专利名称:一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法
技术领域：
一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌ZjOie氨肽酶稳定性的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域：
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背景技术
氨肽酶是一类从蛋白质或肽链的N端酶切氨基酸残基的外肽酶的总称。它在蛋白水解产品的制备中可作为组合复配用酶，起脱苦、深度水解，制备多功能活性肽等作用，还可作为N端测序工具酶和医疗诊断用酶。
酶作为一种生物催化剂，因其半衰期短、易失活等缺点严重影响着酶的使用效果。酶的稳定性是指酶分子抵抗各种不同因素影响，维持一定空间结构，保持催化活性相对稳定的能力，包括热稳定性、pH稳定性、抗氧化性和耐有机溶剂等方面。氨肽酶作为一种工业化酶制剂，其热稳定性是一个很关键的因素。酶的热稳定性提高具有明显的优势，延长酶的储存时间、减少在运输过程中的酶活损失，使酶在较高反应温度下延长酶的反应时间，提高生产效率，有效的降低生产成本。所以，如何提高酶的稳定性，从而扩大酶的应用范围的研究越来越引起人们的重视。
目前，提高酶稳定性的策略主要从酶分子改造和微环境改良两方面入手。酶分子改造包括定点突变、化学修饰以及酶固定化等方法；微环境改良包括添加保护剂、防腐剂、蛋白酶抑制剂、抗氧化剂和还原剂等。其中化学修饰是提高和改善酶催化性能的有效方法之一。酶的化学修饰，就是利用某些专一性化学试剂处理酶蛋白，使之与酶蛋白分子中的特定氨基酸残基反应，改变这些氨基酸残基侧链的化学结构和性质，从而改变活性中心原有的空间构象，或改变酶的辅因子的成分，进而改变酶原有的特性。酶的化学修饰在改变酶的专一性、稳定性、提高药用酶的半衰期消除免疫原性，甚至改变酶的催化反应类型等方面都已取得了重大进展。
氨肽酶分子上的Lys残基末端的ε -NH2由于具有较强的亲核性，可与小分子化学修饰剂丁二酸酐反应，从而改变酶分子的电荷以及结构，进而使酶的性质得到改善。对推动该酶今后的工业化生产和进一步的应用有积极的作用。
发明内容
本发明的目的是用丁二酸酐在经优化后的最佳修饰条件下对氨肽酶进行化学修饰，提供一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，显著提高了氨肽酶的热稳定性，修饰后酶对底物的亲和力也有所增加，同时伴随了一系列的酶学特性表征方面的变化。
本发明的技术方案:
枯草芽孢杆菌ZjOie的发酵液冷冻离心、澄清、超滤浓缩、脱盐、冷冻干燥，得食品级固体氨肽酶(中国专利201010578579.1已公开，公开号CN102078012A，
公开日2011-6-1)，在最佳化学修饰条件下，用丁二酸酐对所得的氨肽酶进行化学修饰，得到修饰酶，主要以酶活保留率和相对酶活力为依据，得到一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌ZjO 16氨肽酶稳定性的方法，其工艺为:
A、丁二酸酐对氨肽酶的化学修饰方法
通过单因素实验考查了修饰反应pH、修饰反应时间、修饰反应温度、修饰剂与酶的质量比这四个因素对化学修饰反应的影响，以酶活保留率为指标，得出最佳的化学修饰条件:
(I)称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，然后向混合液中缓慢加入IOmg的丁二酸酐(SA)，搅拌溶解，在整个反应过程中用2mol/LNaOH溶液维持反应体系的pH值为8.0，在4°C条件下反应lh，反应结束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，以除去多余的修饰剂，得到丁二酸酐修饰的氨肽酶(修饰酶液SA-AE )，4°C冰箱保存；
(2)称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，得到原酶液(AE)，4°C冰箱保存。
B、修饰前后酶的部分酶学性质
(1)采用丁二酸酐对氨肽酶在优化条件下进行化学修饰，SA对AE的平均氨基修饰率为55.86%，酶活保留率为105.81%。
(2)动力学参数Km的测定
以L-亮氨酸-4-硝基苯胺为底物，在原酶和修饰酶的最佳酶活测定的条件下，测定底物浓度为 0.2mmol/L、0.4mmol/L、0.6mmol/L、0.8mmol/L、1.0mmol/L、1.2mmol/L、1.4mmol/L时原酶和修饰酶的酶活。按照Lineweaver-Burk作图法取双倒数作l/v-1/s曲线，计算原酶和修饰酶的米氏常数Km和最大反应速率Vm。
修饰后的氨肽酶其动力学参数Km从1.0 mmol *L_1降低到0.75 mmol Ι/1,说明修饰后氨肽酶对底物的亲和力有明显的提高，最大反应速度Vmax均为2500mmol.L-1.min-1,结果如图1。
(3)原酶液和修饰酶液最适温度的测定
分别取原酶液和修饰酶液各lmL，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在不同的温度条件下测定酶活力，温度梯度为40 V、45°C、50 V、550C >60°C、65°C、70°C。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，原酶液最适温度为60°C，修饰酶液最适温度为65°C，结果如图2。
(4)原酶液和修饰酶液的温度稳定性
将原酶液和修饰酶液放置在70°C、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，每隔Ih取样，立即冰浴，测定其酶活力，水浴保温时间为0h、lh、2h、3h、4h、5h。以最高酶活力为100%,计算相对酶活力。5h后，原酶液的酶活保留率仅余35%，而修饰酶液的酶活保留率仍在70%以上，结果如图3。
(5)原酶液和修饰酶液最适pH的测定
分别取原酶液和修饰酶液各lmL，在不同pH 0.05mol/L、的Tris-HCl缓冲液中、50°C下测定其酶活力，pH值梯度为6.0,7.0,7.5,8.0,8.5,9.0,9.5,10.0,11.0。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，原酶液的最适pH为8.5，修饰酶液的最适pH为9.5^10.0，结果如图4。
(6)原酶液和修饰酶液的pH稳定性
将原酶液和修饰酶液分别在ρΗ5.(Γ7.0(0.05mol/L磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液)、PH7.0^10.0 (0.05mol/L甘氨酸-氢氧化钠缓冲液)体系中于4°C下放置，6h后取样将pH调至它们的最适反应pH值以测定酶活力。以最高酶活力为100%，计算相对酶活力，以最高酶活的80%为界确定酶的pH稳定范围，原酶液在ρΗ7.(T9.0范围内，酶活力较高且稳定，修饰酶液在PH6.(T9.0范围内较稳定，说明修饰酶液的pH稳定性得到提高。结果如图5。
固体氨肽酶的酶活
LNA法测定。测定时，首先配Tris-HCl缓冲液，取6.075g Tris溶于900mL蒸馏水，用浓HCl调至pH8.5，然后定容至1L。以L-亮氨酸对硝基苯胺L-leu-pNA作为底物，取0.1g底物溶于ImL酒精 ，然后用Tris-HCl缓冲液定容到100mL。取0.1g固体氨肽酶粉用Tris-HCl缓冲液定容到IOOmL作为待测酶液。加入2mL的Tris-HCl缓冲液和ImL底物(L-亮氨酸对硝基苯胺L-leu-pNA)，一个加入ImL酶液，另一个加入ImL Tris-HCl缓冲液作为对照，在50°C水浴反应IOmin后，405nm比色测定酶活。
酶活公式:酶活=ΑΧ105.7X4Xn/10
其中:A为待测酶液的吸光度；n为待测酶液的稀释倍数。
酶活力定义:50°C，每分钟分解L-亮氨酸-对硝基苯胺产生I微摩尔的对硝基苯胺所需酶量即为一个酶活单位。
平均氨基修饰度测定
采用三硝基苯磺酸(TNBS)法对修饰酶进行平均氨基修饰度的测定。取ImL蛋白酶溶液(lmg/mL)，加入ImL 4%(pH8.5)的碳酸氢钠溶液，ImL 10%的十二烷基磺酸钠溶液，20min后加入ImL 0.1%的TNBS溶液，40°C保温2h，用0.5mL lmol/L的盐酸终止反应。325nm测光吸收值。同样浓度蛋白酶溶液在修饰后与修饰前的光吸收值之比即为残留氨基率。修饰率=1 一残留氨基率。
相对酶活力测定
在同组实验中以酶活力最高的为100，与其余的酶活力之比，通常以百分数表示。
酶活残留率测定
酶活残留率=样品酶液残余酶活/样品酶液初始酶活X 100%。
本发明的有益效果:将枯草芽孢杆菌氨肽酶在化学修饰条件经优化后，得到了化学修饰酶的最佳制备方法。与小分子化学修饰剂丁二酸酐反应之后，改变酶的结构，使酶的一系列酶学性质得到了改善，尤其是酶在修饰之后的热稳定性显著提高，这对于酶的工业化生产、储存、应用等方面有着重要的意义。
图1原酶液和修饰酶液的Lineweaver-Burk曲线；
图2原酶液和修饰酶液的最适作用温度；
图3原酶液和修饰酶液的热稳定性；
图4原酶液和修饰酶液的最适作用pH ;
图5原酶液和修饰酶液的pH稳定性。
具体实施方式
实施例1
称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，然后向混合液中缓慢加入IOmg的丁二酸酐(SA)，搅拌溶解，在整个反应过程中用2mol/L NaOH溶液维持反应体系的PH值为8.0，在4°C条件下反应lh，反应结束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，以除去多余的修饰剂，得到丁二酸酐修饰的氨肽酶(修饰酶SA-AE);称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，用0.05mol/L、pH 8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，得到原酶液(AE)，4°C冰箱保存。修饰后SA-AE的酶活保留率为105.81%，和原酶液相比，修饰酶的最适反应温度从60°C提高到65°C，最适反应pH从8.5提高到9.5^10.0，70°C保温5小时后仍然能保留70%以上的活性，与修饰前同等条件下酶活残留35%相比，说明其热稳定性显著提高，修饰后的氨肽酶其动力学参数Km从1.0 mmol.L—1降低到0.75 mmol.L_/最大反应常数Vmax均为2500mmol.L—1.min— 1，在ρΗ6.(T9.0的范围内，修饰酶仍保持较高的酶活且稳定。
权利要求
1.一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌ZjOie氨肽酶稳定性的方法，其特征在于: A、丁二酸酐对氨肽酶的化学修饰方法 (1)称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液中，然后向混合液中缓慢加入IOmg的丁二酸酐SA，搅拌溶解，在整个反应过程中用2mol/L NaOH溶液维持反应体系的PH值为8.0，在4°C条件下反应lh，反应结束后，用0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，以除去多余的修饰剂，得到丁二酸酐修饰的氨肽酶，修饰酶液简称SA-AE，4°C冰箱保存； (2)称取20mg的氨肽酶粉溶解在15mL、0.05mol/L、ρΗ8.5的Tris-HCl缓冲液中，用.0.05mol/L、pH8.5的Tris-HCl缓冲液在4°C透析过夜，得到原酶液AE，4°C冰箱保存； B、修饰前后酶的部分酶学性质 (1)采用丁二酸酐对氨肽酶在优化条件下进行化学修饰，SA对AE的平均氨基修饰率为.55.86%，酶活保留率为105.81% ； (2)动力学参数Km:原酶液Km为1.0 mmol. Λ修饰酶液Km降低到0.75mmol. Λ说明修饰后氨肽酶液对底物的亲和力有明显的提高，最大反应速度Vmax均为2500mmol.L 1.min 1 ； (3)原酶液和修饰酶液的最适温度:原酶液的最适温度为60°C，修饰酶液的最适温度提高至IJ 65 0C ； (4)原酶液和修饰酶液的温度稳定性:修饰酶液70°C保温5h后仍然能保留70%以上的活性，原酶液70°C 保温 5h同等条件下的酶活残留率仅为35% ； (5)原酶液和修饰酶液最适pH:原酶液的最适pH为8.5,修饰酶液的最适pH提高到.9.5 10.0 ； (6)原酶液和修饰酶液的pH稳定性:以最高酶活的80%为界确定酶的pH稳定范围，原酶液在PH7.(T9.0范围内，酶活力较高且稳定，在相同条件下，修饰酶液在ρΗ6.(T9.0范围内较稳定。
专利摘要
一种丁二酸酐化学修饰提高枯草芽孢杆菌Zj016氨肽酶稳定性的方法，属于酶制剂、食品添加剂技术领域：
。本发明以酶活保留率和相对酶活力为依据，修饰酶液的酶活保留率为105.81%，丁二酸酐(SA)对氨肽酶的平均氨基修饰率为55.86%。和原酶液相比，修饰酶液的最适反应温度从60℃提高到65℃，最适反应pH从8.5提高到9.5~10.0，70℃保温5小时后仍然能保留70%以上的活性，说明其热稳定性显著提高；动力学参数Km降低到0.75mmol·L-1，说明修饰后氨肽酶对底物的亲和力有明显的提高。SA化学修饰是一种可明显提高枯草芽孢杆菌氨肽酶与底物的亲和力及其热稳定性的有效方法，较好改善枯草芽孢杆菌氨肽酶的应用特性，对推动该酶今后的工业化生产和进一步的应用有积极的作用。
文档编号C12N9/96GKCN102747064 B发布类型授权 专利申请号CN 201210260550
公开日2013年7月17日 申请日期2012年7月26日
发明者田亚平, 张静 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (3), 非专利引用 (2),