具有增大的种子大小的转基因植物的制作方法

专利名称:具有增大的种子大小的转基因植物的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种具有增大种子大小的转基因植物和制备该植物的方法。
技术背景
为了增大植物种子的大小，已经开展了杂交育种和随机突变目的基因的工作。但是迄今为止还没有建立起令人满意的植物目的基因的突变技术。因此，人工修饰还很困难。 虽然已经分离了与种子大小相关的基因，但绝大多数这些鉴定的基因都是调控种子大小的基因，因为毁坏这些基因导致种子增大或减小。
导入了增大种子大小基因的转基因植物的一个例子是导入了源自水稻 PLAST0CHR0N1 基因(National Center for Biotechnology Information (NCBI)注册号 AB096259)的水稻，其中利用二元载体和通过电穿孔的方法将该基因导入水稻植物，从而增大该水稻种子的重量(日本专利公开号(kokai) :2005-204621A)。这种转基因植物是通过将源自水稻的基因导入水稻植物来制备。但将这种基因导入其他非水稻植物时，是否能够增大种子大小还不知道。
本发明公开
本发明要达到的目的
本发明的目的是鉴定与增大种子大小有关的DNA和提供通过将该DNA导入植物从而使种子大小增大的转基因植物和制备该植物的方法。
实现本发明目的的手段
本发明者们为了达到以上目的，进行了集中的研究。结果，他们通过利用Fox狩猎系统(Fox hunting system)鉴定了与种子大小增大有关的基因，将这种基因导入植物，使其在植物里过表达，从而完成本发明。
本发明概述如下
[1] 一种转基因植物，其中导入了编码以下(a)-(c)任意一种蛋白的DNA，使其能够在植物中表达
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(c)包含与SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[2] 一种转基因植物，其中导入了以下(d)-(g)任意一种DNA，使其能够在植物中表达
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；
(f)包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或
(g) 一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
[3] 一种转基因植物，其中导入了编码以下(h)-(j)任意一种蛋白的DNA，使其能够在植物中表达
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[4]根据[1]_[3]任一项的转基因植物，其中所述增大种子大小的活性是增大种子表面积、大小或重量的活性。
[5]根据[1]_[4]任一项的转基因植物，其是植物、植物的部分、培养的植物细胞或种子。
[6]包含编码以下(a) -(c)任何一种蛋白的DNA的重组载体
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(c)包含与SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[7]包含以下(d)(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；
(f)包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或
(g) 一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
[8]包含编码以下(h)(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[9] 一种制备转基因植物的方法，其包括将编码以下(a)-(c)任何一种蛋白的DNA 导入植物细胞并且培养植物
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或[0041](c)包含与SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[10] 一种制备转基因植物的方法，其包括将以下(d)-(g)任何一种DNA导入植物细胞并且培养植物
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；
(f)包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或
(g) 一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
[11] 一种制备转基因植物的方法，其包括将编码以下(h)-(j)任何一种蛋白的 DNA导入植物细胞并且培养植物
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
[12]根据[9]_[11]任何一项的方法，其中DNA的导入是利用前述[6]-[8]任一项的重组载体。
本申请要求日本专利申请序列号2008-267877的优先权，其说明书和/或附图公开的内容结合到本申请中。
本发明的效果
用于本发明的DNA涉及增大种子大小，将这种DNA导入植物和在植物里过表达导致产生具有增大种子大小的植物。因为如果对植物实施转化，则这种DNA能在植物里高表达，所以本发明适用于任何植物。即使被导入属于不同科的植物，用于本发明的DNA也能够增大种子大小。此外，本发明的转基因植物能使产生的农作物表现出较高的种子产量。通过增大种子大小，也能够提高植物产品的价值。
附图简述

图1示实例流程图。
图2示野生型种子和K06835和K15507的T2代种子。
图3示野生型种子和K32722的T2代种子。
图4示野生型种子和K42340的T2代种子。
图5示野生型种子的面积和K32722和K42340的T2代种子的面积。
图6的柱状图示野生型种子和K32722的T2代种子的面积。
图7的柱状图示野生型种子和K42340的T2代种子的面积。
图8示野生型种子和K32722的T2代种子的体积。
图9示具有高同一性的玉米、拟南芥(Arabidopsis thaliana)和苜蓿蛋白(即同源蛋白)的氨基酸序列与导入K32722的DNA(AK073303)编码的氨基酸序列的比较图。[0065]执行本发明的最佳模式
(1)涉及增大种子体积的DNA
用于本发明的涉及增大种子大小的DNA编码以下(a)-(c)的任何一种蛋白
(a)包含SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；
(b)包含源自SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(c)包含与SEQ ID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
或者，用于本发明的涉及增大种子大小的DNA是以下(d)-(g)的任何一种DNA:
(d)包含SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；
(e)包含源自SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；
(f)包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或
(g) 一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
或者，用于本发明的涉及增大种子大小的DNA是编码以下(h)-(j)的任何一种蛋白的DNA
(h)包含SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；
(i)包含源自SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或
(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
本文所用术语“具有增大种子大小的活性的蛋白(或DNA) ”指直接或者间接涉及增大种子大小的蛋白(或DNA)。
本文所用术语“DNA，，包括基因组DNA、基因、cDNA等。
本文所用术语“增大种子大小的活性”指任何活性，只要这种活性使种子大小大于野生型的种子。其例子包括增加种子表面积、体积或重量的活性。种子大小并没有特别限制，只要种子大小在统计学上显著大于野生型种子即可。例如，优选种子大小比野生型的种子大至少 5%,10%,15%,20%,25%,30%,35%,40%,45%,^； 50%。
本文所用术语“源自......氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨
基酸序列”意指例如特定氨基酸序列缺失1-10个、优选缺失1-5个氨基酸，特定氨基酸序列的1-10个、优选1-5个氨基酸被其它氨基酸置换，或者特定氨基酸序列增加1-10个、优选增加1-5个氨基酸。
本文所用表述“与......氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列”里的术
语“同一性”指90 %以上，优选95 %以上，更优选98 %以上，更优选99 %以上的同一性。
本文所用术语“同一性”指比对的两条氨基酸序列(或核苷酸序列)之间的匹配程度，以便使相同氨基酸残基数量(或相同核苷酸数量)最大化。具体来说，同一性为相同氨基酸残基数(或相同核苷酸数)相对于总氨基酸残基的数(或总核苷酸数)的百分比(%)。百分比同一性能用已知的算法确定，例如BLAST或FASTA。当在FASTA算法中引入间隔时，间隔的数量包含在氨基酸残基的总量中(或核苷酸的总量中)。
本文所用术语“源自......核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核
苷酸序列”意指例如特定核苷酸序列缺失1-10个、优选缺失1-5个核苷酸，特定核苷酸序列的1-10个、优选1-5个核苷酸被其它核苷酸置换，或者特定核苷酸序列增加1-10个、优选增加1-5个核苷酸。
本文所用表述“与......核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列”里的术
语“同一性”指90 %以上，优选95 %以上，更优选98 %以上，更优选99 %以上的同一性。
本文所用术语“严格条件”指在该条件下所谓的特异性杂交体能形成，而基本上没有非特异性的杂交体形成。在这种严格条件下，例如具有高同一性的核酸的互补链 (即DNA的组成核苷酸序列与特定核苷酸序列具有90%以上，优选95%以上，更优选98% 以上，更优选99%以上的同一性)可进行杂交，而同一性低于此水平的核酸的互补链不能进行杂交。更具体地，钠盐的浓度是15-750mM，优选50_750mM，更优选300-750mM ；温度是25°C -70°C，优选50°C -70°C，更优选55°C -65°C ；甲酰胺的浓度是0% -50%，优选 20% -50%，更优选35% -45%。另外在此严格条件下，用于洗涤杂交后的滤膜的钠盐浓度通常是 15-600mM，优选 50_600mM，更优选 300_600mM，温度是 50°C _70°C，优选 55°C -70°C, 更优选 60°C -65°C。
或者，在严格条件下，杂交可以在如下条件下进行室温到40°C并在的氯化钠/柠檬酸钠(SSC，Ix SSC指150mM氯化钠和15mM柠檬酸钠；pH 7. 0)的存在下；然后，于 50°C _68°C，在 0. Ix-Ix SSC (优选 0. Ιχ-O. 2x SSC)和 0. 1 % SDS 存在下，洗涤一次或数次。
用于本发明的DNA的核酸片段可以利用根据编码SEQ ID NO :2、4、6、8、9、10或11 的氨基酸序列的DNA序列或者根据SEQ ID NO :1、3、5、7的DNA序列设计的引物，以及利用从cDNA文库或基因组DNA文库得到的核酸作为模板，通过PCR扩增获得。这种DNA的核酸片段可以利用以上文库等获得的核酸作为模板和DNA片段(这种DNA的部分)作为探针通过杂交获得。或者，这种DNA核酸片段还可以通过利用本领域已知的各种核酸合成方法合成，例如化学合成。
上述DNA或者氨基酸的缺失、置换或者增加可以通过本领域已知的方法修饰编码相关蛋白的DNA实现。在DNA中导入突变可以通过例如Kunkel法或缺口型双链体法(Gapped duplex method)实现。导入突变还可用定点突变的突变试剂盒(例如 Mutant-K (Takara Bio Inc.)或 LA PCR 体外突变试剂盒(Takara Bio Inc.)) (Sambrook 等，1989，分子克隆实验指南，第二版，冷泉港实验室出版社；Ausubel等，1995，Short Protocols in Molecular Biology,第三版，John Wiley & Sons, Inc.)。
第一次发现用于本发明的DNA具有增大种子大小的活性是通过检测利用Fox狩猎系统得到的转基因植株系种子的大小，然后鉴定导入植株后产生显著比野生型大的种子的 cDNA。
Fox狩猎系统(即全长cDNA过表达子基因狩猎系统)是一种依据性状改变的用于阐释基因功能的技术，其中性状改变是因为在植物中导入全长cDNA后高表达所致(日本专利公开号(Saikohyo) 2003-018808A)。本发明中，水稻全长cDNA用作导入植物的全长cDNA， 可导入全长cDNA的植物的实例是拟南芥(Arabidopsis thaliana)，但不仅限于拟南芥。[0094]特别地，以下列方式利用Fox狩猎系统能鉴定用于本发明的DNA。
具体地，大约13，000种独立水稻全长cDNA以同等的比例制备成基因池(称作“归一化(normalization)”)，将这些cDNA整合入包含调控区域(例如启动子、增强子(例如转录增强子E21或omega序列)、终止子)和选择性标记(例如耐药基因)的T-DNA载体。 将得到的T-DNA载体导入农杆菌(Agrobacterium)，得到水稻全长cDNA表达文库(称作水稻FOX文库)，然后证实该文库是否反应了完整的cDNA分布。此后，用上述农杆菌通过浸花法(floral dipping method)转化拟南芥而得到转基因的拟南芥植株系(水稻FOX植株系)。在FOX狩猎系统中，即使植物感染用的文库包含数亿克隆，每个植株也只有一个或两个克隆导入。因而得到单株导入了不同克隆的转基因植株。
从由此获得的大约20，000个水稻FOX植株系的初级重组拟南芥(TO)收集Tl代种子，将其播种于包含抗生素的培养基，进而选择，因此得到Tl代转化植株。通过这种转化植株自花授粉得到的种子称为T2代种子。视觉观察T2代种子(例如，每株系50粒种子)，同时利用种子形态检测程序WINSEEDLE (Regent Instruments)进行分析，将种子图形数据输入计算机。WINSEEDLE程序根据种子的图形检测种子形态、大小和颜色。该程序测量种子的长和宽并输入计算机，因此得到其面积。以野生型拟南芥种子作为对照，筛选主体产生的种子显著比野生型种子大的植株系。播种和培养挑选出的植株系的种子，确证是否表现出增大种子大小的表型可以重复。提取可重复目的表型的种子的基因组DNA，通过PCR分离导入的水稻全长cDNA。这种cDNA称作使种子大小增大的候选DNA。候选DNA再次导入拟南芥， 过表达，证实种子是否增大，经过证实的水稻全长cDNA确定为具有增大种子大小的活性的 DNA(即编码具有增大种子大小活性的蛋白的DNA)。
以此种方式鉴定的DNA注册于NCBI，注册号如下所示
AK100982 (DNA 序列SEQ ID NO 1 ；氨基酸序列SEQ ID NO 2)；
AK099678 (DNA 序列:SEQ ID NO 3 ；氨基酸序列:SEQ ID NO 4)；
AK073303 (DNA 序列:SEQ ID NO 5 ；氨基酸序列:SEQ ID NO 6)；
AK071204 (DNA 序列SEQ ID NO 7 ；氨基酸序列SEQ ID NO :8)。
用上述源自水稻的氨基酸序列与源自其它植物种的氨基酸序列进行比较，编码高度一致的氨基酸序列的DNA和编码具有增大种子大小的活性的蛋白的DNA可用于本发明。 比较序列的同一性可以例如通过使用序列同源性检索程序(例如BLAST或FASTA)读取 NCBI或EMBL (欧洲分子生物学实验室)的序列数据库进行(例如Alteschul，S. F. et al., 1990, J. Mol. Biol. 15 :403-410 ；Karlin, S. and Altschul S. F. ，1990, Proc. Natl. Acad. Sci.，U. S. Α. ,87 :2264-2268)。
源自其它植物种的、与ΑΚ073303氨基酸序列具有高度同一性的氨基酸序列的例子包括源自玉米的氨基酸序列(SEQ ID N0:9 ;NCBI注册号ACF86069(氨基酸序列)和ΒΤ041064ΦΝΑ序列))、源自拟南芥的氨基酸序列(SEQ ID NO 10 ;NCBI注册号 NP#567660 (氨基酸序列)和 NM#118359 (DNA 序列))、源自苜蓿(Medicago truncatula)的氨基酸序列(SEQ ID NO 11 ；NCBI注册号AB拟8483 (氨基酸序列)和AC148915. 2 (DNA序列))。
(2)重组载体
构建用于转化植物的本发明的重组载体能通过将编码上述(a)-(c)和(h)-(j)任何一种蛋白的DNA或上述(d)-(g)任何一种DNA导入合适载体获得。作为载体，优选能通过农杆菌将目的DNA导入植物的基于pBI的、基于pPZP的、基于pSMA的载体和其他载体。 特别地，优选基于PBI的二元载体或者中间载体，其实例包括pBI 121、pBIlOl、pBIlOl. 2、 ρΒΙΙΟΙ.3和pBIG2113载体。二元载体是能在大肠杆菌和农杆菌中繁殖的穿梭载体。当植物感染了包含二元载体的农杆菌，位于载体上的LB序列和RB序列组成的边界序列之间的 DNA能够整合进入植物的核DNA。其他载体的实例包括基于pUC的载体，其能够直接使DNA 导入植物，例如PUC18、pUC19和pUC9载体。进一步的其他载体的实例包括植物病毒载体， 例如花椰菜花叶病毒(CaMV)、菜豆金色花叶病毒(BGMV)和烟草花叶病毒(TMV)载体。
当使用基于二元载体的质粒时，目的基因插入上述二元载体的边界序列之间(LB 和RB之间)，重组载体用大肠杆菌繁殖。接下来，将繁殖的重组载体通过电穿孔或其他方式导入例如根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)GV310U C58、LBA4404、EHAlOl 或 EHA105或者发根土壤杆菌(Agrobacterium rhizogenes) LBA1334,目的DNA再通过使用这种农杆菌导入植物。
刚开始时，为了将DNA插入载体，例如可利用的方法是用合适的限制性内切酶切割纯化的DNA，再将获得的DNA通过插入合适载体的限制性内切酶位点或多克隆位点连接到载体。
另外，有必要以使DNA发挥其功能的方式整合目的DNA进入载体。在这方面，启动子、增强子、终止子、当使用二元载体系统时需要的复制起点(例如源于Ti或Ri质粒的复制起点)、选择标记基因等可以连接到目的DNA的上游、内部或下游的载体区域。
启动子并不一定源自植物，只要是能在植物细胞起功能、在植物特定组织或特定的发育阶段诱导表达的DNA。其具体的实例包括花椰菜花叶病毒(CaMV) 35S启动子、胭脂氨酸合酶基因(NOS)的启动子、源于玉米的泛蛋白启动子、源于水稻的肌动蛋白启动子和源于烟草的I3R蛋白启动子。
增强子的实例包括包含CaMV 35S启动子的上游序列的增强子区域、转录增强子 E12和欧咪伽(omega)序列，这些增强子被用于提高目的DNA的表达效率。
终止子可以是能终止由启动子驱动的基因转录的任何序列，其实例包括胭脂氨酸合酶基因的终止子、章鱼碱合酶(0CQ基因的终止子和CaMV 35S RNA基因的终止子。
选择标记基因的实例包括潮霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因、新霉素抗性基因、双丙氨膦(bialaphos)抗性基因和二氢叶酸还原酶基因。
(3)转基因植物及其制备方法
本发明的转基因植物能通过将上述编码(a)-(c)和(h)-(j)任意一种蛋白的DNA、 上述(d)-(g)任意一种DNA或上述重组载体导入目的植物获得。本发明中，“导入DNA”意指这样一种情况，其中例如通过已知的遗传工程方法将目的DNA导入上述宿主植物细胞， 使得能够在其中表达。因此而导入的DNA能整合到宿主植物的基因组DNA或保持包含于外源载体内。
本文所用的条件“使得能够被表达”指在这样的条件下有调控序列例如启动子或增强子的存在时，DNA可组成型或诱导型表达。
导入DNA或重组载体可以通过已知方法实现，例如农杆菌法、PEG-磷酸钙法、电穿孔法、脂质体法、粒子基因枪法或显微注射法。农杆菌法包括利用原生质体的方法、组织碎片的方法和植物体的方法(原位法，the in planta method)。利用原生质体的方法能通过将原生质体和包含Ti质粒或Ri质粒的农杆菌(分别为根癌农杆菌或发根土壤杆菌 (Agrobacterium rhizogenes))共培养的方法以及将原生质体与农杆菌的原生质球融合的方法(原生质球法)来实现。利用组织碎片的方法能通过例如感染目的植物的无菌培养的叶盘或感染愈伤组织(未分化的培养细胞)来实现。另外，利用种子或植物体的原位法可以通过直接用农杆菌处理浸润种子、幼年植物(幼苗)、盆栽植物等来实现。这些植物转化的方法可以通过以下资料的说明实现，例如“Shinpan Model shokubutsu no jikken protocol, Idengakutekishuho kara genome kaiseki made，，( 華“新片反，|莫型—白勺实验方法,从遗传技术到基因组分析”)(Ko Shimamoto和Kiyotaka Okada指导，Shujunsha Co.，Ltd.，2001)。
DNA是否整合入植物体可以通过例如PCR、Southern杂交或Northern杂交证实。 例如从转基因植物制备DNA，根据目的DNA设计特异性引物，然后进行PCR。接下来，用扩增产物进行琼脂糖电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳或毛细管电泳，用溴乙锭、SYBR Green溶液等对凝胶进行染色，扩增产物作为单一条带被检测到。因此，转化被证实。还可以使用预先标记了荧光染料等的引物来进行PCR，然后检测到扩增产物。另外，转化还可以通过将扩增产物结合于固相物体例如微小培养板，接下来用荧光、酶或其他反应检测扩增产物。
或者，转化可以如下证实制备包含各种报告基因之一的载体，例如连接葡糖苷酸酶(GUS)、荧光素酶(LUC)、绿色荧光蛋白(GFP)、氯霉素乙酰转移酶(CAT)、或β-半乳糖苷酶(LacZ)的基因于目的DNA的下游区域，利用如上所述导入了载体的农杆菌转化植物，然后检测报告基因的表达水平。
用于本发明的待转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物，其实例包括但不限于十字花科(Brassicaceae)植物(包括拟南芥、卷心菜和油菜)、豆科(Leguminosae)植物 (包括豌豆、大豆、苜猜、赤豆(Phaseolus angularis)、马豆(horse bean)禾口豆工豆(Vigna sinensis))、禾本科(Poaceae)植物(包括水稻、玉米、大麦和小麦)、菊科(Compositae) 植物(包括草红花和向日葵)、胡麻科(Pedaliaceae)植物(例如芝麻)和大戟科 (Euphorbiaceae)植物(包括麻风树(Jatropha curcas)禾口蓖麻(Ricinus communis)。尤其优选种子植物，例如可食用的种子植物和用于榨油的种子植物。
本发明中，用于转化的植物材料可以是任何植物器官或组织，例如茎、叶、种子、胚芽、胚珠、子房、苗端、花药、花粉、以上植物器官和组织的部分、未分化的愈伤组织和培养的植物细胞(例如用酶处理去掉愈伤组织细胞壁而获得的原生质体)。当用原位法时，浸润种子和整个植物体都可以采用。
当培养的植物细胞用于转化时，为了从获得的转化细胞再生转化体，可以通过已知组织培养技术再生器官或生物体。本领域技术人员可容易地利用广泛已知的从植物细胞再生植物体的方法开展上述的操作。例如，从植物细胞再生植物体可以如下进行。
当植物组织或原生质体用作植物材料用于转化时，该植物组织或原生质体培养于培养基以便形成愈伤组织，其通过添加无机元素、维生素、碳源、作为能源的糖、植物生长调节剂(植物激素，例如植物生长素、细胞分裂素、赤霉素、脱落酸、乙烯和油菜素类固醇)等来制备，然后灭菌。然后植物组织或原生质体可以形成去分化的愈伤组织，它将增殖成为无定形的团块(下文称作“愈伤组织诱导”)。转移因此形成的愈伤组织到包含植物生长调节剂例如植物生长激素的新鲜培养基，进行进一步的分裂繁殖(继代培养)。
例如，当愈伤组织诱导开展于固体培养基例如琼脂以及继代培养通过液体培养物开展时，每种培养都能大量有效地开展。接下来，通过继代培养增殖的愈伤组织在合适的条件下培养诱导器官的再分化(下文称作“再分化诱导”)，最终再生获得完整植物体。可以通过适当地设定培养基中组分的类型和量，例如植物生长调节剂(例如植物生长激素和碳源、光、温度和其他条件)来实现诱导再分化。形成不定胚、不定根、不定枝、不定茎、不定叶等，这些不定器官通过再分化诱导进一步生长成为完整植物体。或者，这些不定器官也能在他们长成完整植物体之前以此形式(例如包囊化人工种子、干胚或者冻干细胞或组织的形式)保存。
本发明的转基因植物包括导入了编码以上(a)-(c)和(h)-(j)任何一种蛋白的 DNA以及以上(d)-(g)任何一种DNA的任何完整植物体、植物体的部分(例如叶、花瓣、茎、 根和花粉)、培养的植物细胞(例如愈伤组织和原生质体)和种子。另外，它还包括通过对植物体和其部分、培养细胞和子代植物体种子进行有性或无性繁殖获得的子代植物体。本发明的转基因植物可以通过从转基因植物获得繁殖材料例如种子和原生质体，然后培植或培养该繁殖材料从而进行大量的产生。
实施例
下文用下列实施例以更详细的方式介绍本发明，虽然本发明并不限于这些实施例。
(1)由FOX狩猎系统产生水稻FOX植株系
本实施例中，通过将SfiI克隆位点导入组成型表达载体pBIG2113N(Taji，Τ. et al·，Plant J. ,2002,24(4) :ρρ· 417-426 ；和 Becker，D. et al.，Nucleic Acid Res. , 1990, 18(1) :p. 203)而获得的pBIG2113SF用作以下的载体。
(i)制备归一化的水稻全长cDNA混合物
利用CAP捕获法从水稻制备全长cDNA。获得的cDNA克隆入Lambda ZAP或Lambda pLC-1-B的SfiI限制性内切酶之间的位点(参考文献=Seki, M. et al.，Plant J.，15， 707-720，1998)。利用载体序列对cDNA的5，末端和3，末端进行测序，然后对cDNA进行归类，鉴定了 20，000 个独立的克隆(参考文献Seki，M. et al.，Plant Physiol. Biochem.， 39，211-220，2001)。接下来，浓度为50ng/μ 1每个克隆取0. 5 μ 1份，混合所有克隆份于一支试管中。1 μ 1的混合物用于转化20 μ 1的电感受态细胞DHlOB (Gibco BRL, U. S. Α.)。混合大约200，000个生长于包含氨苄青霉素的琼脂培养基上的独立集落，并从中提取质粒。 由此获得的质粒称为归一化的水稻全长cDNA混合物。
(ii)制备水稻FOX文库
混合归一化的水稻全长cDNA混合物(2 μ g)和700 μ g的pBIG2113SF，同时用SfiI 进行完全的酶切。此后，切割好的产物用异丙醇沉淀浓缩。沉淀溶于8μ1水后加入Ιμ 的IOX缓冲液和1 μ 1的Τ4连接酶混合，于16°c过夜进行连接反应。将2 μ 1的反应溶液和40 μ 1的电感受态细胞DHlOB混合，进行转化。
混合大约150，000个生长于包含卡那霉素(Km)的琼脂培养基的独立集落，从中提取质粒。收集的质粒溶液(2 μ 1)和40 μ 1电感受态农杆菌细胞GV3101混合，进行转化。将大约150，000于包含卡那霉素的琼脂培养基上生长的独立菌落悬浮置入LB液体培养基， 加入甘油制成15%的甘油溶液。获得的溶液于_80°C保存。因此获得的甘油溶液称作水稻 FOX文库。
(iii)制备水稻FOX植株系
使上述水稻FOX文库的大约200，000个集落生长并悬浮于浸润溶液，用野生型拟南芥(C0Iombia(Col-O)进行浸花法。收获种子(Tl代种子)，让其于包含潮霉素的贫营养成分的培养基(BAM)上发芽，然后将只有大约20，000个表现出潮霉素抗性的植株系移植到土壤生长。让植物自花授粉，因此获得的种子称作T2种子，检测这些种子的大小。
(2)通过检测T2代种子筛选水稻FOX植株系，鉴定因果性DNA的核苷酸序列，再将 DNA导入拟南芥。
T2代种子以大约每株系50粒的量置入塑料培养板的孔中(图1(1))。当直观法检测种子时，显示种子的图像作为数据输入计算机(图1(幻)。同时，筛选产生的大部分的种子显著比野生型种子大的植株。用WINSEEDLE程序检测计算机图像中种子的长和宽，然后决定种子的面积(图1C3))。播种和培植筛选的植株系种子，证实在接下来的后代中是否能重复展现出增大种子大小的表型。从可重复目的表型的种子中提取基因组DNA，用PCR 分离导入的水稻全长cDNA，因此鉴定其核苷酸序列。
PCR反应溶液的组分示于表1，PCR的一个循环包括94°C 0. 5分钟，55°C 0. 5分钟和72 °C 4分钟，循环重复40次。
表 1
反应溶液的组成
引物(100 pM) dNTP (200 μΜ) 缓沖液(χ2) 聚合酶基因组DNA 蒸馏水
2 χ 0.25 μ 4μ1 25 μ 0.5 μ 10 μ 10 ul
总体积50 μ
以下是用于PCR的引物
GTACGTATTTTTACAACAATTACCAACAAC(SEQ ID NO :12)；
GGATTCAATCTTAAGAAACTTTATTGCCAA(SEQ ID NO :13)。
从琼脂糖凝胶中收集PCR产物，与pBIG2113SF混合，用SfiI进行完全的酶切，异丙醇沉淀后用T4连接酶处理。用获得产物转化大肠杆菌。筛选插入了 PCR产物片段的质粒，用上述的引物鉴定插入的因果性候选DNA的cDNA片段的核苷酸序列(图1 (4))。
以和FOX狩猎系统同样的方式将因果性候选DNA再次过表达于拟南芥(图1 (5))，检查种子大小是否会增加。证实的水稻全长CDNA称作增大种子大小的DNA。
(3)增大种子大小的DNA
在上面O)中发现的增大种子大小的DNA是导入下列四株Fox植株系的DNA(用数字标注出来)。括弧内的数字指示NCBI的注册号，用于本文核苷酸序列的SEQ ID NO指示导入水稻FOX植株系的DNA。
K06835(AK100982, SEQ ID NO 1)；
K15507(AK099678, SEQ ID NO 3)；
K32722(AK073303, SEQ ID NO 5)；
K42340 (AK071204, SEQ ID NO 7)。
图2示野生型种子以及K06835和K15507 T2代的种子。图3示野生型种子和 K32722 T2代的种子。图4示野生型种子和K42340 T2代的种子。根据这些图发现水稻FOX 植株系的种子比野生型的种子大。
比较野生型的种子面积和通过再将DNA导入拟南芥并且过表达的种子(T2代种子)面积，其中DNA是已经被用于导入K32722和K42340的DNA(图5)。和野生型的种子比较，发现K32722和K42340的种子面积增加了大约40%。
图6的柱形图示野生型种子的面积和K32722的T2代种子的面积(即K32722过表达植株系的种子面积的分布)。纵轴指示种子数量，横轴指示面积(即像素值)。野生型的种子在像素值为1，600时出现大峰，且这种峰呈现对称正态分布样的图形。相反，K32722的种子表现出大峰和小峰。小峰(灰色)出现在野生型种子相同的位置(即像素值是1，600 处)，大峰(黑色)出现在代表面积大于野生型种子的面积的地方(即像素值是2，200)。因为转化植株的表型主要出现在分离代(segregating generation)中，所以大峰被认为代表转化植株。组成小峰(像素值1，586)的种子的平均面积被发现和野生型的种子大体上一致(像素值1，591)，而组成大峰的种子的平均面积(像素值2，429)被发现比野生型种子的平均面积大了大约50%。
图7柱状图示野生型种子的面积和K42340的T2代的种子面积(即K42340过表达植株系的种子面积的分布)。纵轴指示种子数量，横轴指示面积(即像素值)。K42340表现出不规则峰。K42340种子的峰相对野生型种子移到了右边。这表明比野生型种子大的种子主要在该种群部分(population)。
图8示作为例子的K32722的T2代种子的球状体体积的计算结果(即K32722过表达植株系的种子体积)。和野生型的种子比较，K32722种子体积增加了大约50%。
图9示下列氨基酸序列的比较结果导入K32722的DNA (AK073303)的氨基酸序列 (SEQ ID NO 6)、玉米(科禾本科；属玉蜀黍属)的氨基酸序列(SEQ ID NO 9)、拟南芥 (科十字花科；属拟南芥)的氨基酸序列(SEQ ID N0:10)、苜蓿(科豆科；属苜蓿属) 的氨基酸序列(SEQ ID N0:11)。结果表明AK073303的DNA在不同科植物中高度保守。因此可以认为将编码SEQ ID NO :9、SEQ ID NO 10和SEQ ID NO 11的氨基酸序列的DNA导入植物可以导致种子大小的增大。
所有以上引述的出版物、专利和专利申请都通过引用整体结合到本文中。
权利要求
1.一种转基因植物，其中导入了编码以下(a)-(c)任意一种蛋白的DNA，使其能够在植物中表达(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(c)包含与SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
2.—种转基因植物，其中导入了以下(d)-(g)任意一种DNA，使其能够在植物中表达(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；(f)包含与SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或(g)一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的 DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
3.—种转基因植物，其中导入了编码以下(h)-(j)任意一种蛋白的DNA，使其能够在植物中表达(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
4.根据根据权利要求
1-3任一项的转基因植物，其中所述增大种子大小的活性是增大种子表面积、体积或重量的活性。
5.根据根据权利要求
1-4任一项的转基因植物，其是植物、植物的部分、培养的植物细胞或种子。
6.包含编码以下(a)-(c)任何一种蛋白的DNA的重组载体(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(c)包含与SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
7.包含以下(d)-(g)任何一种DNA的重组载体(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；(f)包含与SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或(g)一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
8.包含编码以下(h)-(j)中任何一种蛋白的DNA的重组载体(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
9.一种制备转基因植物的方法，其包括将编码以下(a)-(c)任何一种蛋白的DNA导入植物细胞并且培养植物(a)包含SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列的蛋白；(b)包含源自SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(c)包含与SEQID NO :2、4、6或8的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
10.一种制备转基因植物的方法，其包括将以下(d)-(g)任何一种DNA导入植物细胞并且培养植物(d)包含SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列的DNA ；(e)包含源自SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列缺失、置换或增加一个或几个核苷酸的核苷酸序列的DNA，所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性；(f)包含与SEQID NO :1、3、5或7的核苷酸序列具有90%以上同一性的核苷酸序列的 DNA，其编码的蛋白具有增大种子大小的活性；或(g)一种DNA，其在严格条件下与包含与SEQ ID NO :1、3、5或7的核苷酸序列组成的 DNA互补的核苷酸序列的DNA杂交，并且所述DNA编码的蛋白具有增大种子大小的活性。
11.一种制备转基因植物的方法，其包括将编码以下(h)-(j)任何一种蛋白的DNA导入植物细胞并且培养植物(h)包含SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列的蛋白；(i)包含源自SEQID NO :9、10或11的氨基酸序列缺失、置换或增加一个或几个氨基酸的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性；或(j)包含与SEQ ID NO :9、10或11的氨基酸序列具有90%以上同一性的氨基酸序列的蛋白，所述蛋白具有增大种子大小的活性。
12.根据权利要求
9-11任何一项的方法，其中DNA的导入是利用权利要求
6-8任一项的重组载体。
专利摘要
本发明公开了一种转基因植物，其导入的DNA编码包含源自例如水稻植物的特别氨基酸序列的蛋白，而且所述植物具有增大的种子。本发明还公开了一种制备该转基因植物的方法。
文档编号A01H5/00GKCN102245769SQ200980151312
公开日2011年11月16日 申请日期2009年10月16日
发明者吉积毅, 广近洋彦, 松井南, 栗山朋子, 高桥真哉, 黑田浩文 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所, 独立行政法人理化学研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan