专利名称:鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表达载体、所表达的重组蛋白及应用的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种cDNA，尤其涉及一种人工改造的鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表达载体的构建、所表达的重组VP2蛋白及该重组蛋白在制备抗鸡传染性法氏囊病疫苗中的应用。
背景技术：
鸡传染性法氏囊病是能够引起鸡体免疫抑制的重要的病毒病，严重危害着世界的养鸡业。传统疫苗在防制该病的历史中起到非常重要的作用，随着该病近年来呈现的新的变化-血清型变异株，超强毒株的出现，使得对该病的防制越来越棘手，传统疫苗的研制速度已经有些难于跟上该病的变化。快速的开发新型有效的能防制变异和超强毒株的新型疫苗的要求尤为迫切。蛋白亚单位基因工程疫苗是去除遗传物质但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危险。该疫苗的开发和应用将为防制当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防制禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验。
甲醇酵母(Pichia pastoris)表达系统是近几年发展起来的一个真核表达系统，它不仅象原核生物一样操作简便、酵母细胞容易培养、生长快速、成本低廉、适于大规模工业化发酵生产，而且能对重组蛋白进行正确的折叠和翻译后加工修饰，如糖基化、甲基化以及β-折叠等。酵母表达系统是所有表达系统中表达量最高的，可以达到克/升以上，有的表达量高达12克/升。酵母表达载体有分泌型和非分泌型，分泌型可以将所表达的蛋白分泌到液体培养基中去，且酵母本身分泌的蛋白非常少，杂蛋白非常少，易于纯化。Pichiapastoris具有可利用甲醇作为碳源和能源等独特的优势，被认为是分泌表达或非分泌表达外源基因的一种优秀工程菌。
Jagadish等用不同载体在酵母中表达了IBDV的大片段，结果表明，以非融合蛋白形式表达的多聚蛋白经翻译后或翻译过程中的加工，可产生正确的VP3，但检测不到VP2。但以融合蛋白形式表达的蛋白前体可产生稳定的VP2和VP3，说明在表达的多聚蛋白的N末端需要有部分酵母蛋白序列的保护，否则可能会被蛋白酶水解。Macreadie等用酵母表达了IBDV大片段。用转化的酵母裂解液100-200μL(相当于50μg VP2)与弗氏不完全佐剂乳化后注射SPF鸡，可刺激产生很高的ELISA抗体和中和抗体。用1mL免疫鸡的血清腹腔注射1日龄雏鸡，第二天用100CID50的IBDV攻毒，三天后检测法氏囊含毒量。结果表明，免疫鸡血清可对雏鸡提供很好的保护。Fahey等用酵母表达了IBDV VP2，制成油佐剂苗后免疫10周龄SPF鸡。免疫2周后可检测到抗体，然后持续上升，免疫后6周ELISA抗体滴度达高峰，中和抗体效价8周后达到高峰。
研究表明，用酵母表达的IBDV VP2免疫，其效果与传统疫苗一样。比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，酵母菌的培养简单、方便，所需培养基价格也较低，表达产物经过粗提即可应用。因此，用酵母表达生产的IBD亚单位苗将具有更好的应用前景。
原有的IBDV VP2基因在酵母中的表达效率不高，需要对其进行分子改造和修饰，以提高其在酵母细胞中的表达效率，进一步用所得到的重组VP2蛋白制成抗鸡传染性法氏囊病蛋白亚单位疫苗。
发明内容本发明首先所要解决的技术问题是克服现有技术的不足，将鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA进行分子改造和修饰，提供一种适合在酵母细胞中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒人工VP2 cDNA。
本发明首先所要解决的技术问题是通过以下技术途径来实现的一种适合在酵母细胞中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒人工VP2cDNA，其具有SEQ ID NO1所示的核苷酸序列。
本发明在不改变原有鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA所编码的氨基酸序列的前提下，按照毕赤酵母密码子的选择偏向对鸡传染性法氏囊病病毒VP2cDNA密码子进行优化，规避了一些可能降低表达的序列，得到了一种新的适合在酵母细胞中高效表达的鸡传染性法氏囊病病毒人工VP2 cDNA序列。
本发明所要解决第二个技术问题是提供一种含有SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的重组酵母表达载体及含有该重组酵母表达载体的细胞系。
本发明所要解决第二个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种重组酵母表达载体，含有SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列。本发明的重组酵母表达载体可通过本领域的常规方法构建而成，即将将SEQID NO.1所示的核苷酸序列插入到酵母表达载体合适的限制性酶切位点之间，使SEQ ID NO1所示的核苷酸序列可操作的与酵母细胞表达调控序列相连接。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将SEQ ID NO1所示的核苷酸序列插入到酵母表达载体pPICZαC的XholI和XbaI限制性酶切位点之间，使该核苷酸序列位于AOX1启动子的下游并受其调控，得到重组酵母表达载体。
本发明所构建的重组酵母表达载体可通过常规的方法转化宿主细胞，所述的宿主细胞可为毕赤酵母细胞(Pichic pastoris)、啤酒酵母细胞(Saccharomyces cerevisiae)或乳酸酵母细胞(Hansenula polymorpha)。作为本发明的一个最优选的实施方案，优选为将重组酵母表达载体采用电转化的方法转化SMD1168毕赤酵母株(SMD1168 Pichia strain)。
本发明所要解决第三个技术问题是提供一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，该重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。
本发明所要解决第三个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，该重组VP2蛋白主要由SEQID NO1所示的核苷酸序列所编码。
本发明所要解决的第四个技术问题是提供一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法。
本发明所要解决的第四个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种制备鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白的方法，包括以下步骤培养用本发明重组酵母表达载体所转化的酵母细胞，诱导重组VP2蛋白的表达，回收并纯化所表达的重组VP2蛋白。
上述制备重组VP2蛋白的方法中，优选的，所述的酵母细胞是SMD1168毕赤酵母株(SMD1168 Pichia strain)。
本发明所要解决的再一个技术问题是提供一种蛋白亚单位基因工程疫苗，该基因工程亚单位疫苗可有效的防治鸡传染性法氏囊病。
本发明所要解决的再一个技术问题是通过以下技术途径来实现的一种抗鸡传染性法氏囊病的蛋白亚单位基因工程疫苗，该疫苗含有免疫上有效剂量的本发明的重组VP2蛋白。
本发明重组VP2蛋白可按照本领域常规的方法制备成蛋白亚单位基因工程疫苗。例如，可参照下述方法来制备以磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4，0.01M、pH7.4，PBS的具体配制方法NaCl 8g；KCl 0.2g；Na2HPO4·12H2O 2.9g；KH2PO40.5g，加水溶解后定容至1升)将重组VP2蛋白溶液稀释为400μg/mL，然后将重组蛋白溶液与白油司盘佐剂按1∶1混合放入胶体磨匀质机中，使其乳化。亚单位疫苗的分装量为250ml/瓶和500ml/瓶两种，分装后的疫苗放4～8℃保存。
为了达到更好的免疫效果，本发明蛋白亚单位基因工程疫苗还可含有药学上可接受的载体或赋型剂等。
一个本发明优选的技术方案的整体描述应用RT-PCR技术扩增自行分离的国内鸡传染性法氏囊病病毒超强毒株基因组A片段，基因测序后，应用软件DNAstar根据毕赤酵母密码子偏嗜表将IBDV VP2基因编码进行分子改造和修饰，得到适应在毕赤酵母细胞中表达的新的基因序列，将新的基因序列人工合成后，将其克隆入T载体，然后亚克隆入酵母表达载体。以电转化方法转化酵母感受态细胞，抗生素筛选，PCR鉴定，得到重组酵母菌株。对重组酵母菌株进行小规模诱导表达，筛选得到稳定表达的高表达菌株，并将其驯化为工程菌株。对工程菌进行大规模诱导，表达量达到0.4g/L的水平。经琼脂扩散试验(AIDT)、SDS变性聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及Western blot检测证明表达的重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。
本发明的鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA能够在酵母细胞中高效表达(表达量达到0.4g/L的水平)，所表达的重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性，将所表达的重组蛋白制成亚单位疫苗，免疫鸡实验结果表明该鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得90％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖，实验结果说明，本发明蛋白亚单位基因工程疫苗能够有效防治鸡传染性法氏囊病。
用酵母表达的重组VP2蛋白免疫，其效果与传统疫苗一样。比起用SPF鸡法氏囊或细胞培养物制备的传统IBD疫苗，酵母菌的培养简单、方便，所需培养基价格也较低，表达产物经过粗提即可应用。因此，本发明蛋白亚单位疫苗与现有的疫苗相比将具有更好的应用前景。
蛋白亚单位基因工程疫苗是去除遗传物质但又保留病毒抗原性的安全疫苗，不存在散毒的危险。本发明亚单位疫苗将为防制当前流行的鸡传染性法氏囊病提供有效的工具和手段，并可为防制禽类免疫抑制病提供有效的参考和经验，投入应用后既能有效的防止疫病造成的损失，同时也降低了养殖成本，具有重要的科学意义和应用价值，并能带来更好的经济效益和社会效益。
本发明蛋白亚单位基因工程疫苗的用法与用量用法经由肌肉注射。
用量雏鸡0.3mL/羽，成年鸡0.5mL/羽图1鸡传染性法氏囊病病毒VP2基因与载体构建图谱。
图2IBDVA片段的RT-PCR结果。
M、DNA分子量标准DL15000+DL2000(TaKaRa公司)；1、IBDV OF243基因3.1Kb；2、超纯水为模板PCR对照。
图3重组毕赤酵母表达载体PCR鉴定结果。
1、2、IBDV VP2基因1.3Kb；M、1Kb DNA分子量标准(MBI公司)。
图4酵母重组子鉴定结果。
1-6、为Mut+表型重组酵母株；M、1Kb DNA分子量标准(NEB公司)。
图5重组酵母株诱导蛋白Western blot结果。
1、pPICZ αC/SMD1168空载体重组酵母菌对照；1-7不同株pPICZ αVP2/SMD1168重组酵母菌分泌蛋白；M、蛋白分子量标准。
以下通过实施例来进一步描述本发明的制备方法及有益效果，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。
具体实施方式材料和试剂1病毒 鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx株由本发明人实验室分离。
2菌种和载体 大肠杆菌感受态细胞DH5α由本实验室制作。毕赤酵母菌种SMD1168和载体pPICZαC购自美国Invitrogen公司，pMD18-T购自大连TaKaRa生物公司。
3试验试剂 反转录酶superscriptTMII购自Invitrogen公司，ExpandHigh Fidelity PCR System购自德国Roche公司，其他试剂为分析纯。琼脂糖凝胶回收试剂盒购自上海华舜生物公司。
重组鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA的合成与克隆1病毒RNA的提取 将感染鸡传染性法氏囊病病毒超强毒Gx(vvIBDV-Gx)株的SPF鸡法氏囊用研磨器研磨。取200μl病料补加TE(PH8.0)至500μl，加入5μl蛋白酶K和10％SDS 50μl，56℃水浴3小时。加入等体积酚/氯仿抽提3次，等体积氯仿抽提一次。移出上清至另一1.5ml离心管，加入1/10体积NaAc(3M，PH5.2)、等体积异丙醇，-20℃沉淀2小时。4℃、12000转/分、离心15分钟，用75％乙醇洗一次。真空干燥，将RNA用无RNA酶去离子水重新溶解。
2基因组A片段RF243基因的获得对提取的病毒RNA进行RT-PCR，应用随机引物进行RT反应，反应体系为20μl，按照superscriptTMII反转录试剂说明进行操作。设计特异性扩增RF243 PCR引物，引物序列为Paf5`-gcggaattcgatgacgaacctgcaagatcaaac-3`，Par5`-ccgaattccaaggtcctcatcagagacagcc-3`，以RT产物为模板，加10μl入PCR反应体系中，PCR反应体系为100μl，其他溶液按照Expand High Fidelity PCR System说明书添加，反应条件如下预变性94℃3min，循环参数为94℃10sec、55℃20sec、72℃3min，循环30次，72℃延伸7min。
经过RT-PCR扩增IBDV-Gx株病毒RNA得到长度为3.1Kb(SEQ ID NO3)的片段(图2)。该片段包含IBDV A片段基因完整的大开放阅读框，基因测序结果及其推导出的氨基酸序列(SEQ ID NO4)。
应用华舜琼脂糖凝胶回收试剂盒纯化回收PCR产物，按照说明书操作。PCR产物与pMD18-T连接，转化大肠杆菌感受态细胞。碱裂解法提取质粒，用PCR进行鉴定，PCR鉴定引物及条件同上，鉴定正确重组质粒送交大连TaKaRa生物公司测序。
3、VP2基因的优化改造及合成将毕赤酵母密码子偏嗜表输入DNAstar软件Editseq中，以步骤2中测得序列为原型，以软件进行分子改造和修饰，获得的新基因序列(SEQ ID NO1)进行人工合成。
4、优化后VP2基因的扩增以优化基因序列为模板设计特异性扩增VP2基因引物，在引物两端引入Xhol I和Xba I酶切位点。引物序列为Pvp2f5`-gcgctcgagaagagagaggctgaagcaatgactaacttgc-3`，Pvp2r5`-gcctctagaagcaccagcgatcttcaatgg-3`，以人工合成的基因为模板进行PCR扩增，反应体系100μl，模板2μl，其它溶液按照Expand High Fidelity PCR System说明书添加，反应条件如下预变性94℃，3min，循环参数为94℃10sec、55℃20sec、72℃1min，循环30次，72℃延伸7min。
重组酵母载体的构建及鉴定1、重组酵母载体的构建将优化VP2基因和酵母载体分别用Xhol I和Xba I酶切，用琼脂糖凝胶回收试剂盒回收。载体用CIAP去磷酸化。外源片段及载体用T4DNA连接酶进行连接反应。构建图谱见图1。将连接产物转化大肠杆菌感受态细胞。
2、重组质粒的提取及鉴定将相应抗生素按作用浓度加入低盐LB中(筛选pPICZαVP2质粒抗生素选择ZeocinTM)，挑取单菌落接种LB。碱裂解法提取质粒。用PCR方法进行鉴定，PCR鉴定引物及条件同实施例1，PCR扩增出1.3Kb条带(图3)，将鉴定正确质粒送交大连TaKaRa生物公司测序，测序结果表明扩增的基因符合合成基因测序的结果，基因插入正确，与载体读码框相符。
重组酵母载体的转化、重组酵母菌株的检测和筛选1、转化酵母感受态细胞将重组酵母载体用Sac I酶切线性化，转化酵母感受态细胞，按照Invitrogen公司毕赤酵母电转化指导方法进行。将转化后酵母菌涂布含有抗生素的YPDS平板(筛选pPICZαVP2转化的重组酵母菌抗生素选择ZeocinTM)。
2、酵母重组子的筛选和鉴定挑取10个酵母单菌落，接种5ml含有抗生素的YPD，过夜培养，离心，弃去培养液，用5ml灭菌去离子水洗一次。应用蛋白酶K、SDS过夜消化酵母菌，离心，将上清液转至另一1.5ml离心管，酚、氯仿抽提3次，无水乙醇沉淀。应用AOX1 5`及3`引物进行PCR，PCR条件为预变性94℃3min，循环参数为94℃1min、55℃1min、72℃1min，循环30次，72℃延伸7min。
应用蛋白酶K-SDS消化酵母菌，提取酵母DNA，用AOX1 5`及3`引物进行PCR，当外源基因片段整合进入酵母基因组，则PCR产物中应当有一条比外源基因片段长593bp左右的DNA片段，否则只有一条约2.2Kb左右的AOX基因片段。当外源片段与酵母基因组整合正确时酵母表型为Mut+，这时PCR产物中会出现外源基因片段+593bp及2.2Kb两条DNA片段，整合不正确时酵母表型为Muts，这时PCR产物中只有外源基因片段+593bp DNA片段，见图4，通过筛选，获得545株重组酵母。
3、酵母重组子的小规模诱导表达将PCR鉴定表型为Mut+重组酵母菌株接种25ml BMGY，30℃摇瓶培养(RPM300)，培养菌密度至OD600为8时离心(3000g，5min)，用5ml BMMY重新悬浮酵母细胞，继续30℃摇瓶培养(RPM300)。每24小时补加无水甲醇至1％浓度，吸取菌液100μl，离心，将上清移入另一1.5ml离心管中，冻存于-70℃冰箱。接入BMMY后120小时收取全部菌液，离心，将上清移入另一灭菌容器，冻存于-70℃冰箱。
4、表达蛋白的鉴定挑取不同株酵母诱导表达，将小规模诱导收获的样品取50μl，加入2倍SDS上样缓冲液50μl，煮沸10分钟，进行SDS-PAGE电泳、Western blot(参照《分子克隆》第二版)测定表达量，阳性重组酵母菌株分泌蛋白可以和抗IBDV单克隆抗体反应见图5，同一株酵母不同时间表达蛋白从24次小时起能够得到眼观量，随着时间延长，72小时蛋白浓度最大。不同株酵母相同时间表达蛋白的表达量是不同的，凭借SDS-PAGE筛选到表达量高的菌株优化为工程菌株，表达量达到400mg/L。Western-blot结果证明表达蛋白能够和特异性抗体发生免疫反应。
试验例1本发明重组蛋白免疫原性的测定将实施例2所制备的重组蛋白与油佐剂1∶1乳化，按乳化后的蛋白含量分3个剂量100μg/ml、200μg/ml、1000μg/ml。取4周龄SPF鸡50只，分5组，每组10只。1、2、3组为本发明重组蛋白免疫组1组免疫剂量为50μg/0.5ml/只，2组免疫剂量为100μg/0.5ml/只，3组免疫剂量为500μg/0.5ml/只；4组为常规灭活疫苗(鸡传染性法氏囊病灭活疫苗，购自中国农业科学院哈尔滨兽医研究所维科生物技术开发公司)免疫组，免疫剂量为0.5ml/只；免疫途径均为胸肌注射法；5组为无免疫对照组。各组免疫后每7天采血，检测琼扩抗体，并于免疫后14天各组取5只攻毒，各组余下的5只于免疫后28天时攻毒。攻毒后观察7天，记录死亡数，计算保护率。试验在负压隔离器(澳大利亚进口)中进行。
免疫14天后攻毒，攻毒后7天，常规灭活苗免疫组存活率为100％，本发明亚单位疫苗免疫组存活率为80％以上，未免疫攻毒对照组存活率为20％。免疫28天后攻毒，攻毒后7天，常规灭活疫苗组存活率为100％，本发明亚单位疫苗免疫组存活率为100％，未免疫攻毒对照组存活率为20％。攻毒结果表明，用本发明IBDV重组VP2蛋白免疫SPF鸡，可以产生抵抗超强毒IBDV致死攻击的免疫保护力。
试验例2本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗毒理学试验为了考察试验鸡对本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗免疫接种后的毒理学反应，本试验采用大剂量接种的方法分析了本发明基因工程亚单位疫苗接种后疫苗与机体之间的相互关系。
具体试验如下将实施例2所制各的重组蛋白与油佐剂按1∶1比例乳化，对7日龄、14日龄和60日龄的试验鸡进行胸肌注射，每只鸡接种1ml(相当于2个免疫剂量)，接种后观察鸡群的精神状态以及局部的反应情况。
结果，所有试验鸡的注射局部均出现结节，注射后第7天周围组织形成肉牙肿，未吸收部分形成包囊。所有试验鸡均无其他全身反应，精神食欲不受影响，发育正常。试验表明，即使用2倍疫苗免疫剂量注射试验鸡，也不会引起试验鸡严重的临床反应，试验结果说明，本发明蛋白亚单位疫苗是安全的，既可用于5周龄以上的鸡的免疫，又可用于2周龄雏鸡的免疫，甚至可以对1周龄的鸡实施免疫接种。
表1本发明疫苗的安全性试验结果
试验例3本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗环境释放安全性评价2004年6月至2004年12月，在黑龙江哈尔滨市(原太平区)民主乡哈尔滨兽医研究所试验动物饲养场对本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗进行了环境释放，总的试验规模为5000羽份。
具体试验方法及结果如下1鸡传染性法氏囊病病毒基因蛋白在鸡体内的抗体消长以50μg本发明重组蛋白免疫试验鸡，疫苗接种后的6个月内随机从免疫鸡群抽取鸡40只，并从同批的非免疫鸡取去同样大小的样本作为试验对照，采集血样，用AG试验检测鸡群血清抗体的产生情况，血清学监测结果表明，免疫后1周开始出现抗体反应，效价达到3.12±0.45log2，免疫后8周达到高峰效价为5.31±0.36log2。以后每月抗体效价逐渐消减，到150天抗体效价仍能达到4.07±0.21log2，180天抗体效价能达到3.38±0.67log2。疫苗接种后的6个月每30天，随机从免疫鸡群抽取鸡10只，并从同批的非免疫鸡群取同样大小的样本作为试验对照，用鸡传染性法氏囊病病毒vvIBVDV-GX株超强毒攻击，鸡群接种亚单位疫苗之后免疫保护作用出现于免疫后的10天。免疫后150天仍能使免疫鸡群80％的免疫鸡获得超强毒攻击后的保护。免疫后不同时间抗体效价及鸡群对强毒攻击的保护结果(见表2)。
表2本发明疫苗免疫持续期试验结果
2细胞传代对重组毕赤酵母菌株稳定性的影响将本发明重组酵母菌株连续传代到20次，取第5、10、15、20代菌株进行诱导表达，蛋白表达量没有差异，将表达蛋白用磷酸盐缓冲液(PBS，PH7.4)稀释到200μg/mL，然后将重组蛋白溶液与白油司盘佐剂按1∶1混合放入胶体磨匀质机中，使其乳化，以制备的亚单位疫苗免疫试验鸡，以50μg/0.5ml/羽经胸肌注射接种途径。免疫后28天攻击鸡传染性法氏囊病病毒vvIBDV-GX株超强毒，各代次酵母表达蛋白制备疫苗均可达到95％以上的保护率，保护试验表明，不同代次重组酵母菌株诱导表达蛋白制成的亚单位疫苗对免疫鸡的保护效果没有发生改变，都可以使免疫鸡抵抗鸡传染性法氏囊病病毒vvIBVDV-GX株超强毒的攻击，证明插入的外源基因能在酵母的长期传代过程中稳定地遗传并表达出重组VP2蛋白，表达蛋白能刺激机体产生针对鸡传染性法氏囊病病毒的免疫反应，鸡群使用重组疫苗不会有免疫失败的安全隐患(见表3)。
表3不同代次重组酵母菌株表达蛋白对鸡的保护效果
3表达抗鸡传染性法氏囊病亚单位疫苗重组酵母菌株对环境的转移情况试验结束后的1、2、3、4、8、12周，采集试验鸡场的饲料、饮水、尘土、粪便和笼具的擦拭物，保存于50％甘油缓冲盐水中，玻璃研磨器研磨后制成1∶2稀释的匀浆液，接种含有ZeocinTM抗生素的YPD培养液中，摇动培养过夜，对培养液离心，用北京天为时代公司酵母基因组提取试剂盒提取酵母DNA，用PCR方法进行跟踪检测。PCR使用引物pu5′-tactattgccagcattgctgc-3，pr5′-ggggacccgcgaacggat-3′。条件94℃/3分钟；94℃/30秒，56℃/30秒，72℃/3分30秒，30个循环；最后72℃延伸10分钟。PCR检测结果(表4)表明，试验结束后不能分离到重组酵母，说明本发明重组酵母菌在环境中没有残留。
表4试验结束后重组酵母菌株在环境中的残留
试验证明，本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗对鸡群是安全的，而且免疫接种鸡免疫后不出现不良反应；试验鸡免疫后，迅速产生抗体，使机体能够抵抗鸡传染性法氏囊病病毒野毒的侵袭；试验结束后，环境中没有转基因微生物的残留。
综上所述，本发明抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗免疫后可以刺激机体产生高滴度的抗体，抗体持续期长达6个月以上，使免疫鸡获得对鸡传染性法氏囊病病毒长时间的保护，保护率为95％以上，免疫期可达3个月。表达鸡传染性法氏囊病病毒蛋白的重组酵母菌株可以稳定表达病毒蛋白，其表达的蛋白免疫原性各代次间没有差异。试验结束后环境中检测不出重组酵母菌的存在，证明本测试对象本身对鸡群非常安全、可靠，不会对环境造成危害。因此，用酵母表达的抗鸡传染性法氏囊病基因工程亚单位疫苗是一种安全性极高的疫苗。
SEQUENCE LISTING<110>中国农业科学院哈尔滨兽医研究所<120>鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA、其表达载体、所表达的重组蛋白及应用<130>12<160>3<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>1323<212>DNA<213>Artificial<220>
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165 170 175Tyr Val Arg Leu Gly Asp Pro Ile Pro Ala Ile Gly Leu Asp Pro Lys180 185 190Met Val Ala Thr Cys Asp Ser Ser Asp Arg Pro Arg Val Tyr Thr Ile195 200 205Thr Ala Ala Asp Asp Tyr Gln Phe Ser Ser Gln Tyr Gln Ala Gly Gly210 215 220Val Thr Ile Thr Leu Phe Ser Ala Asn Ile Asp Ala Ile Thr Ser Leu225 230 235 240Ser Ile Gly Gly Glu Leu Val Phe Gln Thr Ser Val Gln Gly Leu Ile245 250 255Leu Gly Ala Thr Ile Tyr Leu Ile Gly Phe Asp Gly Thr Ala Val Ile260 265 270Thr Arg Ala Val Ala Ala Asp Asn Gly Leu Thr Ala Gly Thr Asp Asn275 280 285Leu Met Pro Phe Asn Ile Val Ile Pro Thr Ser Glu Ile Thr Gln Pro290 295 300Ile Thr Ser Ile Lys Leu Glu Ile Val Thr Ser Lys Ser Gly Gly Gln305 310 315 320Ala Gly Asp Gln Met Ser Trp Ser Ala Ser Gly Ser Leu Ala Val Thr325 330 335Ile His Gly Gly Asn Tyr Pro Gly Ala Leu Arg Pro Val Thr Leu Val340 345 350Ala Tyr Glu Arg Val Ala Thr Gly Ser Val Val Thr Val Ala Gly Val355 360 365Ser Asn Phe Glu Leu Ile Pro Asn Pro Glu Leu Ala Lys Asn Leu Val370 375 380Thr Glu Tyr Gly Arg Phe Asp Pro Gly Ala Met Asn Tyr Thr Lys Leu385 390 395 400Ile Leu Ser Glu Arg Asp Arg Leu Gly Ile Lys Thr Val Trp Pro Thr405 410 415Arg Glu Tyr Thr Asp Phe Arg Glu Tyr Phe Met Glu Val Ala Asp Leu420 425 430Asn Ser Pro Leu Lys Ile Ala Gly Ala Phe Gly Phe Lys Asp Ile Ile435 440 445Arg Ala Leu Arg Arg Ile Ala Val Pro Val Val Ser Thr Leu Phe Pro450 455 460
Pro Ala Ala Pro Leu Ala His Ala Ile Gly Glu Gly Val Asp Tyr Leu465 470 475 480Leu Gly Asp Glu Ala Gln Ala Ala Ser Gly Thr Ala Arg Ala Ala Ser485 490 495Gly Lys Ala Arg Ala Ala Ser Gly Arg Ile Arg Gln Leu Thr Leu Ala500 505 510Ala Asp Lys Gly Tyr Glu Val Val Ala Asn Leu Phe Gln Val Pro Gln515 520 525Asn Pro Val Val Asp Gly Ile Leu Ala Ser Pro Gly Ile Leu Arg Gly530 535 540Ala His Asn Leu Asp Cys Val Leu Arg Glu Gly Ala Thr Leu Phe Pro545 550 555 560Val Val Ile Thr Thr Val Glu Asp Ala Met Thr Pro Lys Ala Leu Asn565 570 575Ser Lys Met Phe Ala Val Ile Glu Gly Val Arg Glu Asp Leu Gln Pro580 585 590Pro Ser Gln Arg Gly Ser Phe Ile Arg Thr Leu Ser Gly His Arg Val595 600 605Tyr Gly Tyr Ala Pro Asp Gly Val Leu Pro Leu Glu Thr Gly Arg Asp610 615 620Tyr Thr Val Val Pro Ile Asp Asp Val Trp Asp Asp Ser Ile Met Leu625 630 635 640Ser Lys Asp Pro Ile Pro Pro Ile Val Gly Asn Ser Gly Asn Leu Ala645 650 655Ile Ala Tyr Met Asp Val Phe Arg Pro Lys Val Pro Ile His Val Ala660 665 670Met Thr Gly Ala Leu Asn Ala Tyr Gly Glu Ile Glu Asn Val Ser Phe675 680 685Arg Ser Thr Lys Leu Ala Thr Ala His Arg Leu Gly Leu Lys Leu Ala690 695 700Gly Pro Gly Ala Phe Asp Val Asn Thr Gly Ser Asn Trp Ala Thr Phe705 710 715 720Ile Lys Arg Phe Pro His Asn Pro Arg Asp Trp Asp Arg Leu Pro Tyr725 730 735Leu Asn Leu Pro Tyr Leu Pro Pro Asn Ala Gly Arg Gln Tyr Asp Leu740 745 750Ala Met Ala Ala Ser Glu Phe Lys Glu Thr Pro Glu Leu Glu Ser Ala755 760 765
Val Arg Ala Met Glu Ala Ala Ala Asn Val Asp Pro Leu Phe His Ser770 775 780Ala Leu Ser Val Phe Met Trp Leu Glu Glu Asn Gly Ile Val Thr Asp785 790 795 800Met Ala Asn Phe Ala Leu Ser Asp Pro Asn Ala His Arg Met Arg Asn805 810 815Phe Leu Ala Asn Ala Pro Gln Ala Gly Ser Lys Ser Gln Arg Ala Lys820 825 830Tyr Gly Thr Ala Gly Tyr Gly Val Glu Ala Arg Gly Pro Thr Pro Glu835 840 845Glu Ala Gln Arg Glu Lys Asp Thr Arg Ile Ser Lys Lys Met Glu Thr850 855 860Met Gly Ile Tyr Phe Ala Thr Pro Glu Trp Val Ala Leu Asn Gly His865 870 875 880Arg Gly Pro Ser Pro Gly Gln Leu Lys Tyr Trp Gln Asn Thr Arg Glu885 890 895Ile Pro Asp Pro Asn Glu Asp Tyr Leu Asp Tyr Val His Ala Glu Lys900 905 910Ser Arg Leu Ala Ser Glu Glu Gln Ile Leu Arg Ala Ala Thr Ser Ile915 920 925Tyr Gly Ala Pro Gly Gln Ala Glu Pro Pro Gln Ala Phe Ile Asp Glu930 935 940Val Ala Lys Val Tyr Glu Ile Asn His Gly Arg Gly Pro Asn Gln Glu945 950 955 960Gln Met Lys Asp Leu Leu Leu Thr Ala Met Glu Met Lys His Arg Asn965 970 975Pro Arg Arg Ala Pro Pro Lys Pro Lys Pro Lys Pro Asn Val Pro Thr980 985 990Gln Arg Pro Pro Gly Arg Leu Gly Arg Trp Ile Arg Ala Val Ser Asp995 1000 1005Glu Asp Leu Glu1010
权利要求
1.一种改造的鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA，其特征是具有SEQ IDNO1所示的核苷酸序列。
2.含有权利要求
1 cDNA的重组酵母表达载体。
3.一种用权利要求
2的重组酵母表达载体转化的宿主细胞。
4.一种鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白，其特征是由权利要求
1的SEQ ID NO1所示的核苷酸序列所编码。
5.一种制备权利要求
4重组VP2蛋白的方法，包括以下步骤培养用权利要求
2的重组酵母表达载体所转化的酵母细胞，诱导重组VP2蛋白的表达，回收并纯化所表达的重组VP2蛋白。
6.按照权利要求
5的方法，其特征是所述的酵母细胞是SMD1168毕赤酵母细胞(SMD1168 Pichia strain)。
7.一种抗鸡传染性法氏囊病的蛋白亚单位基因工程疫苗，其特征是该疫苗含有有效量的权利要求
4的重组VP2蛋白。
8.按照权利要求
7的蛋白亚单位基因工程疫苗，其特征是该疫苗还含有药学上可接受的佐剂、载体或赋型剂。
9.权利要求
1的鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA在制备防治或诊断鸡传染性法氏囊病药物中的用途。
10.权利要求
4的鸡传染性法氏囊病病毒重组VP2蛋白在制备防治或诊断鸡传染性法氏囊病药物中的用途。
专利摘要
本发明公开了一种新的鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA(SEQ ID NO1)、其表达载体的构建、所表达的重组VP2蛋白及该重组蛋白在制备抗鸡传染性法氏囊病蛋白亚单位基因工程疫苗中的应用。本发明鸡传染性法氏囊病病毒VP2 cDNA能够在酵母细胞中高效表达，所表达的重组蛋白具有鸡传染性法氏囊病病毒天然蛋白的生物学活性和免疫原性。将本发明所表达的重组蛋白制成疫苗，免疫鸡实验结果表明本发明蛋白亚单位疫苗能有效诱导机体产生特异性的体液免疫应答，使免疫鸡获得90％的抵抗高致病力vvIBDV致死性攻击的保护，并可有效阻止病毒在体内的增殖。
文档编号C12N15/81GK1990869SQ200510135583
公开日2007年7月4日 申请日期2005年12月30日
发明者王笑梅, 高宏雷, 付朝阳, 高玉龙 申请人:中国农业科学院哈尔滨兽医研究所导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan