专利名称:一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法
技术领域：
本发明具体涉及一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法。
背景技术：
慢性乙型肝炎或其它各种慢性肝脏损伤导致的肝硬化是影响肝病患者生存质量的最主要的并发症。目前认为导致肝硬化的肝纤维化过程是可以被阻断和逆转的，因此在治疗慢性肝病的同时，积极治疗肝纤维化是防止肝硬化发生的重要治疗措施。目前，西医对肝纤维化的治疗尚无理想药物，国外的研究还多集中于基础方面，以期在逐渐明了的肝纤维化形成机理中寻找突破口。而中药抗肝纤维化研究从临床观察和动物实验入手，其初步结果已显示出巨大的潜力。
在利用积雪草煎剂预防爆发性肝炎和慢性肝病，特别是慢性病毒性肝炎导致的肝硬化方面进行了长期的临床观察，发现积雪草可以较好地阻止肝硬化的发生。为了确保疗效的稳定和更加符合现代化医药的要求，对积雪草的有效成分进行的提取，并利用动物试验对其疗效和作用机理进行了研究。结果发现积雪草中的三萜皂甙可显著地阻断四氯化碳对试验小鼠造成的肝损伤，特别是减少肝纤维化程度。
对中药有效成分进行提取并通过动物试验证明其疗效，为中药现代化提供了一条行之有效的途径。明确积雪草抗肝纤维化的有效成分为三萜皂甙可确保给药剂量的稳定，减少煎剂导致的剂量波动。另外，传统中药对药物的产地、种植和采集都有严格的规定，目的就是要确保药材的质量，归根到底还是有效成分的稳定。因此，确定和提纯中药有效成分可将传统方法对中药质量的过程控制，转变为更为简便准确的结果控制，有利于中药的现代化。
积雪草三萜皂甙(Asiaticoside)是从我国传统中草药积雪草中提取的具有抗纤维化作用的有效成分。积雪草又名落得打、崩大碗、马蹄等，分布于我国江南各地，为唇形科植物。中医认为其性微寒，味苦、辛，有清热除湿、解毒利尿作用，常用于治疗外感风寒。我们从临床实践中发现积雪草煎剂对预防各种肝炎所致的肝纤维化和肝硬化效果良好。为了研究积雪草具有抗肝纤维化和肝硬化疗效的有效成分，我们从积雪草中提取出一种三萜皂甙，并利用四氯化碳制备的肝硬化大白鼠模型进行了积雪草三萜皂甙对阻止肝纤维化病理基础的实验研究。结果表明，积雪草三萜皂甙可明显减少试验大白鼠肝脏纤维退行性变、肝纤维化和肝硬化。
努力实现积雪草三萜皂甙中成药的商品化，以便使积雪草能以疗效更加确切可靠、服用更加方便以及副作用更少来造福与广大患者。
发明内容本发明的目的是提供一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙，及其该积雪草三萜皂甙的制备方法。
本发明一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法的具体技术步骤为1、采用低沸点系统溶剂提取法，积雪草1kg，用乙醇回流提取2小时，共3次，回收乙醇浸膏。
2、将乙醇浸膏加水混溶，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之后再用水饱和的正丁醇萃取。
3、将正丁醇萃取物减压回收，再加少量甲醇溶解，加入数倍量无水丙酮，析出黄色沉淀，即可得到粗总甙，得率为0.95％。
4、将获得的约9.5g的粗总甙用少量甲醇溶解，加硅胶拌匀、烘干。
5、用硅胶湿法装柱后，再上样品硅胶，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱，依次收集18个组份，每个组份50ml，将收集到的组份用薄板层析检测，一般需要将9～15组份浓缩后，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱液，进一步洗脱纯化。
6、将收集液浓缩后，用甲醇反复结晶，可得到白色针状晶体，即雪草三萜皂甙，得率为0.15％。
本发明制备方法所得积雪草三萜皂甙作为制备治疗抗肝纤维化药物之应用。
本积雪草提取物的检测应用薄板层析(TLC)和高效液相色谱(HPLC)方法检测分析。
1.薄板层析(TLC)检测法对照品积雪草三萜皂甙从上海药物工业研究所购得，薄板层析硅胶G从青岛海洋化工厂购得，展开剂为4∶1∶5的正丁醇∶醋酸乙酯∶水，显色剂为20％硫酸乙醇。
2.高效液相色谱(HPLC)检测法对照品同薄板层析法，仪器型号Waters 515，所用检测器为Waters 2487，使用波长UV204nm，色谱柱为ODS-C184.6×250mm，流动液相为22∶28∶50的乙腈∶甲醇∶水，流速为0.8ml/Min。
我们利用低沸点系统溶剂提取法从积雪草中提取的积雪草三萜皂甙纯度经薄板层析和高效液相色谱分析，纯度可达90％。
积雪草苷对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有明显的阻断作用的实验材料与方法1.动物2个月龄的健康雄性SD大鼠24只，体重250±20g，由广东省实验动物中心购得。
2.药品积雪草苷(1g相当于50g生药)，室温保存。四氯化碳由广州市海珠区化学试剂厂生产，分析纯，批号20040614，实验时用食用花生油配制成20％(Vol Vol)的溶液。
3.方法3.1分组将实验用SD大鼠随机分为正常组、模型组和积雪草苷治疗组，每组8只。模型组和积雪草苷治疗组用20％的四氯化碳溶液腹腔注射，每次10ml kg，每天1次，连续30天，共30次。正常组腹腔注射等量生理盐水。积雪草苷治疗组给予2mg剂量积雪草苷灌胃给药。所有大鼠自由饮水、摄食。
3.2病理组织学在实验结束时用3％戊巴比妥钠腹腔注射(45mg kg麻醉动物，腹主动脉取血制备血清，-20℃冰箱保存。采血后取肝脏置10％福尔马林溶液中固定，HE染色，按王宝恩等对实验动物肝纤维化程度分级标准[8]进行分级。
3.3血清蛋白、转氨酶和透明质酸含量检测血清白蛋白和球蛋白检测试剂购自上海申能-德赛诊断技术公司，谷丙转氨酶和谷草转氨酶检测试剂购自上海复星长征医学科学公司，按试剂说明在日立7170型全自动生化仪上测定。透明质酸检测试剂购自上海海研医学生物技术中心，按试剂说明在？品牌1470全自动检测仪上测定。
4.统计学处理计量资料和等级资料求均数与标准差，计量资料差异分析采用t检验，等级资料差异分析采用秩和检验。
结果各组大鼠肝脏病理组织学结果正常对照组大鼠未发现肝纤维化，分级均为0级，肝小叶结构完整，无炎细胞浸润，无纤维化增生。模型对照组大鼠肝纤维化程度明显，5只为5级，2只为6级；5级肝小叶结构完全破坏，假小叶形，大方形假小叶与小园形假小叶各占50％；6级肝内布满园形假小叶，假小叶间有粗大增生的胶原纤维。模型治疗组3只为2级，2只为3级，1只为4级；2级胶原纤维从汇管区或中央静脉周围向外延伸明显，但未包绕整个肝小叶；3级胶原纤维延伸明显，相互连接，包绕整个肝小叶；4级胶原纤维包绕分割肝小叶，以致正常肝小叶结构破坏，假小叶形成，但以大方形假小叶形为主。积雪草苷治疗组与模型对照组比较，肝纤维化程度、肝组织炎症细胞浸润和脂肪变性程度均明显减轻。积雪草苷治疗组肝纤维化平均等级为2.67±0.82，模型对照组的5.28±0.40明显降低，统计学处理差异具有显著性(P＜0.05)。结果见表1以及图2、3、4。
表1.积雪草甙治疗实验研究各组SD大鼠肝纤维化等级分布情况
注1.对照组为腹腔注注射生理盐水的正常对照鼠2.模型对照组为腹腔注注射四氯化碳的肝纤维化模型鼠3.模型治疗组为腹腔注注射四氯化碳同时喂积雪草甙的治疗鼠结论积雪草苷滴丸对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有明显的阻断作用。
图1.积雪草甙分子式图2.正常对照SD大鼠的肝组织肝组织无胆管增生，无纤维化形成，肝纤维化分级为0。
图3.模型对照SD大鼠的肝组织肝细胞有变性，核缩小，肝内布满园形假小叶，假小叶间有粗大增生的胶原纤维，该图为VI级肝纤维化。
图4.积雪草甙治疗SD大鼠的肝组织胶原纤维从汇管区或中央静脉周围向外延伸明显，但未包绕整个肝小叶，该图I为I级肝纤维化。
具体实施方式实施例本发明一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法1、采用低沸点系统溶剂提取法，积雪草1kg，用乙醇回流提取2小时，共3次，回收乙醇浸膏。
2、将乙醇浸膏加水混溶，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之后再用水饱和的正丁醇萃取。
3、将正丁醇萃取物减压回收，再加少量甲醇溶解，加入数倍量无水丙酮，析出黄色沉淀，即可得到粗总甙，得率为0.95％。
4、将获得的约9.5g的粗总甙用少量甲醇溶解，加硅胶拌匀、烘干。
5、用硅胶湿法装柱后，再上样品硅胶，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱，依次收集18个组份，每个组份50ml，将收集到的组份用薄板层析检测，一般需要将9～15组份浓缩后，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱液，进一步洗脱纯化。
6、将收集液浓缩后，用甲醇反复结晶，可得到白色针状晶体，即雪草三萜皂甙，得率为0.15％。
本发明实施例制备方法所得积雪草三萜皂甙作为制备治疗抗肝纤维化药物之应用。
权利要求
1.一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法，其特征在于，其制备方法为(1)采用低沸点系统溶剂提取法，积雪草1kg，用乙醇回流提取2小时，共3次，回收乙醇浸膏；(2)将乙醇浸膏加水混溶，分别用石油醚、氯仿、乙酸乙酯萃取，之后再用水饱和的正丁醇萃取；(3)将正丁醇萃取物减压回收，再加少量甲醇溶解，加入数倍量无水丙酮，析出黄色沉淀，即可得到粗总甙，得率为0.95％；(4)将获得的约9.5g的粗总甙用少量甲醇溶解，加硅胶拌匀、烘干；(5)用硅胶湿法装柱后，再上样品硅胶，用16∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱，依次收集18个组份，每个组份50ml，将收集到的组份用薄板层析检测，一般需要将9～15组份浓缩后，再上柱用14∶6∶1的氯仿∶甲醇∶水洗脱液，进一步洗脱纯化；(6)将收集液浓缩后，用甲醇反复结晶，可得到白色针状晶体，即雪草三萜皂甙，得率为0.15％。
2.根据权利要求
1所述的一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙及其制备方法，其特征在于，该制备方法所得积雪草三萜皂甙作为制备治疗抗肝纤维化药物之应用。
专利摘要
本发明的目的是提供一种抗肝纤维化的积雪草三萜皂甙，及其该积雪草三萜皂甙的制备方法。本发明制备方法所得积雪草三萜皂甙作为制备治疗抗肝纤维化药物之应用。我们利用低沸点系统溶剂提取法从积雪草中提取的积雪草三萜皂甙纯度经薄板层析和高效液相色谱分析，纯度可达90％。积雪草苷滴丸对四氯化碳诱导的大鼠肝纤维化有明显的阻断作用。从而努力实现积雪草三萜皂甙治疗抗肝纤维化中成药的商品化，以便使积雪草能以疗效更加确切可靠、服用更加方便以及副作用更少来造福与广大患者。
文档编号A61P1/00GK1990500SQ200510121172
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者杨光, 谭家驹, 陈阳, 司建华, 胡维维, 钟锐兴 申请人:杨光, 谭家驹, 陈阳, 司建华, 胡维维, 钟锐兴导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan