专利名称:一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶a缺陷型酵母及使用方法
技术领域：
一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法，本发明涉及针对解决纯生啤酒泡沫稳定性差而从生产菌株出发改造而得的一株蛋白酶A缺陷型工业酵母，以及其实际使用的配套关键技术参数，属于生物工程技术领域：
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背景技术：
纯生啤酒是指采用无菌酿造、无菌过滤、无菌包装生产的新兴的非巴氏杀菌的啤酒品种。由于在生产过程中没有经过热杀菌，避免了加热造成的风味物质变化和营养成分的破坏，保持了啤酒的新鲜口味和成分。与普通啤酒相比，纯生啤酒更纯正、更爽口、更新鲜、营养更丰富，该啤酒已成为啤酒消费的新潮。
由于纯生啤酒未经过巴氏杀菌，酿造过程中酵母分泌的蛋白酶会使成品啤酒仍具有酶活，进而在贮存过程中分解泡沫蛋白，造成其在贮存过程中泡沫衰减，达不到国标的要求，影响饮用的感官，破坏产品形象。酵母能分泌多种蛋白酶，主要有蛋白酶A、蛋白酶B、羧肽酶Y和S，氨肽酶Co和I等。而在酸性条件下只有酵母蛋白酶A(E.C.3.4.23.25)的活性最高，其对啤酒泡沫稳定性的负面影响已被国内外专家证实。
将生产菌株改造成蛋白酶A缺陷型，是解决纯生啤酒在贮存期泡沫下降的根本途径。国外有将单倍体营养缺陷型实验室酵母改造成蛋白酶A缺陷型酵母的报道，但国内外尚无将二倍体生产菌株成功改造成蛋白酶A缺陷型酵母的报道。
发明内容本发明的目的得到一株可在纯生啤酒酿造中应用的蛋白酶A缺陷型的工业酵母菌株，并提出其在实际应用中的配套关键技术参数。
本发明的技术方案一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母，其分类命名为下面发酵酿酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No1858，该菌株为通过基因改造获得的不带任何外源基因的蛋白酶A缺陷型的二倍体酿酒酵母，在啤酒酿造过程中不分泌蛋白酶A，其它发酵性能正常。
用菌株CGMCC No1858进行纯生啤酒酿造的关键技术参数为(1)生产用定型麦汁麦芽∶大米为7∶3，浸出法糖化，最终麦汁浓度控制为11°P；麦汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量达12mg/L，麦汁接种量QD06-2酵母细胞浓度1.8×106～2.1×106个/mL；(2)酵母回收使用在酿造过程中酵母建议使用代数不超过8代，不能有杂菌污染；(3)其它酿造参数同普通菌株纯生啤酒酿造过程。
分析方法蛋白酶A测定的方法取1500μL磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液(pH5.5)于一玻璃试管中，加入1368μL去离子水，加入待测样品120μL，最后加入12μL的1mM荧光底物MOCAc-Ala-Pro-Ala-Lys-Phe-Phe-Arg-Leu(Dnp)-NH2。试样混合均匀，放入30℃水浴锅，反应30min后，放入80℃水浴锅灭活5min，快速冷却到室温，用荧光光度计测量荧光强度，激发波长Ex328nm，发射波长Em393nm。空白样品用去离子水代替样品。啤酒样品需要震荡除气处理。当样品为发酵液时，用双层滤纸过滤。
蛋白酶A活力单位的定义在25℃，pH为6.0下，每分钟水解1mg胰岛素的氧化B链，为一个活力单位(unit)。
其它指标的测定参见国标。
本发明的有益效果结果显示，该菌发酵速度正常，生产出来的啤酒口味纯正，理化指标合理，双乙酰还原速度较快。酿造过程中酵母的增殖和凝聚性较好，便于酵母回收，图1为5次该菌株发酵过程中酵母数目的变化图，可见重显性好，性能稳定。蛋白酶A的活性跟踪检测值均为零，表明酿造过程中该菌株不分泌蛋白酶A。所生产的成品纯生啤酒的理化指标合理。符合国标要求，见表1。成品啤酒的泡持时间，在保值期内能始终高于国标要求，6个月后仍大于230秒，泡持测定的跟踪值见图2。本发明可以获得具有与熟啤酒泡沫稳定性一致的纯生啤酒，解决了现有纯生啤酒泡沫稳定性差的行业难题，该菌株使用方法适合在纯生啤酒生产中推广和应用。
图1CGMCC No1858菌株5次发酵过程中酵母数目的变化图。
图2啤酒的泡持时间在保质期内的变化。
生物材料样品保藏一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型下面发酵酿酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称为CGMCC，保藏编号为No1858，保藏日期2006年11月22日。
具体实施方式实施例1用CGMCC No1858酿造纯生啤酒(1)种子和扩培液11°P全麦芽麦汁。
(2)生产用定型麦汁麦芽∶大米＝7∶3，浸出法糖化，最终麦汁浓度控制为11°P；麦汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量达12mg/L，麦汁接种量QD06-2酵母细胞浓度1.8×106-2.1×106个/mL。
(3)发酵条件主酵控温9.5±0.5℃，降糖至4.2～4.5°P时升温至12℃还原双乙酰；降糖至3.5～4.0°P，封罐保压0.01Mpa。
(4)贮酒升温4天后回收酵母，双乙酰降至0.06mg/L后，降温至0℃；一天后排废酵母，以后贮酒期间每三天排酵母一次。
(5)膜过滤、包装0℃贮酒7-10天后，用纯生膜滤酒，无菌包装。
(6)酵母回收使用在酿造过程中酵母建议使用代数不超过8代，不能有杂菌污染。
酵母的增殖和回收酿造过程中酵母的增殖和凝聚性较好，便于酵母回收，图1为该菌株5次发酵过程中酵母数目的变化图，可见重显性好，性能稳定。蛋白酶A的活性跟踪检测值均为零，表明酿造过程中该菌株不分泌蛋白酶A。所生产的成品纯生啤酒的理化指标合理。符合国标要求，见表1。
表1所得成品啤酒的理化指标(主要依据GB/T4928-2001测定)
实施例2泡持测定跟踪成品啤酒的泡持时间，在保值期内能始终高于国标要求，6个月后仍大于230S，泡持测定的跟踪值见图2。
权利要求
1. 一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母，其分类命名为下面发酵酿酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06-2，已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No1858，该菌株为通过基因改造获得的不带任何外源基因的蛋白酶A缺陷型的二倍体酿酒酵母，在啤酒酿造过程中不分泌蛋白酶A，其它发酵性能正常。
2.用权利要求
1所述菌株CGMCC No1858进行纯生啤酒酿造的使用方法，其特征是关键技术参数为1)生产用定型麦汁麦芽∶大米为7∶3，浸出法糖化，最终麦汁浓度控制为11°P；麦汁的α-氨基氮含量不低于200mg/100mL，充氧量达12mg/L，麦汁接种量QD06-2酵母细胞浓度1.8×106～2.1×106个/mL；2)酵母回收使用在酿造过程中酵母建议使用代数不超过8代，不能有杂菌污染；3)其它酿造参数同普通菌株纯生啤酒酿造过程。
专利摘要
一株适合纯生啤酒酿造的蛋白酶A缺陷型酵母及使用方法，属于生物工程技术领域：
。本发明菌株为下面发酵酿酒酵母(Saccharomyces Carlsbergensis)QD06－2，保藏编号为CGMCC No1858。该菌为二倍体工业菌株的蛋白酶A缺陷型改造株，不含任何外源基因，在啤酒酿造过程中不分泌蛋白酶A，发酵性能正常，酿造的配套关键控制技术参数为11°P麦汁，α－氨基氮不低于200mg/100mL，充氧达12mg/L，麦汁接种量为酵母细胞浓度1.8×10
文档编号C12C11/02GK1995324SQ200610155976
公开日2007年7月11日 申请日期2006年12月27日
发明者李崎, 郑飞云, 郝俊光, 李永仙, 顾国贤, 蒋凯 申请人:江南大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan