。然而，本发明并非意在限于任何温度稳定性水平或温度范围。
本文使用的“化学品稳定性”指蛋白质(例如，酶)面对可以不利地影响它的活性的化学品时的稳定性。在一些实施方案中，此类化学品包括但不限于过氧化氢、过氧酸、阴离子型去垢剂、阳离子型去垢剂、非离子型去垢剂、螯合剂，等。然而，本发明并非意在限于任何特定的化学品稳定性水平或化学稳定性范围。
本文使用的术语“纯化的，，或“分离的，，指从样品中去除污染物。例如，通过去除溶液或制品中不是目的酶的污染性蛋白质和其他化合物，纯化目的酶。在一些实施方案中， 在细菌或真菌宿主细胞中表达重组的目的酶，通过去除其他的宿主成分，纯化这些重组的目的酶；从而增加样品中目的多肽的重组酶百分比。
如本文中使用的，“目的蛋白”指待分析、鉴别和/或修饰的蛋白质(例如，酶或“目的酶”)。天然以及重组(例如，变体)蛋白质均可用于本发明中。如本文中使用的，“蛋白质”指由氨基酸构成且被本领域技术人员认为是蛋白质的任何组合物。术语“蛋白质”、“肽” 和多肽在本文中可互换的使用。其中肽是蛋白质的一部分，本领域技术人员理解术语在上下文中的用途。
如本文中使用的，“表达载体”指含有与合适的控制序列有效连接的DNA序列的 DNA构建体，所述序列能够在合适的宿主中影响DNA的表达。此类控制序列包括影响转录的启动子、控制此类转录的任选的操纵子序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列， 和控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒，或者单纯的潜在基因组插入物。一旦转化到合适的宿主中，则载体可以复制并独立于宿主基因组发挥功能，或者在一些情况下，本身可以整合到基因组中。在本说明书中，“质粒”、“表达载体”和“载体”通常可互换的使用，因为质粒是目前最常用的载体形态。然而，本发明意在包括其他形态的表达载体，例如发挥等价的功能并且是或将是本领域已知的载体。
在一些优选的实施方案中，将蛋白酶基因连接到适当的表达质粒中。然后，将克隆的蛋白酶基因用于转化或转染宿主细胞，从而表达蛋白酶基因。在含有质粒复制必需的普遍已知的元件或者质粒可以设计为整合到宿主染色体中的情况下，该质粒可以在宿主中复制。为有效的基因表达(例如，与目的基因有效连接的启动子)提供必需的元件。在一些实施方案中，提供这些必需的元件，即基因自身的同源启动子，如果所述启动子可以被识别 (即，被宿主转录)，和外源的或由蛋白酶基因的内源终止子区域提供的转录终止子。在一些实施方案中，还包括选择基因，例如抗生素抗性基因，使得通过在含抗微生物剂的培养基上生长，能够持续的培养维持被质粒感染的宿主细胞。
可以使用下列盒式诱变方法，促进本发明的蛋白酶变体的构建，虽然可以使用其他的方法。首先，如本文所述，获得天然存在的编码蛋白酶的基因，整体或部分测序。然后， 在序列中搜索预期在编码的蛋白酶中产生一个或多个氨基酸的突变(删除、插入或取代) 的点。在该点两侧的序列中评估限制性位点的存在，用于用寡核苷酸池替换所述基因的短片段，所述寡核苷酸池在表达时将编码多种变体。此类限制性位点优选是该蛋白质基因内唯一的位点，使得有利于基因片段的替换。然而，可以使用在蛋白酶基因中没有过多的任何常规限制性位点，只要通过限制性消化所产生的基因片段可以以正确的序列重新装配。如果在距离选定的点方便的距离内的位置(10至15个核苷酸)不存在限制性位点，则通过取代基因中的核苷酸产生此类位点，所述取代方式在最终构建体中既不改变可读框，也不改变所编码的氨基酸。为了改变基因序列而产生理想的序列，根据一般已知的方法通过引物延伸实现基因的突变。常规是通过遗传密码的简并性、基因的限制性酶切图谱和大量不同的限制性酶，完成定位合适的侧翼区域，和评估得到两条常规的限制性位点序列所需的改变。应注意，如果可获得方便的侧翼限制性位点，则上述方法只需要与不含有位点的侧翼区域关联使用。一旦克隆了天然存在的DNA和/或合成DNA，则用关联的限制性酶消化待突变位置侧翼的限制性位点，将复数的末端互补的寡核苷酸盒连接到基因中。由于可以合成所有的寡核苷酸使其都具有相同的限制性位点，而不需要合成接头产生限制性位点，因而通过该方法可以简化突变。
本文使用的“对应于“指蛋白质或肽中编号位置上的残基，或者与蛋白质或肽中编号位置类似、同源或等价的残基。本文使用的“对应区域”一般指相关蛋白质或参照蛋白质的类似位置。[0035]术语“编码......的核酸分子”、“编码......的核酸序列”、“编码......的DNA
序列”和“编码......的DNA”指沿着脱氧核糖核酸的链的脱氧核糖核苷酸的顺序或序列。
这些脱氧核糖核苷酸的顺序决定了沿着多肽(蛋白质)链的氨基酸顺序。DNA序列因而编码氨基酸序列。
本文使用的“野生型”和“天然”蛋白质是在自然界指发现的蛋白质。术语“野生型序列”和“野生型基因”在本文中可互换的使用，指宿主细胞中天然的或天然存在的序列。 在一些实施方案中，野生型序列指作为蛋白质工程起点的目的序列。可以根据本领域技术人员已知的一般性方法获得编码天然存在的蛋白质的基因。所述方法一般包括合成具有编码目的蛋白区域的推定序列的标记探针，从表达所述蛋白质的生物体制备基因组文库，和通过与探针的杂交在文库中筛选目的基因。然后，定位和测序阳性杂交克隆。
本文使用的术语“重组DNA分子”指这样的DNA分子，所述DNA分子由通过分子生物学技术的手段连接在一起的DNA片段组成。术语“重组寡核苷酸”指使用分子生物学操作产生的寡核苷酸，包括但不限于通过多核苷酸序列的限制性酶消化而产生的2个或多个寡核苷酸序列的连接，寡核苷酸的合成(例如，合成引物或寡核苷酸)等。
本文使用的“等价的残基”指蛋白质共享特定的氨基酸残基。例如，可以通过在蛋白质(例如，蛋白酶)的三级结构水平的同源性，确定等价的残基，所述蛋白质的三级结构通过χ-射线晶体学而确定。等价残基定义为具有推断等价的残基的蛋白质和目的蛋白质的特定氨基酸残基的两个或多个主链原子的原子坐标在比对后落入0. 13nm以内，优选落入0. Inm以内。比对是在将最佳模型定向并摆放产生原子坐标的最大重叠后实现的，所述原子坐标是所分析的蛋白质的非氢蛋白质原子的坐标。优选的模型是对可获得的最高解析度下的实验衍射数据，产生最低R因子的晶体模型，是使用晶体学和蛋白质表征/分析领域的技术人员已知的方法确定的。
本文使用的术语“调控元件”指控制核酸序列表达的一些方面的遗传元件。例如， 启动子是促进有效连接的编码区转录起始的调控元件。其他调控元件包括剪切信号、多聚腺苷酸信号和终止信号。
本文使用的“宿主细胞” 一般是使用本领域已知的重组DNA技术所构建的载体转化或转染的原核或真核的宿主。转化的宿主相比能够复制编码蛋白质变体的载体，或者表达理想的蛋白质变体。在编码蛋白质变体的前形态或前原形态的载体的情况下，此类变体当表达时通常从宿主细胞分泌到宿主细胞培养基中。
在将核酸序列插入到细胞中的情况下，术语“引入”意指转化、转导或转染。转化的手段包括但不限于本领域技术人员已知的任何合适方法，例如原生质体转化、氯化钙沉淀、电穿孔、裸露的DNA等，如本领域已知的(见例如，Chang和Cohen，MoI Gen Genet, 168 :111-115,1979 ；Smith 等，Appl Env Microbiol, 51 :634,1986 ；以及 Ferrari 等人， "Genetics，”在 Hardwood，Bacillus，Plenum Publishing Corp.，第 57-72 页，[1989]中的综述文章)。
术语“启动子/增强子”表示含有能够同时提供启动子和增强子功能的序列的DNA 片段。启动子/增强子可以是“内源的”或“外源的”或“异源的”。内源的启动子/增强子是与基因组中的给定基因天然相连的。外源的(异源的)启动子/增强子是通过遗传操作 (即，分子生物学技术)的手段，与基因摆放在并列位置上的。
7[0043]表达载体上存在“剪接信号”通常导致重组转录物较高水平的表达。剪接信号介导从初级RNA转录物中去除内含子，其由剪接供体和受体位点(Sambrook等，Molecular Cloning :A Laboratory Manual,第 2 版，Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York，第 16. 7-16. 8 页，1989)组成。
术语“稳定转染”或“稳定转染的”指将外源DNA引入或整合到被转染细胞的基因组中。术语“稳定的转化子”指已在被转染细胞的基因组DNA中稳定的整合了外来或外源 DNA的细胞。
本文使用的术语“可选择标志物”或“可选择的基因产物”指编码这样的酶活性的基因的用途，所述酶活性使表达可选择标志物的细胞对抗生素或药物产生耐受性。
本文使用的术语“扩增”和“基因扩增”指这样的过程，通过所述过程将特定DNA序列不成比例的复制，使得扩增的基因以高于其初始存在于基因组中的拷贝数存在。在一些实施方案中，通过在存在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的条件下生长来选择细胞，获得编码生长在存在所述药物的条件下所需的基因产物的内源基因的扩增，或者通过扩增编码该基因产物的外源(即，输入)序列，或者通过两者。通过在存在药物(例如，可抑制的酶的抑制剂)的条件下生长来选择细胞可以导致编码生长在存在所述药物的条件下所需的基因产物的内源基因的扩增，或者导致扩码该基因产物的外源(即，输入)序列的扩增， 或者两者。
“扩增”是涉及模板特异性的核酸复制的特殊情况。其对立于非特异性模板复制 (即，复制是模板依赖性的但不依赖于特异性模板)。在这里，模板特异性区别于复制保真度(即，固有(proper)的多核苷酸序列的合成)和核苷酸(核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸)特异性。模板特异性经常描述为“靶”特异性。因为试图将靶序列从其他核酸中区分出来的，所以靶序列是“靶”。主要为了此区分(目的)而设计了扩增技术。
本文使用的术语“可扩增的标志物”、“可扩增的基因”和“可扩增的载体”指编码基因的标志物、基因或载体允许所述基因在适当的生长条件下扩增。
本文使用的术语“可扩增的核酸”指可通过任何扩增方法扩增的核酸。可以预期， 所述“可扩增的核酸”通常包括“样品模板”。
本文使用的术语“样品模板”指源自样品的核酸，所述核酸用于分析“靶”(下文定义的)的存在。相反，“背景模板”用于指代除样品模板以外的核酸，所述核酸可以存在或不存在于样品中。背景模板通常是无意造成的。它可以是遗留(carryover)的结果，或者可以是由于存在应该从样品中纯化去掉的核酸污染物导致的。例如，测试样品中可能存在来自待检测对象以外的生物体的核酸作为背景。
本文使用的术语“引物”指寡核苷酸，或为天然存在的如纯化的限制酶消化物或经合成制备，当处于诱导引物延伸产物合成的条件下(即，存在核苷酸和诱导剂，例如DNA聚合酶以及合适的温度和PH)时其能够作为合成起始点，所述产物和核酸链互补。引物优选的为单链以获得扩增的最大效率，但可选的可为双链。如果为双链，首先处理引物以在使用前分离两条链以制备延伸产物。优选的，引物为寡脱氧核糖核苷酸。引物必须足够长以在诱导剂的存在下引发延伸产物的合成。引物的准确长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和使用的方法。
本文使用的术语“探针”指寡核苷酸(即，核苷酸序列)，或为天然存在的如纯化的限制酶消化物或经合成、重组或通过PCR扩增制备，其能够与其他目的寡核苷酸杂交。探针可为单链或双链。探针可用于检测、鉴定和分离特定的基因序列。可以预期用任意“报告分子”标记本发明中使用的任意探针，从而在任意检测系统中可检测探针，所述检测系统包括但不限于酶(例如，酶联免疫吸附测定(ELISA)和基于酶的组织化学方法)、荧光、放射性和发光的系统。本发明无意局限于任意具体的检测系统或标记。
如本文中使用的，当在提及扩增方法(例如，聚合酶链式反应)中使用术语“靶” 时，是指聚合链式反应中使用的引物界定的核酸区域。因此，认为“靶”是意图从其他核酸序列中区分开的。定义“区段(segment)”为靶序列中的核酸区域。
本文中使用的术语“聚合酶链式反应”和“PCR”指美国专利号4，683，195、 4，683，202和4，965，188中的方法，其包括在基因组DNA混合物中不经过克隆或纯化而提高靶序列区段的浓度的方法。这种扩增靶序列的方法是本领域普遍已知的。
本文中使用的术语“限制性内切酶”和“限制性酶”指细菌酶，每种所述酶在特异性核苷酸序列上或附近切割双链DNA。
本文中使用的术语“自动化洗碗去垢剂组合物”和“自动化洗碗去垢剂制剂”用于指这样的混合物，所述混合物预期用于在洗涤基质中清洁碗碟、刀叉等。本发明并非意在限于任何特定的去垢剂制剂或组合物。实际上，除含有至少一种本发明的蛋白酶的去垢剂外，术语旨在涵盖含有表面活性剂、转移酶、水解酶、氧化还原酶、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、上蓝剂和荧光染料、结块抑制剂、掩蔽剂、酶活化剂、抗氧化剂和助溶剂的去垢剂。术语旨在涵盖用于清洁餐具(包括刀叉)的所有形式的组合物，包括但不限于颗粒状和液体的形式。本发明并非意在限于任何特定类型或餐具的组合物。实际上，本发明可用于清洁任意材料的餐具(例如，碗碟，包括但不限于盘子、杯子、玻璃杯、碗等)和刀叉(例如，炊具 (utensil)，包括但不限于勺子、刀、叉子、上菜用具(serving utensil)等)，所述材料包括但不限于陶瓷、塑料、金属、瓷、玻璃、丙烯酸树脂等。本文使用的术语“餐具”指代碗碟和刀叉。
本文使用的术语“相关的洗涤条件”表示在碗碟去垢剂市场分类的家庭实际使用中的条件，特别是洗涤温度、时间、洗涤机械学、泡沫浓度(sud concentration)、去垢剂类型和水硬度。
术语“改善的洗涤性能”用于表示相对于相应的野生型酶，在相关的洗涤条件下的餐具去渍中获得的更好的最终结果，或者基于重量，获得相同的最终结果需要较少的变体蛋白酶。
常规的通过蛋白酶在适当的测试条件下去除某些代表性污渍的能力，来测量蛋白质的洗涤性能。在这类测试系统中，可以以这样的方式控制其他相关的因素，例如去垢剂组成、泡沫浓度、水硬度、洗涤机械、时间、PH和/或温度，使得所述条件与某些市场分类(例如，洗碗)中家庭应用的典型条件相仿。当使用通过DNA突变修饰的蛋白水解酶时，本文所述的实验室应用测试系统对家庭应用是代表性的。因而，本文提供的方法有利于测试大量的不同的酶，和选择特别适合特定类型的去垢剂应用的酶。以该方式，可以容易的选择为特定应用“定制”的酶。
术语“清洁活性”指蛋白酶在蛋白水解、水解、清洁或本发明的其他过程中的常见条件下获得的清洁性能。在一些实施方案中，通过使用多种涉及酶敏感性污渍(例如，奶或卵蛋白)的清洁测定来确定清洁性能，通过将污渍置于标准洗涤条件后，进行多种层析、分光光度或其他定量方法来确定。示例性测定包含但不限于在WO 99/34011和美国专利号 6，605，458中描述的(均通过引用整合到本文中)，以及实施例中包含的那些方法。
术语蛋白酶的“清洁有效量”指在特定的清洁组合物中，实现期望的酶活性水平的上述蛋白酶的量。这样的有效量易于为本领域普通技术人员所确定，并取决于许多因素，例如所使用的具体蛋白酶、清洁应用、清洁组合物的具体组成，以及需要液体组合物还是干燥 (例如，颗粒)组合物等。
本文使用的术语“清洁附加材料”意指为理想的清洁组合物的具体类型和产品形式(例如，液体、颗粒、粉末、条形、糊状、喷雾、片剂、凝胶；或泡沫组合物)而选择的任何液体、固体或气体材料，所述材料还优选地与该组合物中所使用的蛋白酶相容。在一些实施方案中，颗粒组合物为“致密”形式，而在另一些实施方案中，液体组合物为“浓缩”形式。
如本文中使用的，术语“枯草杆菌蛋白酶”指MEROPS——肽酶数据库(Rawlings 等，MEROPS the peptidase database, Nucl Acids Res,34Database issue, D270-272, 2006)中描述的S8蛋白酶家族的任何成员。
用于生产变体蛋白酶的合适的宿主菌株包括可转化的微生物，其中可实现所述蛋白酶的表达。具体而言，与所述蛋白酶来源相同的物种或属的宿主菌株是合适的，例如，芽孢杆菌菌株，优选嗜碱的芽孢杆菌菌株，最优选芽孢杆菌新种PB92或其具有基本相同特性的变体。此外，枯草芽孢杆菌(B. subtilis)、地衣芽孢杆菌(B. Iicheniformis)和解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)菌株也是优选的菌株。其他合适且优选的宿主菌株包括在用变体基因转化前，基本不能生产胞外蛋白水解酶的菌株。令人特别感兴趣的是蛋白酶缺陷型芽孢杆菌宿主菌株，例如芽孢杆菌新种PB92的蛋白酶缺陷型衍生物。通过使用在选定的宿主生物中发挥功能的表达信号，获得蛋白酶的表达。表达信号包括调控蛋白酶基因转录和翻译的DNA序列。适当(Proper)载体能够在选择的宿主菌株中以足够高的拷贝数复制，或者能够通过染色体整合在宿主菌株中稳定的维持蛋白酶基因。
通过在适当的发酵条件下培养转化的宿主菌株并回收所生产的酶，制备本发明提供的变体蛋白水解酶(即，枯草杆菌蛋白酶变体)，所述转化的宿主菌株包含理想的(一种或多种)变体蛋白水解基因。优选的，所表达的蛋白酶分泌到培养基中，有利于它的回收， 或者在革兰氏阴性细菌宿主菌株的情况下，分泌到周质空间中。对于分泌，使用合适的氨基末端信号序列，如果所述信号序列在所选宿主菌株中是功能性的话，优选原始基因编码的信号序列。
因此，本发明提供了用于自动化洗碗去垢剂组合物和/或洗涤方法中的变体丝氨酸蛋白酶(例如，具有S101M+G118V+S128L+P129Q+S130A的PB92变体；使用BPN，编号)。
清洁组合物
除非另外提出，本文提供的所有组分或组合物水平都参照所述组分或组合物的活性水平来制备，并且排除可能存在于市售来源中的杂质，例如残余的溶剂或副产物。酶组分重量是基于总活性蛋白的。除非另外指出，按重量计算所有的百分比和比例。除非另外指出，基于总组合物计算所有的百分比和比例。在示例性的去垢剂组合物中，按总组合物的重量计，通过纯酶表示酶水平，并且除非另外说明，按总组合物的重量表示去垢剂成分。
如本文所示，在一些实施方案中，本发明的清洁组合物进一步包含附加材料，包括但不限于表面活性剂、增洁剂、漂白剂、漂白活化剂、漂白催化剂、其他的酶、酶稳定体系、 螯合剂、光学增亮剂、污垢释放聚合物、染料转移剂、分散剂、抑泡剂、染料、香料、着色剂、 填充盐、助水溶物(hydrotrope)、光活化剂、荧光剂、织物软化剂、可水解的表面活性剂、防腐剂、抗氧化剂、抗缩水剂、抗皱剂、杀菌剂、杀真菌剂、色粒(color speckle)、银护理剂 (silvercare)、抗晦暗剂(anti-tarnish)和/或抗腐蚀剂、碱度源、助溶剂、载体、加工助剂、色素和PH控制剂(见例如，美国专利号6，610，642,6, 605，458,5, 705，464,5, 710，115、 5, 698, 504,5, 695, 679,5, 686, 014 ^P 5，646，101，均通过引用整合到本文中)。下文详细示例了具体的清洁组合物材料的实施方案。在清洁组合物中的清洁附加材料与本发明的变体蛋白酶不相容的实施方案中，使用合适的方法保持清洁附加材料和蛋白酶分离(即，彼此不接触)直到两种组分的结合恰当之时。此类分离方法包括本领域已知的任何合适的方法 (例如，软胶囊(gelcap)、封装、片剂、物理分离，等)。
本发明的丝氨酸蛋白酶可用于配制各种自动化洗碗去垢剂组合物。本发明的酶可用于颗粒的和液体的组合物中。
本发明的自动化洗碗去垢剂组合物需要有效量的本文提供的丝氨酸蛋白酶。在一些实施方案中，所需的酶水平是通过添加一种或多种本发明提供的丝氨酸蛋白酶实现的。 本发明的清洁组合物典型的包含至少0. 0001重量百分比，从约0. 0001至约10，从约0. 001 至约1，或者甚至从约0.01至约0. 1重量百分比的至少一种本发明提供的丝氨酸蛋白酶。
在一些优选的实施方案中，本文提供的洗碗清洁组合物典型的配制成在用于水性清洁操作的过程中，使得洗涤水具有从约5. 0至约11. 5的pH，或者在备选的实施方案中，甚至从约6. 0至约10. 5的pH。在一些优选的实施方案中，液体产物制剂典型的配制成具有从约3. 0至约9. 0的净pH，而在一些备选的实施方案中，制剂具有从约3至约5的净pH。用于控制PH在推荐使用水平的技术包括使用缓冲液、碱、酸等，且是本领域技术人员普遍已知的。
在一些特别优选的实施方案中，当在颗粒状的组合物或液体中使用至少一种丝氨酸蛋白酶时，所述丝氨酸蛋白酶是封装的颗粒形式，以在储存过程中保护所述酶与颗粒组合物的其他组分分隔开。此外，封装也提供了控制丝氨酸蛋白酶在清洁过程中的可利用度的手段，并且可以增强丝氨酸蛋白酶的性能。可以预期，封装的本发明的丝氨酸蛋白酶可用于多种设置。还预计使用本领域已知的任何合适的(一种或多种)封装材料和(一种或多种)方法将丝氨酸蛋白酶封装。
在一些优选的实施方案中，封装材料典型的封装了至少一部分丝氨酸蛋白酶催化剂。在一些实施方案中，封装材料是可溶于水的和/或可分散于水中的。在其他一些实施方案中，封装材料具有0°C或更高的玻璃态转变温度(Tg)(见例如，WO 97/11151，特别是从第6页第25行至第7页第2行，关于玻璃态转变温度的更多信息)。
在一些实施方案中，封装材料选自碳水化合物、天然的或合成的树胶、几丁质、壳聚糖、纤维素和纤维素衍生物、硅酸盐、硫酸盐、硼酸盐、聚乙烯醇、聚乙二醇、石蜡，及其组合物。在一些封装材料是碳水化合物的实施方案中，所述封装材料选自单糖、寡糖、多糖，及其组合物。在一些优选的实施方案中，封装材料是淀粉(见例如，EP 0 922 499;和每个专利号4，977，252，5，354，559和5，935，826，关于一些示例性的合适淀粉的描述)。
在其他实施方案中，封装材料包含由塑料制造的微球，如热塑性塑料、丙烯腈、甲基丙烯腈、聚丙烯腈、聚甲基丙烯腈及其混合物；可使用的市售微球包括但不限于由 EXPANCEL (Casco Products, Stockholm, Sweden)、PM 6545、PM 6550、PM 7220、PM 7228, EXTENDOSPHERES 、Q- CEL (PQ Corp.，Valley Forge, PA)、LUXSIL 和 SPHERICEL (Potters Industries, Inc. , Carlstadt, NJ and Valley Forge, PA)。
因此，在一些实施方案中，本发明提供了在至少一组洗涤条件下(例如，水温、水硬度和/或去垢剂浓度)表现出令人惊讶的洗涤性能的变体蛋白酶。在一些实施方案中， 本发明的变体蛋白酶的洗涤性能与其他枯草杆菌蛋白酶是可比较的。在一些实施方案中， 本发明的变体蛋白酶相比目前市售的枯草杆菌蛋白酶表现出增强的洗涤性能。因而，在本发明的一些优选的实施方案中，本文提供的变体蛋白酶表现出增强的氧化稳定性、增强的热稳定性和/或增强的螯合剂稳定性。此外，本发明的变体蛋白酶可应用于不含有去垢剂的清洁组合物，仍然是单独的或与增洁剂和稳定剂组合。
在本发明的一些实施方案中，清洁组合物包含以组合物重量计约0. 00001%至约 10%水平的至少一种本发明的变体蛋白酶，和以组合物重量计包含清洁附加材料的余量 (例如，约99. 999%至约90.0%)。在本发明的其他方面，本发明的清洁组合物包含以组合物重量计约0. 0001%至约10%，约0. 001%至约5%，约0. 001%至约2%，约0. 005%至约 0. 5%水平的至少一种变体蛋白酶，和包含清洁附加材料的清洁组合物余量(例如，以重量计约 99. 9999 % 至约 90. 0 %，约 99. 999 % 至约 98 %，约 99. 995 % 至约 99. 5 % )。
如本文进一步所述，在一些实施方案中，优选的清洁组合物除了本文提供的变体蛋白酶外，还包含一种或多种其他酶或酶衍生物，以提供清洁性能益处。这些酶包括但不限于其他蛋白酶、脂肪酶、角质酶、淀粉酶、纤维素酶、过氧化物酶、氧化酶(例如漆酶)和/或甘露聚糖酶。
制造和使用自动化洗碗去垢剂组合物的方法
在一些优选的实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂组合物可配制成任意合适的形式，并可由配制者选择的任意方法制备，(见例如，美国专利号5，879，584,5, 691，297, 5，574，005,5, 569，645,5, 565，422,5, 516，448,5, 489，392 和 5，486，303，关于一些非限制性示例)。在一些需要低PH自动化洗碗去垢剂组合物的实施方案中，通过加入酸性物质例如HCl来调节该组合物的pH。
附加材料
虽然对于本发明的目的不是关键的，在一些实施方案中，本文所述的附加材料的非限制性列表是适用于本发明的自动化洗碗去垢剂组合物中的。实际上，在一些实施方案中，附件材料整合到本发明的自动化洗碗去垢剂组合物中。在一些实施方案中，附件材料帮助和/或增强清洁性能、处理待清洁的底物，和/或修饰组合物的美感(例如，香料、着色剂、染料等)。可以理解，此类附加物是除本发明的丝氨酸蛋白酶之外的。这类额外组分的精确性质，及其整合的水平，将取决于组合物的物理形式和使用它的自动化洗碗清洁操作的方式。合适的附加材料包括但不限于表面活性剂、增洁剂、螯合试剂、染料转移抑制剂、沉淀助剂、分散剂、其他酶、酶稳定剂、催化材料、漂白活化剂、漂白增强剂、过氧化氢、过氧化氢源、预制的过氧酸、聚合分散剂、粘土去除剂和/或抗再沉淀剂、增白剂、消泡剂、染料、香料、结构弹性剂(structure elasticizing agent)、软化剂(softeners)、载体、助水溶剂、 加工助剂和/或色素。除本文明确提供的之外，其他例子也是本领域已知的(见例如，美国专利号5，576，282,6, 306，812和6，326，348)。在一些实施方案中，前述附加成分可构成本发明的自动化洗碗去垢剂组合物的余量。
表面活性剂
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂组合物包含至少一种表面活性剂或表面活性剂系统，其中表面活性剂选自非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂、阳离子表面活性剂、两性表面活性剂、两性离子表面活性剂、半极性非离子表面活性剂和其混合物。 在一些低PH清洁组合物的实施方案中(例如，具有从约3至约5的净pH的组合物)，组合物典型的不含乙氧基化烷基硫酸盐，因认为此类表面活性剂可被此类组合物水解为酸性内容物。在一些实施方案中，表面活性剂存在的水平是从约0. 至约60%，而在可选的实施方案中，水平是从约1 %至约50 %，而在仍进一步的实施方案中，水平是从约5 %至约40 %， 按清洁组合物的重量计。
增洁剂
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂包含一种或多种去垢剂增洁剂或增洁剂体系。在一些整合了至少一种增洁剂的实施方案中，按自动化洗碗去垢剂的重量计， 自动化洗碗去垢剂包含至少约1 %，从约3 %至约60 %，或者甚至从约5 %至约40 %的增洁剂。增洁剂包括但不限于碱金属、多聚磷酸的铵和烷醇铵盐、碱金属硅酸盐、碱土金属和碱金属碳酸盐、硅酸铝、多元羧酸化合物、羟基多元羧酸醚、马来酸酐与乙烯或乙烯甲醚的共聚物、1，3，5-三羟基苯-2，4，6-三磺酸，和羧甲氧基琥珀酸、聚醋酸的各种碱金属、铵和取代铵的盐，如乙二胺四乙酸和次氮基三乙酸，以及多聚羧酸，如苯六甲酸、琥珀酸、柠檬酸、 氧基二琥珀酸、多聚马来酸、苯基1，3，5_三羧酸、羧甲氧基琥珀酸，及其可溶性的盐。实际上，可以预期本发明的各个实施方案中可使用任何合适的增洁剂。
在一些实施方案中，增洁剂形成可溶于水的硬离子复合物(例如，螯合增洁剂)， 例如柠檬酸和多聚磷酸(例如，三聚磷酸钠和三聚磷酸钠六水合物、三聚磷酸钾，和混合的三聚磷酸钠和钾，等)。可以预期本发明可使用任何合适的增洁剂，包括本领域已知的(见例如，EP 2 100 949)。
螯合剂
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂含有至少一种螯合剂。合适的螯合剂包括但不限于铜、铁和/或镁的螯合剂，及其混合物。在使用至少一种螯合剂的实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂按清洁组合物对象的重量计，包含从约0. 至约15%， 或者甚至从约3. 0%至约10%螯合剂。
抗再沉淀剂
如本文所示，在一些实施方案中，本发明的一些实施方案可使用抗沉淀剂。在一些优选的实施方案中，可使用非离子型表面活性剂。例如，在自动化洗碗的实施方案中，非离子型表面活性剂可用于表面修饰目的，特别是用于包覆(sheeting)，以避免产生薄膜和污点，并改善光泽。这类非离子型表面活性剂还可用于阻止污垢的再沉淀。在一些优选的实施方案中，抗再沉淀剂是本领域已知的非离子型表面活性剂(见例如，EP 2 100949)。
分散剂
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂含有至少一种分散剂。合适的可溶于水的有机材料包括但不限于同聚或共聚酸或其盐，其中多聚羧酸包含至少两个彼此分离不超过2个碳原子的羧基。
酶
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂含有一种或多种其他的去垢剂酶，其提供洗碗的清洁性能益处。合适的酶的例子包括但不限于半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase, β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。在一些实施方案中，使用酶的组合(即，“混合酶(cocktail)”)，包括常规可适用的酶，如使用蛋白酶、脂肪酶、角质酶和/或纤维素酶与淀粉酶的结合。
本发明的组合物可使用任何其他合适的蛋白酶。合适的蛋白酶包括动物、植物或微生物来源的蛋白酶。在一些特别优选的实施方案中，使用微生物蛋白酶。在一些实施方案中，包括了以化学或遗传方式修饰的突变体。在一些实施方案中，所述蛋白酶为丝氨酸蛋白酶，优选碱性微生物蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶。碱性蛋白酶的实例包括枯草杆菌蛋白酶，特别是来自芽孢杆菌的那些(例如，枯草杆菌蛋白酶、lentus, amyloliquefaciens, 枯草杆菌蛋白酶Carlsberg、枯草杆菌蛋白酶309、枯草杆菌蛋白酶147和168)。其他实例包括以下专利中描述的突变蛋白酶美国专利号RE34，606,5,955, 340,5, 700，676、 6，312，936和6，482，628，以上均并入本文作为参考。其他蛋白酶实例包括但不限于胰蛋白酶(例如，猪或牛来源的)和WO 89/06270中描述的镰刀菌蛋白酶。优选的市售蛋白酶包括 MAXATASE 、MAXACAL、MAXAPEM、0PTICLEAN 、0PTIMASE 、PR0PERASE 、 PURAFECT 、PURAFECT OXP、PURAMAX、EXCELLASE 禾口 PURAFAST (Genencor)； ALCALASE 、SAVINASE 、PRIMASE 、D υ R A ζ Y M、 POLARZYME 、 0V0ZYME 、 KANNASE 、 LIQUANASE 、 NEUTRASE 、 RELASE 和
ESPERASE (Novozymes) ； VX R BLAP(Henkel Kommanditgesellschaft auf Aktien> Duesseldorf、Germany)。多种蛋白酶描述于W095/23221、WO 92/21760、美国专利公开号 2008/0090747和美国专利号5，801，039,5, 340，735,5, 500，364,5, 855，625,US RE 34，606、 5，955，340,5, 700，676,6, 312，936和6，482，6 中，以及多种其他专利中。在一些进一步的实施方案中，金属蛋白酶可用于本发明中，包括但不限于WO 07/044993中描述的中性金属蛋白酶。
此外，本发明可使用任何合适的脂肪酶。合适的脂肪酶包括但不限于细菌或真菌来源的那些。经化学或遗传修饰的突变体也包括在本发明之内。有用的脂肪酶的实例包括Humicola lanuginosa脂肪酶(见例如，EP 258068和EP 305216)、米赫根毛霉 (Rhizomucor miehei)脂肪酶(见例如，EP238023)、假丝酵母(Candida)脂肪酶，例如南极假丝酵母(C. antarctica)脂肪酶(例如，南极假丝酵母脂肪酶A或B ；见例如，EP214761)、 假单胞菌O^eudomonas)脂肪酶，例如产碱假单胞菌(P. alcaligenes)和类产碱假单胞菌 (P.pseudoalcaligenes)脂肪酶(见例如，EP 218272)、洋葱假单胞菌(P. cepacia)脂肪酶 (见例如，EP 331376)、斯氏假单胞菌(P. stutzeri)脂肪酶(见例如，GB 1，372，034)、荧光假单胞菌(P. fluorescens)脂肪酶、芽孢杆菌脂肪酶(例如，枯草芽孢杆菌脂肪酶[Dartois 等，Biochem. Biophys. Acta 1131 :253-260 [1993])；嗜热脂肪芽孢杆菌脂肪酶[见例如，JP 64/744992]；以及短芽孢杆菌脂肪酶[见例如，WO 91/16422])。[0099]此外，多种克隆的脂肪酶可用于本发明的一些实施方案，包含但不限于沙门柏干酪青霉(Penicillium camembertii)脂肪酶(参见，Yamaguchi 等人，Gene 103 61-67 [1991])、白地霉(Geotricum candidum)脂肪酶(参见，Schimada 等人，J. Biochem.， 106 =383-388[1989])和多种根霉(Rhizopus)脂肪酶，例如德氏根霉(R. delemar)脂肪酶 (参见，Hass 等人，Gene 109 :117_113[1991])、雪白根霉(R. niveus)脂肪酶(Kugimiya 等人，Biosci. Biotech. Biochem. 56 :716-719 [1992])和米根霉(R. oryzae)脂肪酶。
其他类型的脂肪水解酶(如角质酶)也可用于本发明的一些实施方案中，包含但不限于源自门多萨假单胞菌O3SeudomonaS mendocina)的角质酶(参见WO 88/09367)，或源自腐皮镰孢菌(Fusarium solani pisi)的角质酶(参见WO 90/09446)。
其他合适的脂肪酶包含市售脂肪酶例如M1LIPASE、LUMA FAST和 LIP0MAX(Genencor) ； LIP0LASE 禾口 LIPOLASE ULTRA(Novozymes)；禾口 LIPASE P〃 Amano “ (Amano Pharmaceutical Co· Ltd·，EH )。
在本发明的一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含脂肪酶，水平为占组合物重量的0.00001%至10%，以及占组合物重量的余量清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含脂肪酶，水平为占组合物重量的0. 0001%至 10%,0. 001%至 5%，0. 001%至 2%，0. 005%至 0. 5%。
任何适合在碱性溶液中使用的淀粉酶(α和/或β)都可用于本发明。合适的淀粉酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。可用于本发明的淀粉酶的实例包含但不限于获得自地衣芽孢杆菌的 α-淀粉酶(参见例如，GB 1, 296, 839) 0可用于本发明的市售淀粉酶包含但不限于
DURAMYL 、TERMAMYL 、FUNGAMYL 、STAINZYME 、STAINZYME PLUS 、
STAINZYME ULTRA 和 BAN(Novozymes)，以及 P0WERASE、RAPIDASE 和 MAXAMYL P (Genencor)。
在本发明的一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含淀粉酶，水平为占组合物重量的约0. 00001%至约10%的其他淀粉酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含淀粉酶，水平为占组合物重量的约0. 0001%至约10%，约0. 001%至约5%，约0. 001%至约2%，约0. 005%至约 0. 5%。
任何合适的纤维素酶都可用于本发明的一些实施方案。合适的纤维素酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。合适的纤维素酶的实例包含但不限于Humicola insolens纤维素酶(参见例如，美国专利号4，435，307)。特别适合的纤维素酶是有颜色护理益处的纤维素酶(参见例如，EP 0 495 257)。可用于本发明的市售纤维素酶包含但不限于CELLUZYME (Novozymes)和 KAC-500 (B) (Kao Corporation)。在一些实施方案中，掺入的纤维素酶是成熟野生型或变体纤维素酶的部分或片段，其中缺失了 N端部分(参见例如，美国专利号5，874，276)。在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含纤维素酶，水平为占组合物重量的约0.00001%至约10%的其他纤维素酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含纤维素酶，水平为占组合物重量的约 0. 0001%至约 10%，约 0. 001%至约 5%，约 0. 001%至约 2%，约 0. 005%至约 0. 5%。[0106]任何适合在洗涤剂组合物中使用的甘露聚糖酶都可用于本发明。合适的甘露聚糖酶包含但不限于细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。 可用于本发明的多种甘露聚糖酶是已知的(参见例如，美国专利号6，566，114,6, 602，842 和6，440，991，均引入本文作为参考)。在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂还可以包含甘露聚糖酶，水平为占组合物重量的约0. 00001%至约10%的其他甘露聚糖酶， 以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含甘露聚糖酶，水平为占组合物重量的约0. 0001%至约10%，约0. 001%至约5%，约 0. 001%至约 2%，约 0. 005%至约 0. 5%。
在一些实施方案中，过氧化物酶与过氧化氢或其来源(例如，过碳酸盐、过硼酸盐或过硫酸盐)组合的使用。在一些替代性实施方案中，氧化酶与氧组合使用。。合适的过氧化物酶/氧化酶包含但不限于植物、细菌或真菌来源的。在一些实施方案中还包含了化学或遗传修饰的变体。在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂还可以包含过氧化物酶和/或氧化酶，其水平为占组合物重量的约0. 00001%至约10%的其他过氧化物酶和 /或氧化酶，以及以重量计，占余量的清洁辅助材料。在本发明的其他方面，本发明的自动化洗碗去垢剂还包含过氧化物酶和/或氧化酶，水平为占组合物重量的约0. 0001 %至约 10%，约 0. 001%至约 5%，约 0. 001%至约 2%，约 0. 005%至约 0. 5%。
在一些实施方案中，可应用其他酶，包含但不限于过水解酶(见例如WO 05/056782)。此外，在一些特别优选的实施方案中，本文涵盖了上述酶的混合物，特别是一种或多种其他蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶、至少一种甘露聚糖酶，和/或至少一种纤维素酶。实际上，本发明可以考虑使用这些酶的多种混合物。还考虑蛋白酶变体以及一种或多种其他酶的不同水平均可独立的达到10%，自动化洗碗去垢剂的余量为清洁辅助材料。考虑待清洁的物品，以及所述组合物用于自动化洗碗过程中的清洁条件的理想形式，可以方便的确定清洁附加材料的具体选择。
酶稳定剂
在本发明的一些实施方案中，用于本发明的去垢剂制剂的酶是稳定化的。在一些实施方案中，酶稳定剂包括寡糖、多糖和无机二价金属盐，包括碱土金属，例如钙盐。可以预期用于酶稳定化的各种技术都可用于本发明中。例如，在一些实施方案中，用于本文中的酶是通过向酶提供此类离子的终组合物中存在的可溶于水的锌(II)、钙(II)和/或镁(II) 离子，以及其他金属离子(例如，钡(II)、钪(II)、铁(II)、锰(II)、铝(III)、锡(II)、钴 (II)、铜(II)、镍(II)和六配位钒氧(IV)源来稳定的。盐酸和硫酸盐也可用于本发明的一些实施方案中。合适的寡糖和多糖(例如，糊精)的例子是本领域已知的(见例如，WO 07/145964)。在一些实施方案中，也可使用可逆的蛋白酶抑制剂，例如，当需要时，含硼的化合物(例如，硼酸盐、4-甲酰基苯基硼酸)和/或三肽醛可用于进一步改善稳定性。
漂白剂、漂白活化剂和漂白催化剂
在一些实施方案中，本发明的组合物中存在漂白剂、漂白活化剂和/或漂白催化剂。在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂包含无机的和/或有机的漂白化合物。 无机漂白剂包括但不限于过氧化氢合物(例如，过硼酸盐、过碳酸盐、过磷酸盐、过硫酸盐和过硅酸盐)。在一些实施方案中，无机过氧化氢合物的盐是碱金属盐。在一些实施方案中， 无机过氧化氢合物的盐作为结晶固体包括，没有额外的保护，但在其他一些实施方案中，所述盐是经包被的。本领域已知的任何合适的盐可用于本发明中(见例如，EP 2 100 949)。
在一些实施方案中，本发明的组合物中使用漂白活化剂。漂白活化剂典型的是在 60°C和更低温度下的清洁过程中，增强漂白作用的有机过酸前体。适用于本文中的漂白活化剂包括这样的化合物，其在过水解的条件下产生两性过氧羧酸，所述两性过氧羧酸优选具有从约1至约10个碳源子，特别是从约2至约4个碳源子，和/或任选取代的过苯甲酸。 其他的漂白活化剂是本领域已知的，可用于本发明中(见例如，EP 2 100 949)。
此外，在一些实施方案中和如本文进一步所述，本发明的自动化洗碗去垢剂进一步包含至少一种漂白催化剂。在一些实施方案中，可使用三氮杂环壬烷锰和相关的复合物， 以及钴、铜、锰和铁复合物。其他的漂白催化剂可用于本发明中(见例如，US 4, 246,612, 5，227，084、4，810410、W099/06521 和 EP 2 100 949)。
催化金属复合物
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂含有一种或多种催化金属复合物。在一些实施方案中，可使用含金属的漂白催化剂。在一些优选的实施方案中，金属漂白催化剂包含催化系统，所述催化系统包含确定漂白催化活性的过渡金属阳离子(例如， 铜、铁、钛、钌、钨、钼或锰阳离子)、具有少量或无漂白催化活性的辅助金属阳离子(例如， 锌或铝阳离子)和对催化和辅助性的金属阳离子具有确定的稳定常数的多价螯合剂，特别是使用乙二胺四乙酸、乙二胺四(亚甲基磷酸)及其可溶于水的盐(见例如，美国专利号 4，430，对；3)。在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂是通过锰化合物催化的。此类化合物和使用水平是本领域普遍已知的(见例如，美国专利号5，576, 。在其他实施方案中，钴漂白催化剂可用于本发明的自动化洗碗去垢剂。多种钴漂白催化剂是本领域已知的(见例如，美国专利号5，597，936和5，595，967)，且是通过已知的程序易于制备的。
在其他一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂包括巨多环刚性配体(MRL) 的过渡金属复合物。作为实践的模式而非进行限制，在一些实施方案中，调节本发明提供的组合物和清洁过程，在含水的清洗基质中提供数量级为至少百万分之一的活性MRL，在一些优选的实施方案中，在清洗液中提供从约0. 005ppm至约25ppm，更优选从约0. 05ppm至约 IOppm,最优选从约0. Ippm至约5ppm的MRL。
在即时过渡金属漂白催化剂中优选的过渡金属包括但不限于锰、铁和铬。优选的MRL也包括但不限于交联的特定超刚性配体(例如，5，12- 二乙基_1，5，8，12-四氮杂双环[6.6.2]十六烷)。通过已知的程序可以方便的制备合适的过渡金属MRL(见例如，WO 2000/32601 和美国专利号 6，225，464)。
金属护理剂
在一些实施方案中，本发明的自动化洗碗去垢剂包含金属护理剂。金属护理剂可用于防止和/或降低金属的晦暗、腐蚀和/或氧化，包括铝、不锈钢和非铁金属(例如，银和铜)。合适的金属护理剂包括在EP 2 100 949,WO 9426860和WO 94/26859中描述的。在一些实施方案中，金属护理剂是锌盐。在一些进一步的实施方案中，按一种或多种金属护理剂的重量计，本发明的自动化洗碗去垢剂包含从约0. 至约5%。
制造和使用自动化洗碗去垢剂的方法
本发明的自动化洗碗去垢剂可配制成任何合适的形式，并通过制剂师选定的任何工艺来制备(见例如，美国专利号5，879，584，5，691，297，5，574，005，5，569，645，5，565，422,5，516，448,5，489，392,5，486，303,4，515，705,4，537，706,4，515，707, 4，550，862,4, 561，998,4, 597，898,4, 968，451,5, 565，145,5, 929，022,6, 294，514 和 6，376，445)。
在一些实施方案中，以单位剂量形式提供本发明的自动化洗碗去垢剂，包括片剂、 胶囊、囊剂、小袋和多间隔的小袋。在一些实施方案中，单位剂量模式设计为提供多间隔的小袋(或其他的单位剂量模式)中的成分的受控缓释。合适的单位剂量和受控释放模式是本领域已知的(见例如，EP 2100 949,WO 02/102955、美国专利号4，765，916和4，972，017 和W004/111178，关于适合用于单位剂量和受控释放模式的材料)。
鐘
提供以下实施例是为了证实和进一步示例本发明的某些优选实施方案和各方面， 而并非视为对发明范围的限制。
在下文的实验公开内容中将使用以下缩写ppm(百万分之一)；M(摩尔/升)； mM(毫摩尔/升)；μ M(微摩尔/升)；nM(纳摩尔/升)；mol (摩尔)；mmol (毫摩尔)； μπιο (微摩尔)；nmol (纳摩尔)；gm (克)；mg (毫克)；Pg (微克)；Pg (皮克)；L (升)；ml 和mL(毫升)；μ 和4 1^(微升)；cm(厘米)；mm(毫米)；^111(微米)；nm(纳米)；U(单位)；V(伏特)；MW(分子量)；sec(秒)；min(分钟)；h和hr(小时)；V (摄氏度)； QS(足量)；ND(未进行)；NA(不适用的)；rpm(每分钟转数)；w/v(重量比体积)；ν/ν(体积比体积)；g (重力)；OD (光密度)；aa (氨基酸)；bp (碱基对)；1Λ (千碱基对)；kD (千道尔顿)；SUC-AAPF-pNA(琥珀酰-L-丙氨酰-L-丙氨酰-L-脯氨酰-L-苯丙氨酰-对硝基苯胺)；DMSO(二甲亚砜)；cDNA(拷贝或互补DNA) ；DNA(脱氧核糖核酸)；ssDNA(单链 DNA) ；dsDNA (双链DNA) ； dNTP (脱氧核糖核苷酸三磷酸)；DTT (1，4- 二硫代-DL-苏糖醇)； H20(水)；dH20(去离子水)；HCl (盐酸)；MgC12(氯化镁)；MOPS(3-[N-吗啡]丙磺酸)； NaCl (氯化钠)；PAGE (聚丙烯酰胺凝胶电泳)；PB92 (克劳氏芽孢杆菌(Bacillus clausii) 枯草杆菌蛋白酶)；PBS(磷酸缓冲盐水[150mM NaCl、IOmM磷酸钠缓冲液，pH 7.2])； PEG(聚乙二醇)；PCR(聚合酶链式反应)；PMSF(苯甲磺酰氟)；RNA(核糖核酸)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；SOCO^细菌用胰蛋白胨、0.5%细菌用酵母提取物、IOmM NaCl,2. 5mM KCl) ；Terrific培养液(TB ;12g/l细菌用胰蛋白胨、24g/l甘油、 2. 31g/l KH2P04 和 12. Mg/1 K2HP04) ；0D28(K280nm 处的光密度)；0D600 (600nm 处的光密度)；A405^)5nm处的吸光度)；Vmax (酶催化反应的最高起始速率)；HEPES (N-[2-羟乙基]哌嗪-N-[2-乙磺酸])；HBS(HEPES缓冲盐水)；Tris-HCl (三[羟甲基]氨基甲烷-盐酸盐)；TCA(三氯乙酸)；HPLC(高压液相层析)；RP-HPLC(反向高压液相层析)；TLC(薄层层析)；EDTA(乙二胺四乙酸)出tOH(乙醇)；SDS(十二烷基硫酸钠)；Tris(三(羟甲基)氨基甲烷)；TAED(N，N, N’ N’-四乙酰基乙二胺)；PI (性能指数)；SR(污垢或污渍去除)；MS(质谱)；AATCC(美国纺织化学及色料师协会)；Arzberg(Arzberg-Porzellan GmbH, Schirnding, Germany) ；BASF(BASF Corp., Florham Park, NJ) ；BioRad(BioRad, Richmond, CA) ；Cognis(Cognis Corp, USA, Cincinnati, OH) ；Finnzymes(Finnzymes Oy, Espoo, Finland) ；Genencor(Danisco US, Inc., Genencor Division, Palo Alto, CA)； Henkel (Henkel, GmbH, Dusseldorf, Germany) ；IKff (Industrieverband K β rperf lege und Waschmittel,= The German Cosmetic, Toiletry, Perfumery and Detergent As soc iat ion, Frankfur t, Germany) ；Invitrogen(Invitrogen Corp. , Carlsbad, CA) ；Kontron (Kontron Instruments, Zurich, Switzerland) ；Macherey-Nagel(Macherey-Nagel, Easton, PA) ；Miele(Miele, Princeton, NJ)Merieux (Instirut Merieux, Codex, FR)； Qiagen(Qiagen, Inc., Valencia, CA) ； (Reckitt Benckiser, Berks, United Kingdom)； Sigma (Sigma Chemical Co. , St.Louis, MO) ；Sorvall (Sorvall Instruments, a subsidiary of DuPont Co. , Biotechnology Systems, Wilmington, DE)； 禾口 wfk Testmaterials(Testgewebe GmbH, Bruggen-Bracht, Germany)。
实施例1
构津枯草杆菌蛋白酶变体
通过本领域已知的融合PCR，制备枯草杆菌蛋白酶变体(见例如，美国公开号 2006/0252155，通过引用整合到本文中)。表1_1提供了融合PCR使用的引物序列。
权利要求
1.包含SEQID NO :8所述氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体。
2.包含权利要求
1的枯草杆菌蛋白酶变体的自动化洗碗去垢剂组合物。
3.权利要求
2的自动化洗碗去垢剂组合物，其中所述组合物是液体去垢剂。
4.权利要求
2的自动化洗碗去垢剂组合物，其中所述组合物是粉末、片剂、凝胶或颗粒状去垢剂。
5.权利要求
2的自动化洗碗去垢剂组合物，其中所述组合物不含磷酸盐。
6.权利要求
2的自动化洗碗去垢剂组合物，进一步包含至少一种漂白剂。
7.权利要求
2的自动化洗碗去垢剂组合物，进一步包含至少一种其他的酶。
8.权利要求
7的自动化洗碗去垢剂组合物，其中所述至少一种其他的酶选自半纤维素酶、纤维素酶、过氧化物酶、蛋白酶、金属蛋白酶、木聚糖酶、脂肪酶、磷脂酶、酯酶、过水解酶、角质酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、甘露聚糖酶、角蛋白酶、还原酶、氧化酶、酚氧化酶、脂氧合酶、木质素酶、支链淀粉酶、鞣酸酶、戊聚糖酶、malanase、β -葡聚糖酶、阿拉伯糖苷酶、透明质酸酶、软骨素酶、漆酶和淀粉酶，或其混合物。
9.清洁的方法，包括提供待清洁的餐具物品和包含具有SEQID NO :8所述氨基酸序列的枯草杆菌蛋白酶变体的组合物，并将所述物品或表面与所述组合物接触。
10.权利要求
9的方法，进一步包括清洗所述待清洁的餐具物品的步骤。
专利摘要
本发明提供了芽孢杆菌属的枯草杆菌蛋白酶变体。此外，本发明提供了包含该丝氨酸蛋白酶变体的自动化洗碗组合物。
文档编号C12N9/54GKCN102209782SQ200980144943
公开日2011年10月5日 申请日期2009年11月10日
发明者A·J·保罗斯, D·A·埃斯特尔, F·齐德戈伯 申请人:丹尼斯科美国公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan