专利名称:一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法
技术领域：
本发明涉及一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法，属于食品生物技术领域：
。
背景技术：
交替鹿糖酶(alternansucrase)是一类催化葡糖基特异性转移的新型糖酶,属于水解酶GH70家族，它催化蔗糖发生聚合反应产生功能性葡聚糖，该类碳水化合物不仅具有免疫抗癌作用，预防高血压、动脉硬化，有助于减肥，还可以用作代血浆、凝胶过滤剂、优质凝胶等。
目前，国内外对交替蔗糖酶的研究工作停留在野生菌的筛选及酶学性质的研究阶段，而对柠檬明串珠菌优化发酵提高交替蔗糖酶产量的制造过程仍处于起步阶段。因此，在前期研究基础上，本发明人利用分离筛选的一株柠檬明串珠菌SK24.002菌株进行发酵产酶，同时通过控制温度、PH和碳源来调节菌体生长与糖酶的分泌表达，最终提高交替蔗糖酶产量。
发明内容
本发明的目的在于提供一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法。利用本发明可以提高交替蔗糖酶的产量及生产强度，有利于工业化规模生产。
本发明所使用的柠檬明串珠菌是本发明人先前从传统发酵泡菜中分离得到，其分类名为朽1檬明串珠菌(Zewcoflo1Sioc citreum) SK 24.002,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2011398。保藏日期2011年11月18日。该菌株已于2011年12月28日申请中国专利，申请号2011104464069，公开号CN102492644A，
公开日2012年6月13日。
本发明的技术方案:一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法，步骤为:
(1)菌体高密度生长阶段:以柠檬明串珠菌{Leuconostoc ci treum) SK24.002为出发菌株，控制发酵液中葡萄糖浓度水平，初始葡萄糖浓度为10g/L，发酵4h后开始流加葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度控制在15_20g/L，发酵温度控制在22-25°C，发酵pH控制在6.0，发酵17-24h后停止流加葡萄糖溶液，补料生长阶段结束。
(2)糖酶高效表达阶段:补料生长阶段结束之后调节发酵温度控制在28-30°C，pH控制在5.4，每隔6-10h补加质量浓度60%的蔗糖溶液，控制发酵液中的蔗糖浓度为5-10g/L,两阶段共计48h后结束发酵。
发酵培养基组成以g/L计:葡萄糖10，酵母粉5-10，胰蛋白胨5-10，K2HPO4 5-10,MgSO4.7H20 0.2-0.5，MnSO4.H2O 0.01-0.015，CaCl2 0.02-0.025，吐温 80 l_5mL/L，pH
6.8_7.0。
交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活力达到510-960 U/L。[0011]本发明中交替蔗糖酶的活力是以生物催化反应过程中产生果糖的量定义的，酶活力IU为每min产生I μ mo I果糖的量。将酶反应液稀释到合适倍数后过0.22 μ m的纤维素膜，然后进行高效液相(HPLC)分析，计算果糖含量(g/L)。色谱条件=Sugarpakl钙型阳离子交换柱；Shodex示差折光率检测器；柱温:85 1:;流动相:超纯水(经0.22 μ m膜过滤)；洗脱流速:0.4 mL/min ;上样体积:10 μ L ;10 mg/mL的果糖溶液为标准溶液。
本发明的有益效果:利用本发明能大幅度提高交替蔗糖酶的产量，总酶活力达到510-960 U/L，达到国内领先水平。本方法操作简单，能耗低，设备简单，大大降低了生产成本，适于工业化生产。本发明产品可以用于食品、化工、医药以及材料等多个领域，市场前景广阔，经济效益高。
具体实施方式
现结合具体实例进一步阐述本发明，但本发明保护的内容并不局限于实例。
实施例1
以柠檬明串珠菌SK24.002为研究菌株，控制发酵液中葡萄糖浓度水平，初始葡萄糖浓度为10g/L，发酵4h后开始流加葡萄糖溶液使其浓度控制在20g/L，发酵温度控制在220C，发酵pH控制在6.0，发酵24h后停止流加葡萄糖溶液；同时调节温度控制在28°C，pH控制在5.4，每隔IOh补加60%的蔗糖溶液，控制发酵液中的蔗糖浓度为5g/L，两阶段共计48h后结束发酵。发酵培养基组成以g/L计:葡萄糖10，酵母粉5，胰蛋白胨5，K2HPO4 10，MgSO4.7Η20 0.2，MnSO4.H2O 0.01，CaCl2 0.025，吐温 80 lmL/L, pH 7.0。交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活力达到740 U/L。
实施例2
以柠檬明串珠菌SK24.002为研究菌株，控制发酵液中葡萄糖浓度水平，初始葡萄糖浓度为10g/L，发酵4h 后开始流加葡萄糖溶液使其浓度控制在15g/L，发酵温度控制在250C，发酵pH控制在6.0，发酵17h后停止流加葡萄糖溶液；同时调节温度控制在30°C，pH控制在5.4，每隔6h补加60%的蔗糖溶液，控制发酵液中的蔗糖浓度为10g/L，两阶段共计48h后结束发酵。发酵培养基组成以g/L计:葡萄糖10，酵母粉10，胰蛋白胨10,K2HPO4 5，MgSO4.7Η20 0.5，MnSO4.H2O 0.015，CaCl2 0.02，吐温 80 5mL/L, pH 6.8。交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活力达到801 U/L。
权利要求
1.一种促进柠檬明串珠菌发酵生产交替蔗糖酶的调控方法，其特征在于步骤为: (1)菌体高密度生长阶段:以柠檬明串珠菌Ueuconostoe Cl treum) CCTCC NO:M2011398为出发菌株，控制发酵液中葡萄糖浓度水平，初始葡萄糖浓度为10g/L，发酵4h后开始流加葡萄糖溶液使发酵液中葡萄糖浓度控制在15_20g/L，发酵温度控制在22-25 °C，发酵PH控制在6.0，发酵17-24h后停止流加葡萄糖溶液，补料生长阶段结束； (2)糖酶高效表达阶段:补料生长阶段结束之后调节发酵温度控制在28-30°C，pH控制在5.4，每隔6-10h补加质量浓度60%的蔗糖溶液，控制发酵液中的蔗糖浓度为5-10g/L，两阶段共计48h后结束发酵； 发酵培养基组成以g/L计:葡萄糖10，酵母粉5-10，胰蛋白胨5-10，K2HPO4 5-10,MgSO4.7H20 0.2-0.5，MnSO4.H2O 0.01-0.015，CaCl2 0.02-0.025，吐温 80 l_5mL/L，pH6.8_7.0 ο
2.根据权利要求
1所述方法，其特征在于交替蔗糖酶在发酵液和菌体中的最终总酶活力达到 510-960 U/L。
专利摘要
一种促进柠檬明串珠菌发酵高产交替蔗糖酶的调控方法，属于食品生物技术领域：
。本发明提供一种诱导柠檬明串珠菌发酵分泌交替蔗糖酶的方法，以柠檬明串珠菌(Leuconostoccitreum)SK24.002为出发菌株，经斜面培养和种子培养后，接种在发酵培养基中，经采用温度、pH与碳源协同控制策略，实现提高交替蔗糖酶产量的目标，发酵液和菌体中的最终总酶活力达到510-960U/L。本发明的优点是能有效提高交替蔗糖酶产量及生产强度，并减少发酵液中杂蛋白的含量，提高了下游提取时的效率，生产费用降低，能耗减少，有利于工业化规模生产。
文档编号C12N9/10GKCN102732489 B发布类型授权 专利申请号CN 201210243809
公开日2013年6月19日 申请日期2012年7月16日
发明者江波, 缪铭, 白爱娟, 张涛, 许婷 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan