专利名称:一种大鲵虹彩病毒lamp检测试剂盒及检测方法
技术领域：
本发明属于鱼类病毒检测技术领域：
，具体涉及一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒,还涉及一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法。
背景技术：
大鲷(Andrias davidianus)俗称娃娃鱼，属两栖纲、有尾目、隐觸鲷科、大鲷属，1988年被列为国家二级保护动物，2007年《濒危野生动植物物种国际贸易公约》(CITEJ)第14届缔约国大会被列为I类濒危物种。大鲵不仅具有一定的药用和科研价值，而且还可以作为观赏动物和食用佳肴。20世纪80年代以来，我国各地陆续进行了大鲵的人工养殖和繁殖，目前已成为水产养殖中高效养殖的优良品种之一。然而随着养殖规模的扩大，大鲵病害问题日益突出，尤其是近年来暴发的大鲵病毒性出血病，给大鲵养殖业造成了巨大的经济 损失，严重制约了其健康养殖的发展。
为了及早发现和确诊大鲵病毒性出血病病原,大鲵虹彩病毒(Giant salamanderiridovirus, GSIV)，有必要建立一种准确、快速、灵敏的检测方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为大鲵养殖业的健康发展提供技术保障。
环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号W000/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。
发明内容
本发明的一个目的是在于提供了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，根据GenBank公布的GSIV毒株的MCP基因编码区序列(JN615141.1)，应用PrimerExplorer V4(http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对大鲵虹彩病毒进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。
本发明的另一个目的是在于提供了一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鱼组织，能检测GSIV感染的细胞(例如EPC细胞)，非常适用于GSIV的现场快速检测。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案
一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分
该试剂盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶(NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBRGreen I (Invitrogen)0[0010]F3 5, -CGACTTGGCCACTTATGACA-3,；
B3 5, -TTGACCTCGGGGGTCTTG-3，；
FIP 5, -GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3，；
BIP 5, -AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3，。
一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其步骤是
1、病毒DNA的获取
采用DNA/ol'H式剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA。
2、LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和B3各 O.1 μ M，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl22-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,余量去离子水补足。选择55_65°C的温度范围和303、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000X SYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
一种利用大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法(最佳条件)，其步骤是
1、病毒DNA的获取
采用DNAzo励试剂或Viral DNA Kit试剂盒提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。
2、LAMP 扩增
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足至 25 μ I。反应管于 65°C温育 60分钟进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。
3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定
I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。
2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。
3)取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
与现有技术相比，本发明具有以下优点
1、本发明公开了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒；
2、特异性好，能有效检测出大鲵虹彩病毒；[0035]3、灵敏度高，够检测到IOfg的GSIV。
4、快速高效，检测时间约I小时，非常适用于GSIV的现场快速检测；
5、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；
6、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000XSYBR Green I,可提高结果的灵敏度。
图1为一种大鲵虹彩病毒LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。从左至右的泳道依次为IOObp DNA Ladder Marker、GSIV、KHV、LCDV、Ah、Cf、水的
空白对照。
图2为一种大鲵虹彩病毒LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。
从左至右的泳道依次为IOObp DNA Ladder Marker、IngGSIV、lOOpgGSIV、lOpgGSIV、lpgGSIV、lOOfgGSIV、lOfgGSIV、IfgGSIV0
具体实施方式
下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。
实施例1 :
一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分
该试剂盒它包括以下成分10XThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA聚合酶(NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBRGreen I (Invitrogen)0
F3 5, -CGACTTGGCCACTTATGACA-3,；
B3 5, -TTGACCTCGGGGGTCTTG-3,；
FIP 5, -GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT-3,；
BIP 5, -AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT-3,。
实施例2:
大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化
一、取待检样品提取病毒DNA:
培养鲤上皮乳头瘤细胞(EPC细胞)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为0.1的剂量，接种Iml经4000r/min离心5min除去细胞碎片的大鲵虹彩病毒细胞毒材料(武汉大学保藏中心保藏号CCTCC V201134)，添加10 μ I的Polybrene (终浓度10μ g/ml)，置于26°C培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5ml2%胎牛血清(V/V)的培养液，置26°C培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于_80°C至室温(20-25°C)反复冻融 3 次，5000r/min 离心 30min，取上清 250μ 1，用 Viral DNA Kit 试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各0. 8μΜ，外引物F3和Β3各O.ΙμΜ, dNTPslmM, BetaineO. 5Μ, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I (I μ gml),IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,余量去离子水补足。
其中Mg2+的浓度分别为2、4、6、8和10mM。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示Mg2+的浓度为8mM时结果最好。
实施例3
大鲵虹彩病毒LAMP检测方法反应温度的优化
—、取待检样品提取病毒DNA:
待GSIV感染的EPC细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例2)，于_80°C至室温反复冻融3次,50001'/111；[11离心30111；[11,取上清25(^ I,用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,余量去离子水补足。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管分别置于60、61、62、63、64、65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示65°C时结果最好。
实施例4
大鲵虹彩病毒LAMP检测方法的特异性
一、取待检样品提取病毒DNA:
GSIV感染的EPC细胞、KHV(朱霞，李新伟，王好，等.一株锦鲤疱疹病毒的分离与鉴定[J].中国预防兽医学报，2011，33 (5) :340-343.)感染的Ko1-Fin细胞、LCDV (宋晓玲，黄捷，杨冰，等.牙鲆Paralichthys olivaceus淋巴囊肿病毒的分离[J].中国水产科学，2003, 10 (2) : 117-120.)感染的CIK细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同GSIV)，于_80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250 μ 1，用Viral DNAKit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。
另外培养分离自大鲵的两种致病菌嗜水气单胞菌(Ah)(孟彦，曾令兵，杨焱清，肖汉兵，大鲵腹水病病原菌的分离与鉴定研究.西北农林科技大学学报(自然科学版)，2009, 37 (3) :77-81.)常规细菌培养和弗氏柠檬酸杆菌(Cf)(高正勇，曾令兵，孟彦，刘小玲，张波，患病大鲵中弗氏柠檬酸杆菌的分离与鉴定.微生物学报，2012，52 (2) :169-176.)常规细菌培养，直接以菌液(109CFU/ml)作为模板检测。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各0. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. ΙμΜ, dNTPslmM, BetaineO. 5Μ, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I (I μ gml),IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,余量去离子水补足。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对GSIV设计的特异LAMP引物组能保证对GSIV的特异性检测，只检测出GSIV，而KHV, IXDV、Ah、Cf和水的空白 对照均无法检出(图1)。
实施例5
大鲵虹彩病毒LAMP检测方法的灵敏度
一、取待检样品提取病毒DNA:
GSIV感染的EPC细胞出现90%病变后收获(上述病毒的制备方法同前)，于_80°C至室温反复冻融3次,50001'/111；[11离心30111；[11,取上清25(^ I,用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。临用前测定样品浓度，用灭菌水调整并制备10倍稀释的系列模板0. 2ng/ μ I至O. 2fg/ μ I。
二、LAMP扩增的反应体系
采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1，10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,余量去离子水补足。
三、LAMP扩增的反应条件
反应管于65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。
四、检测结果判定
取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示针对GSIV设计的特异LAMP引物组能够检测到IOfg的GSIV (图2)。
权利要求
1.一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分 该试剂盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction缓冲液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ;外引物卩3和83、内引物？1卩和81卩、86七&11^，]/%(12，1000/3￥81 Green I;
F3 :5’_ CGACTTGGCCACTTATGACAB3 :5’_ TTGACCTCGGGGGTCTTG -3’ ；
FIP 5'-GTGAACCACCCCACGGGGTAAAAACAATGTACGGGGGTTCAGAT _ 3’ ；
BIP 5'-AAGATGTCGGGTAACCCGGCTTAAAAACCAGGCGTTGAGGATGT _ 3’。
2.利用权利要求
1所述的一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其步骤是 1)、病毒DNA的获取 采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA ； 2)、LAMP扩增 采用25μ I反应体系内引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O.1 μ Μ，dNTPsImM, BetaineO. 5M, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPolReaction Buffer 2. 5 μ 1，去离子水补足至25 μ 1，选择55-65。。和30-120分钟进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟； 3)、检测结果判定，采用下述三种方式之一 A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性； B、每25μ I体系的反应管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性； C、取扩增产物，用2%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
3.根据权利要求
2所述的一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其特征在于=MgCl2的浓度为8mM。
4.根据权利要求
2所述的一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其特征在于反应温度为65°C。
5.根据权利要求
2所述的一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒检测大鲵虹彩病毒的方法，其特征在于模板DNA在95°C 5分钟后置于冰浴中的预处理。
专利摘要
本发明公开了一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒及检测方法，一种大鲵虹彩病毒LAMP检测试剂盒，包括以下成分10×ThermoPolReaction缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBRGreenI。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的GSIV，能检测GSIV感染的病鱼组织，能检测GSIV感染的细胞，非常适用于GSIV的现场快速检测。
文档编号C12R1/93GKCN103014181SQ201310000433
公开日2013年4月3日 申请日期2013年1月4日
发明者曾令兵, 孟彦, 徐进, 张辉, 周勇, 范玉顶 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan