专利名称:一种鲤疱疹病毒2型lamp检测试剂盒及检测方法
一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒及检测方法技术领域：
[0001]本发明属于鱼类病毒检测技术领域：
，具体涉及一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，还涉及一种利用鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法。
背景技术：
[0002]在我国的鲫鱼主养区，2009年零星发生鲫鱼病毒性出血病，发病情况出现逐年上升的趋势，死亡率高，目前尚未有有效的控制措施，初步研究表明其病原为鲤疱疹病毒II型 (Cyprinid herpesvirus II，CyHV-2),初步命名该病为鲫造血器官坏死症(Crucian Carp Hematopoietic Necrosis)。2011年在匈牙利养殖的银鲫也发现了 CyHV-2感染的病例。[0003]CyHV-2在几种鱼类细胞系中的增殖均不能超过4代，需要尽快建立快速、敏感、特异、适宜现场诊断的方法，为疾病的诊断与防控提供技术手段，也为鲫鱼养殖业的健康发展提供技术保障。[0004]环介导等温扩增(Loop-mediatedisothermal amplification, LAMP)技术是 Notomi等于2000年报道的一种新型等温核酸扩增方法(国际专利公开号W000/28082)，针对靶基因的6个位点设计4条LAMP引物，利用一种具有链置换活性的DNA聚合酶(Bst DNA 聚合酶)，在恒温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列，适合于现场和实验条件较简单的实验室进行快捷检测。引入一对环状引物的改进方法，进一步缩短了反应时间。
发明内容
[0005]本发明的一个目的是在于提供了一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，根据 GenBank公布的CyHV-2毒株的解旋酶基因编码区序列(KC245087)，应用PrimerExplorer V4 (http://primerexplorer. jp/elamp4. 0. 0/index, html)在线软件设计特异性引物，利用LAMP技术扩增靶基因的特定区域，从分子水平对鲤疱疹病毒2型进行快速检测，具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点。[0006]本发明的另一个目的是在于提供了一种利用鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，本方法仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的CyHV-2，能检测CyHV-2感染的病鱼组织，能检测CyHV-2感染的细胞(例如Ko1-Fin 细胞)，非常适用于CyHV-2的现场快速检测。[0007]为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案[0008]一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，包括以下成分[0009]该试剂盒包括以下成分10XThermoPolReaction Buffer ；Bst DNA 聚合酶 (NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBR Green I (Invitrogen)0[0010]F3 :5， -TTGGATCTGAACGCTTCGG-3，；[0011]B3 :5 ’ -CGTTGGTCTGTATGGGAGC-3，；[0012]FIP :5’ -GCGATGTAAGCCC TGTGAGACTTTTTACGAGACGTGGTTCCTAGC-3’ ；[0013]BIP :5’ -AACGCACGAGTGCGAGTCTCTTTTGCTGTGGATCGTCCATCC-3’。[0014]一种利用鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，其步骤是[0015]1、病毒DNA的获取[0016]采用DNAzoiH式剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA模板，DNA在95°C 5 分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。[0017]2、LAMP 扩增[0018]采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O.1 μ M，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl22-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10XThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。选择55_65°C的温度范围和 30-120分钟的时间范围进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。[0019]3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定[0020]I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。[0021]2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000X SYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ I, l-5min 观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。[0022]3)取扩增产物，用2% (w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。[0023]一种利用鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法(最佳条件)，其步骤是[0024]1、病毒DNA的获取[0025]采用DNAml 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA，模板DNA在95°C 5 分钟后迅速置于冰浴中的预处理可以增加检测的灵敏度。[0026]2、LAMP 扩增[0027]采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10 X ThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I，去离子水补足余量。反应管于64°C温育60分钟进行LAMP反应之后，80°C灭活2分钟。[0028]3、检测结果判定，可用下述三种方法之一进行结果的判定[0029]I)发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性。[0030]2)每 25 μ I 体系的反应管加 1000XSYBR Green I (Invitrogen) 1-2 μ l，l_5min 观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性。3)取扩增产物，用2% (w/v,以下相同)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。[0032]与现有技术相比，本发明具有以下优点[0033]1、特异性好，能有效检测出鲤疱疹病毒2型；[0034]2、快速高效，检测时间约I小时，非常适用于鲤疱疹病毒2型的现场快速检测；[0035]3、不需要特殊试剂与设备，检测成本低；[0036]4、鉴定简单，通过从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，经肉眼就可判断结果，通过加入1000XSYBR Green I,可提高结果的灵敏度。
[0037]图1为一种鲤疱疹病毒2型LAMP试剂盒检测结果的特异性的示意图。[0038]从左至右的泳道依次为空白对照(水)、鳗疱疹病毒、GSIV、KHV、鲤疱疹病毒2型、 DL2,OOOMarker0[0039]图2为一种鲤疱疹病毒2型LAMP试剂盒检测结果的灵敏度的示意图。[0040]从左至右的泳道依次为IOOfg CyHV-2、Ipg CyHV-2UOpg CyHV-2UOOpg CyHV-2, lngCyHV-2,DL2000DNA Marker。
具体实施方式
[0041]下列实例进一步说明本发明，但不应该当做对本发明的限制。若无特别说明，本发明所用试剂均为上海生工生物工程公司生产。[0042]实施例1 :[0043]一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，包括以下成分[0044]该试剂盒它包括以下成分10XThermoPol Reaction Buffer ；Bst DNA聚合酶 (NEB) ；dNTPs ;外引物 F3 和 B3、内引物 FIP 和 BIP、Betaine (Sigma), MgCl2,1000XSYBR GreenI (Invitrogen)0[0045]F3 :5， -TTGGATCTGAACGCTTCGG-3，；[0046]B3 :5’ -CGTTGGTCTGTATGGGAGC-3’ ；[0047]FIP :5’ -GCGATGTAAGCCCTGTGAGACTTTTTACGAGACGTGGTTCCTAGC-3’ ；[0048]BIP :5’ -AACGCACGAGTGCGAGTCTCTTTTGCTGTGGATCGTCCATCC-3’。[0049]实施例2 [0050]鲤疱疹病毒2型LAMP 检测试剂盒不同浓度的Mg2+的优化[0051]一、取待检样品提取病毒DNA:[0052]培养锦鲤鳍条细胞系(Ko1-Fin)至汇合单层，吸出培养液，以感染复数为O.1 的剂量，接种ImL经4000r/min离心5min除去细胞碎片的鲤疱疹病毒2型组织毒材料 (Doszpoly, A. , M. Benko, Gy. Csaba, A. Dan, M. Lang, B. Harrach. 2011.1ntroduction of the family Alloherpesviridae: the first molecular detection of herpesviruses of cyprinid fish in Hungary. Magyar Allatorvosok Lapjal33 (3) : 174—181.),添力口 10 μ L 的Polybrene (终浓度10 μ g/ml),置于26°C培养箱中吸附lh，使病毒吸附细胞，吸附过程中每20min轻轻晃动培养瓶一次，使病毒液与细胞单层充分均匀接触，吸附Ih后，吸弃病毒液，加入5mL2%胎牛血清(V/V)的培养液，置26°C培养，直至细胞出现明显的致细胞病变效应，收集细胞病变材料，于_80°C至室温(20-25°C )反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250 μ 1，用Viral DNA Kit试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C 保存备用。[0053]二、LAMP扩增的反应体系[0054]采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8μΜ，外引物F3和Β3各O. ΙμΜ, dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl2, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer2. 5 μ I,去离子水补足余量。[0055]其中Mg2+的浓度分别为2、4、6、8和10mM。[0056]三、LAMP扩增的反应条件[0057]反应管于64°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。[0058]四、检测结果判定[0059]取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示Mg2+的浓度为8mM时结果最好。[0060]实施例3 [0061 ] 鲤疱疹病毒2型LAMP检测方法反应温度的优化[0062]一、取待检样品提取病毒DNA:[0063]待鲤疱疹病毒2型感染的Ko1-Fin细胞出现90%病变后收获(制备方法同实施例 2)，于-80°C至室温反复冻融3次，5000r/min离心30min，取上清250μ 1，用Viral DNA Kit 试剂盒按照说明书提取DNA，最后溶于50 μ I灭菌水，_20°C保存备用。[0064]二、LAMP扩增的反应体系[0065]采用25 μ I反应体系，包括内引物FIP和BIP各O. 8 μ M，外引物F3和Β3 各 O. ΙμΜ，dNTPslmM, BetaineO. 5M, MgCl28mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ 1， 10 X ThermoPolReaction Buffer2. 5 μ I，去离子水补足余量。[0066]三、LAMP扩增的反应条件[0067]反应管分别置于60、61、62、63、64、65°C温育60分钟后，80°C灭活2分钟。[0068]四、检测结果判定[0069]取8 μ I扩增产物，用2%的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示64°C时结果最好。[0070]实施例4 [0071 ] 鲤疱疹病毒2型LAMP检测方法的特异性[0072]一、取待检样品提取病毒DNA:[0073]GSIV(中国典 型培养物保藏中心CCTCC NO: V201134)感染的EPC细胞、鳗疱疹病毒 (F Rijsewijk, S Pritz-Verschuren, S Kerkhoff, A Botter, M ffillemsen, T Nieuwstadt, O Haenen.2005. Development of a polymerase chain reaction for the detection of Anguillid herpesvirus DNA in eels based on the herpesvirus DNA polymerase gene. Journal of Virological Methodsl24:87权利要求
1.一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，其特征在于，包括以下成分该试剂盒包括以下成分10 X ThermoPol Reaction缓冲液;ifei DNA聚合酶；dNTPs ; 外引物卩3和83、内引物？1卩和81卩、86七&11^，]/%(12，1000/3￥81 Green I;F3 :5’_ TTGGATCTGAACGCTTCGG2.利用权利要求
1所述的一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，其步骤是1)、病毒DNA的获取采用DNAzol 试剂或Viral DNA Kit试剂盒等提取样本总DNA ；2)、LAMP扩增采用25μ I反应体系内引物FIP和BIP各O. 8 μ Μ，外引物F3和Β3各O.1 μ Μ， dNTPsImM, BetaineO. 5M, MgCl2 2-10mM, Bst DNA 聚合酶 8U，模板 DNA5 μ I, IOXThermoPol Reaction Buffer 2. 5 μ 1，选择 55_65°C和 30-120 分钟进行 LAMP 反应之后，80°C灭活 2 分钟；3)、检测结果判定，采用下述三种方式之一A、发生扩增反应时，从dNTPs析出的焦磷酸根离子和反应液中的镁离子形成白色焦磷酸镁沉淀，通过肉眼判断检测管出现明显浑浊为阳性，未见浑浊为阴性；B、每25μ I体系的反应管加1000X SYBR Green I 1-2 μ 1,1-5 min观察结果，反应液变绿为阳性，保持橙色为阴性；C、取扩增产物，用2%(w/v)的琼脂糖凝胶电泳后，置于凝胶成像系统中成像，电泳图片显示LAMP特征性梯状条带，则结果为阳性；如无任何条带，则结果为阴性。
3.根据权利要求
2所述的一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，其特征在于=MgCl2的浓度为8mM。
4.根据权利要求
2所述的一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，其特征在于反应温度为64°C。
5.根据权利要求
2所述的一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒检测鲤疱疹病毒2型的方法，其特征在于模板DNA在95°C 5分钟后置于冰浴中的预处理。
专利摘要
本发明公开了一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒及检测方法，一种鲤疱疹病毒2型LAMP检测试剂盒，包括以下成分10×ThermoPolReaction缓冲液；BstDNA聚合酶；dNTPs；外引物F3和B3、内引物FIP和BIP、Betaine，MgCl2，1000×SYBRGreenI。本发明具有简便、快速、高特异性和灵敏性的特点，仅需一个水浴锅或金属浴即可在2小时内准确检测出样品中的CyHV-2，能检测CyHV-2感染的病鱼组织，能检测CyHV-2感染的细胞，非常适用于CyHV-2的现场快速检测。
文档编号C12Q1/68GKCN103045764SQ201310019403
公开日2013年4月17日 申请日期2013年1月18日
发明者曾令兵, 范玉顶, 张辉, 周勇, 徐进 申请人:中国水产科学研究院长江水产研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan