专利名称:用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物及其制备方法与应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及溶解可逆聚合物技术领域：
，更具体地，涉及pH敏感再生型聚合物技术领域：
，特别是指一种用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物及其制备方法与应用。
背景技术
许多大分子聚合物在环境参数如pH、温度、离子强度和光照等发生改变时，能够在沉淀与溶解之间转换，这些物质就称之为可逆溶解聚合物，也可称为可溶-不可溶聚合物(soluble-1nsoluble carriers, S-1S)。用这种聚合物来固定化酶就可避免单独使用不溶性载体系统酶-底物的传质阻力，以及可溶性载体系统酶使用后不能回收的缺陷。而且，可逆溶解固定化酶还会对底物表现出更大的亲和力。可逆溶解聚合物的种种优点使得其正受到研究者们越来越多的关注，将其用于固定化纤维素酶显示有前景的应用。
黄月文等人用温敏的聚N-异丙基丙烯酰胺固定化纤维素酶，得到温敏性的固定化纤维素酶。让该固定化纤维素酶重复水解羧甲基纤维素(CMC)，使用5次后仍能保持80%以上的活力(纤维素科学与技术，4 (1996) 25 30)。Taniguehi等人用一种pH敏感的肠溶衣材料Eudragit L-100固定化纤维素酶，以I，3- 二甲氨基丙基-3-乙基碳二亚胺(EDC)作为交联剂，以不溶性的微晶纤维素为底物，进行水解，固定化后纤维素酶的贮藏稳定性有明显提高(Biotechnology and Bioengineering, 34 (1989) 1092 1097)。Yu Zhang 等人用EudragitL-100共价固定化纤维素酶，分别以不溶性的微晶纤维素和预处理过的稻杆为底物，5次循环水解后固定化酶的残留活力均保持在初始酶活的50%以上(BioresourceTechnologylOl (2010) 3153 3158)。Taniguchi等人还用另一种pH敏感的肠溶衣聚合物材料乙酸琥珀酸羟丙基甲基纤维素(AS-L)共价固定化纤维素酶，用其水解不溶性的玉米秸杆，经过9次反复沉淀-溶解后，固定化酶的酶活剩下约50% (酶活测定方法水解CMC20min)(Biotechnology and Bioengineering,39(1992)287 292)。
目前用于固定化纤维素酶的pH敏感聚合物种类不多，因此很有必要开发出更多性能优异，廉价易得的PH敏感聚合物载体。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一种用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物及其制备方法和应用，该用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物可逆溶解，且为两亲性聚合物，偏酸偏碱均可以溶解，可用其作为载体来制备水溶性固定化纤维素酶，从而实现纤维素酶的循环利用，此外，还可以和其它的敏感聚合物，如温度敏感或pH敏感聚合物形成两水相，实现酶的相转移催化和产物的分离同时进行，可以有效降低产物的抑制作用，因此具有很广阔的开发应用前景，适于大规模推广应用。[0006]为了实现上述目的，在本发明的第一方面，提供了一种用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物，其特点是，所述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物的粘均分子量为1. 04X 104,由甲基丙烯酸(MAA)、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯(DMAEMA)和甲基丙烯酸丁酯(BMA)经无规共聚而得到，其中所述甲基丙烯酸、所述甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和所述甲基丙烯酸丁酯的投料摩尔比为19 :1 :1。
在本发明的第二方面，提供了一种制备上述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物的方法，其特点是，将所述甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和所述甲基丙烯酸丁酯按投料摩尔比19 I I加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到。简记为聚合物P·。
较佳地，所述溶剂为去离子水，所述引发剂为亚硫酸氢钠和过硫酸铵，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在55°C的温度、转速为ISOrpm的条件下振荡反应24小时而实现。
较佳地，所述的方法还包括以下后续步骤分别用无水乙醇洗涤所述聚合反应得到的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物，再将其分散于去离子水中，加入氢氧化钠，磁力搅拌充分溶解，过滤处理除去不溶的聚合物，将得到的澄清的聚合物溶液的PH值调节至等电点，离心得到沉淀，室温下真空干燥，得到所述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物的纯品。
在本发明的第三方面，提供了一种可逆溶解固定化纤维素酶，其特点是，采用上述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物固定化纤维素酶而得到。
较佳地，所述固定化方法通过水溶性碳化二亚胺(EDC)为交联剂，采用共价结合法实现。
较佳地，所述固定化的具体过程为将所述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物均匀地分散于去离子水中，逐步调节PH至碱性并搅拌，待所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物完全溶解后调节pH至6.0，加入交联剂水溶性碳化二亚胺，室温下活化10 15min，然后加入纤维素酶液，室温下缓慢搅拌进行固定化，反应结束调节pH至3. 5 3. 6，离心去上清液得到沉淀，即为所述可逆溶解固定化纤维素酶。
在本发明的第四方面，提供了一种pH-热敏感再生型两水相体系，其特点是，包括热敏感成相聚合物，以及上述的或上述的方法制备的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物或上述的可逆溶解固定化纤维素酶。
较佳地，所述热敏感成相聚合物是聚合物PNB。聚合物Pnb是一种热敏感成相聚合物，具体制备方法参见曹学君等人申请的发明专利申请，申请号200910044915. 1，专利名称热敏成相聚合物、其制备方法及相关的热-PH敏感再生型两水相体系，公开号CN101475666。
在本发明的第五方面，提供了上述的pH-热敏感再生型两水相体系在分离生物产品中的应用。
在本发明中甲基丙烯酸和甲基丙烯酸丁酯均为市售品，甲基丙烯酸二甲氨基乙酯由N，N- 二甲基乙醇胺和甲基丙烯酰氯反应制得。
本发明的有益效果具体为本发明的设计并合成的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物可逆溶解，且为两亲性聚合物，偏酸偏碱均可以溶解，可用其作为载体来制备水溶性固定化纤维素酶，从而实现纤维素酶的循环利用，此外，还可以和其它的环境敏感再生型聚合物，如温度敏感或pH敏感聚合物形成两水相，实现酶的相转移催化和产物的分离同时进行，可以有效降低产物的抑制作用，因此具有很广阔的开发应用前景，适于大规模推广应用。
图1是本发明的pH敏感再生型聚合物制备的反应方程式。
图2是本发明的可逆溶解固定化纤维素酶制备的反应方程式。
图3是本发明的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物和热敏感再生型聚合物Pnb构成再生型两水相体系的相图。
具体实施方式
为更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明。其目的仅在于更好理解本发明的内容而非限制本发明的保护范围。
实施例1pH敏感再生型聚合物Pm制备
在250mL的具塞三角烧瓶中加入120mL的去离子水，5.1OmL甲基丙烯酸，O. 53mL甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和O. 5mL甲基丙烯酸丁酯，然后加入O. 1235g的过硫酸铵和O. 1235g的亚硫酸氢钠(APS-NaHSO3,1. 3% w/w)作为引发剂，充氮除氧10 15分钟。密封反应容器，于55°C，180rpm转速下水浴振荡反应24小时(反应方程式见图1)。反应结束，产物直接沉淀在三角瓶底部，沉淀物经无水乙醇洗涤三次以除去未反应的单体，再将其分散于一定量的去离子水中，加入一定量的氢氧化钠，磁力搅拌使充分溶解，过滤除去不溶物，得到的澄清的聚合物溶液 用3M HCl调节其pH值至等电点，离心得到沉淀，即为聚合物P·，室温下真空干燥，得到所述PH敏感聚合物的纯品，得率为85 %以上，通过乌氏粘度计法测定聚合物Pm的粘均分子量为1. 04X 104，通过称重法测得Pm等电点为pi = 3.1。
实施例2可逆溶解固定化纤维素酶的制备
准确称取1. OOg实施例1制备的Pm置于40mL去离子水中，滴加一定量的3MNaOH，磁力搅拌，待其完全溶解后，用3M HCl调节溶液pH至6. O后定容至50ml，所得载体聚合物溶液浓度为2% (w/v);加入O. 3g交联剂EDC，室温下活化载体Pm 10 15min ;之后加入纤维素酶液1.1lml (83. 25FPU)，室温下缓慢搅拌固定4小时(反应方程式见图2);固定化结束时，用311醋酸调节溶液？!1至3.5 3.6，8000印111，41离心lOmin，除去上清液得到沉淀；用O. 02mol/L醋酸溶液(含有lmol/L NaCl和Ca2Cl)冲洗沉淀三次，即得可逆溶解固定化纤维素酶，简记为聚合物-酶复合物Pm_C，将所得沉淀溶于pH5. 5的醋酸-醋酸钠缓冲液中，即得到所需的水溶性固定化纤维素酶，固定化酶活力回收率为63. 24%。
实施例3水溶性固定化纤维素酶水解不溶性的纤维素底物实验
在20g/L的底物浓度条件下，加入20FPU/g底物的呈溶解状态的固定化纤维素酶对经稀酸预处理过的玉米秸杆进行水解，水解温度为50°C，pH为5. 0，转速为120rpm，一小时水解结束后，IOOOOrpm离心5min去除未反应完的底物，用3M醋酸调节上清液pH至3. 5
3.6，8000rpm离心IOmin回收固定化酶，将其溶于O.1M(pH 5.0)的醋酸-醋酸钠缓冲溶液中，得到固定化酶液，测定其酶活，以此为一个循环。重复进行上述的操作过程5次。实验结果显示在固定化酶循环利用5次后，酶活回收率仍保持在83.1 %以上，还原糖的生成量为最初的72%左右。
实施例4pH_热敏感再生型两水相体系的配制
将实施例1制得的聚合物Pm与聚合物Pnb按图3所示的相图进行配制，聚合物P·与聚合物Pnb在水中的浓度达到图3中双节线以上时，可以形成两水相。Pm与Pnb的浓度均可通过在分光光度计下测定二者的吸光度，并且分别通过与已知浓度的Pm与Pnb标准曲线的计算中求得。
实施例5pH_热敏感再生型两水相体系的回收
聚合物Pm的回收可以通过调节溶液的pH值到聚合物等电点3.1使其沉淀，聚合物Pnb可以通过调节温度使其温度在临界温度33°C之上析出进行回收。Pmb-Pnb体系的回收率可以通过计算经过PH-热回收的沉淀蒸干至恒重的量与配制时加入聚合物的量的比值得到。Phib-Pnb体系的回收率也可以通过用配制时加入聚合物的量减去两相中经pH-热回收聚合物后残留的聚合物量而获得。残留聚合物的量可通过分光光度计法求得浓度，再乘以相体积或相重量而得。通过上述方法计算，聚合物P·的回收率为95%以上，聚合物Pnb的回收率可达到98%，两水相体系理论上可以循环使用40次以上。该再生型两水相体系具有潜在的应用价值，可广泛用于各种生物活性物质的提取分离与两水相体系生物催化反应，并可以保持生物质的活性和稳定性。
实施例6可逆溶解固定化纤维素酶的pH-热敏感两水相体系的配制及应用
将实施例2制得的聚合物-酶复合物Phib-C配制成5% (w/v)浓度的溶液，吸取等体积的P_-C与5% (w/v)的Pnb混合静止后可形成相体积比为1: 3的两水相体系。该体系可应用于相转移催化反应，含有固定化酶的聚合物和底物分布在下相，产物可溶性糖分配在上相，从而很好的解 决了产物抑制的问题，并可以提高产物得率。在含有聚合物-酶复合物的两水相体系中加入1%的底物，160rpm，30°C条件下反应结束后，纤维素的水解率与同等条件下单水相中催化反应相比提高了 10%以上。
本发明设计并合成的pH敏感再生型聚合物，会随着pH的改变而呈现可逆溶解状态，在交联剂EDC的作用下，将纤维素酶与该聚合物进行共价连接，得到的固定化酶在可溶状态下催化水解底物，尤其是水解不溶性底物时，酶与底物均匀接触可达到高效的酶解效果，不可溶状态下沉淀回收(回收率高达95%以上)，达到循环利用的目的，从而大大地降低了纤维素酶的使用成本。
本发明还提供了两种再生型两水相体系以及它们的应用，一种是pH敏感聚合物P—和热敏聚合物Pnb形成的再生型两水相体系，另一种是聚合物-酶复合物Pm-C和热敏聚合物Pnb形成的再生型两水相体系。形成两水相的聚合物均可高效回收并且循环使用，大大降低了使用成本，且回收简便，并可以保持生物质活性与稳定性。
综上所述，本发明的两种pH敏感再生型聚合物可逆溶解，由此形成的再生型两水相体系为PH敏感型，两成相聚合物可以高效回收，大大降低了使用成本，且回收简便，适于大规模推广应用。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以做出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。
权利要求
1.一种用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物，其特征在于，所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物的粘均分子量为1. 04X 104，由甲基丙烯酸、 甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸丁酯经无规共聚而得到，其中所述甲基丙烯酸、所述甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和所述甲基丙烯酸丁酯的投料摩尔比为19 :1 :1。
2.一种制备根据权利要求
1所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物的方法，其特征在于，将所述甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和所述甲基丙烯酸丁酯按投料摩尔比19 1 1加入溶剂中，再加入引发剂，在惰性气体存在下进行聚合反应得到。
3.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述溶剂为去离子水，所述引发剂为亚硫酸氢钠和过硫酸铵，所述惰性气体为氮气，所述聚合反应在55°C的温度、转速为ISOrpm的条件下振荡反应24小时而实现。
4.根据权利要求
2所述的方法，其特征在于，所述的方法还包括以下后续步骤分别用无水乙醇洗涤所述聚合反应得到的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物， 再将其分散于去离子水中，加入氢氧化钠，磁力搅拌充分溶解，过滤处理除去不溶的聚合物，将得到的澄清的聚合物溶液的PH值调节至等电点，离心得到沉淀，室温下真空干燥，得到所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物的纯品。
5.一种可逆溶解固定化纤维素酶，其特征在于，采用根据权利要求
1所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物固定化纤维素酶而得到。
6.根据权利要求
5所述的可逆溶解固定化纤维素酶，其特征在于，所述固定化通过水溶性碳化二亚胺为交联剂，采用共价结合法实现。
7.根据权利要求
5所述的可逆溶解固定化纤维素酶，其特征在于，所述固定化的具体过程为将所述的用于水溶性固定化纤维素酶的PH敏感再生型聚合物均匀地分散于去离子水中，逐步调节PH至碱性并搅拌，待所述的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物完全溶解后调节PH至6. 0，加入交联剂水溶性碳化二亚胺，室温下活化10 15min， 然后加入纤维素酶酶液，室温下缓慢搅拌进行固定，反应结束调节pH至3. 5 3. 6，离心去上清液得到沉淀，即为所述可逆溶解固定化纤维素酶。
8.一种pH-热敏感再生型两水相体系，其特征在于，包括热敏感成相聚合物，以及根据权利要求
1所述的或权利要求
2 4任一所述的方法制备的用于水溶性固定化纤维素酶的 PH敏感再生型聚合物或根据权利要求
5 7任一所述的可逆溶解固定化纤维素酶。
9.根据权利要求
8所述的pH-热敏感再生型两水相体系，其特征在于，所述热敏感成相聚合物是聚合物Pnb。
10.一种根据权利要求
8或9的pH-热敏感再生型两水相体系在酶的催化反应中的应用。
专利摘要
本发明涉及用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物，其粘均分子量为1.04×104，由甲基丙烯酸、甲基丙烯酸二甲氨基乙酯和甲基丙烯酸丁酯经无规共聚而得到，投料摩尔比为19∶1∶1，还涉及相关制备方法及应用，本发明的用于水溶性固定化纤维素酶的pH敏感再生型聚合物可逆溶解，且为两亲性聚合物，偏酸偏碱均可以溶解，可用其作为载体来制备水溶性固定化纤维素酶，从而实现纤维素酶的循环利用，此外，还可以和其它的环境敏感再生型聚合物，如温度敏感或pH敏感聚合物形成两水相，实现酶的相转移催化和产物的分离同时进行，可以有效降低产物的抑制作用，因此具有很广阔的开发应用前景，适于大规模推广应用。
文档编号C08F220/34GKCN102250278 B发布类型授权 专利申请号CN 201110138591
公开日2013年4月10日 申请日期2011年5月26日
发明者曹学君, 梁文娟, 刘晶晶 申请人:华东理工大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan