专利名称:人促红细胞生成素互补dna的克隆的制作方法
本发明涉及人促红细胞生成素(EP)互补脱氧核糖核酸(CDNA)的克隆，克隆的制备及其表达产物。本发明特别涉及到(1)从人肾脏信息核糖核酸(MRNA)构建的互补DNA文库中
定出人EP CDNA克隆。(2)人EP CDNA的合成及在PBR322质粒中的插入。(3)上述CDNA表达菌E6COLI(大肠杆菌)的增殖。(4)上述CDNA表达的产物。
我的题为“逆向免疫亲和层析纯化法”的共同未决申请已经在第 号专利申请中充分公开，并与本申请同时递交。在此提及该申请作为详述。(此后该申请被称为“EP纯化专利申请”。
我的题为“人尿中促红细胞生成素单克隆抗体和分泌上述抗体的杂交瘤”的共同未决申请已在第 号专利申请中充分公开，并与本申请同时递交，在此提及该申请作为详述。(此后该申请被称为“抗EP专利申请”。
长期以来要求可靠地充裕地供应人的EP以有助于更好地了解促红细胞生成素的分子机制，并且贡献于(1)发展诊断和治疗贫血的方法。(2)了解哺乳动物细胞的分化和发展。不能提供足够的人EP是由于原料的稀少、纯化的困难和对EP生源说缺乏精确的认识。
本发明在用直接逆向亲和层析法纯化天然的EP(在EP纯化专利申请中说明)和制备抗EP的单克隆上取得的进展(在抗EP专利申请中说明)，使有可能尝试克隆人的EP基因，克隆的基因表达后，可产生EP蛋白质。
本发明的目的是提供人EP蛋白质的另一个来源。
另一个目的是
定人EP信息核糖核酸(MRNA)。
再一个目的是合成并确定人EP CDNA的特性。
还有一个目的是产生表达人EP CDNA的重组生物体。
进一步的目的是纯化所述EP CDNA表达产物。
再进一步的目的是确定人EP CDNA的顺序，并
定人EP的组成。
本发明的描述以及附的几项说明及附图是一目了然的。
一方面本发明涉及到与抗人促红细胞生成素(EP)的单克隆抗体有免疫化学反应的一个肽。
另一方面本发明涉及到编码上述肽的DNA片段。
再一方面本发明还涉及到已在哪一点上插入了一个DNA片段的DNA分子，此DNA片段包括了编码所述肽的DNA顺序在内。
还有一点，本发明涉及到含有所述DNA分子的转化的活生物体，所述生物体有表达所述肽的能力。
最后，本发明涉及到产生上述肽、DNA片段、DNA分子和生物体的方法。
图1为人肾多聚腺嘌呤核苷酸信息核糖核酸(POLY(A)+MRNA)体外翻译产物和翻译产物与抗EP单克隆抗体免疫沉淀的电泳萤光图。
图2A十二烷基磺酸钠一聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PACE)分离的自人肾提取物总蛋白质制备的EP粗制品与纯化的EP银染色描绘图。
图2B在所
定的样品中，表明有免疫学法测出的EP特异性蛋白质的免疫吸印放射自显影图。
图3琼脂糖凝胶电泳按分子大小分段分离的MRNA的体外翻译产物电泳放射显影图。
图4A用菌落杂交法检出载有阳性菌落的硝酸纤维膜放射自显影图。
图4B载有阳性菌落，PEP2滤膜的同类型放射自显影图，PEP2在大肠杆菌中以B一乳胺酶融合蛋白形式表达，用单克隆抗EP抗体原位放射免疫测定法检测出。
图5阳性EP克隆插入的CDNA琼脂糖腺胶电泳，溴乙锭染色，紫外光透照法显示。
图6A与阳性EP克隆杂交选出的MRNA体外翻译产物电泳萤光图。
图6B用阳性EP克隆杂交选出的MRNA体外翻译产物电泳抗EP免疫吸印图。
图7在未标记的EP存在与不存在时杂交法选出的分子量为29000与15000道尔顿翻译产物的竞争性免疫沉淀自显影图。
为了克隆EP CDNA，第一次分离了它的功能MRNA。在MRNA的分离工作中遇到了困难，因为对EP合成的特异性细胞位点还没有肯定的了解，虽然已知肾脏起了关键作用。另一困难是活的人肾样品缺乏及EP含量低。因此需要寻找高EP水平和大量的可供应的组织来源。
据文献报导，红细胞增多症可能与各种肾脏肿瘤有关，一些肾癌病人瘤提取物表明EP水平增高，这样的肿瘤常被认为是EP产生癌，无论如何，肾癌肿瘤仅有极少数伴有明显的EP水平增高，因此，肾癌组织在体外培养以后产生EP的能力不再有保证了。从而本发明者广泛地寻找高EP水平的人肾肿瘤，努力鉴定并保证功能MRNA不间断的供应。
导致本发明的工作中，总计检查了36个肾细胞癌，其中两侧用人工缺氧致红细胞增多症的小鼠生物测定法证明有很高的EP水平(0.9和0.3单位/克组织)。观察到肾脏癌中正常组织及癌组织的培养物，某些时候表现有EP滴度升高，相反的、正常肾组织的培养物，用同样方法未检测出EP活性。
在本发明之前，没有特异的方法可分离人肾MRNA，肾组织中含使MRNA失活的核糖核酸酶(Rnase)很高，并很难制成匀浆。进一步的困难由于肾切除样品供应有限，从而通常用于分步分离组织样品的方法(分成胞浆、微粒体、核部分)不能用。因此所有细胞核酸首先从裂解的肾细胞提取物中分离，MRNA按下法选择性集中。
自肾癌受染组织的EP阳性样品得到的正常及癌组织部分，用于制备MRNA，全部过程中必须注意减少核酸酶(内源或外源的)的降解作用。因此，首先在提取缓冲液中加入核酸酶抑制剂。在接触核酸样品之前，试剂应灭菌，玻璃皿应在250℃烘烤过夜。氧钒基一核糖核苷(VRNS)复合物或核酸酶抑制剂(RNASIN)为常选用的核酸酶(RNASE)外源性抑制剂。最首选的抑制剂为VRNS。提取缓冲液中也包括促溶剂(如乙烯、乙二醇、丙烯乙二醇或其它常用乙二醇)、解离剂(如肌氨酸衍生物、盐酸胍或异硫氰酸胍)、还原剂(如B-基乙醇)等的联合应用。总的说，所用方法及试剂极大地影响MRNA的产量和功能。最首选的提取缓冲液中含有异硫氰酸胍、肌氨酸衍生物、β-基乙醇、枸椽酸钠和氧钒基一核糖核苷复合物，以上试剂起分解细胞结构、解离蛋白质和钝化降解酶及核酸酶的作用。
本发明应用的MRNA分离方法，快速、方便、产量好。开始，细胞的裂解非常重要。首先在液氮中干捣碎组织(如用通常的打碎器一样)，以保证足够的温度。这时所有的酶均无活性。
粉状组织用提取缓冲液处理，最方便、充分的是在粉末打碎器中完成。融化细胞物质，再进一步打碎以切剪DNA，并将样品通过一个针头，切剪的程度由混合物的粘稠度明显下降来证明。
采用ULVICH等常用方法(见大鼠胰岛素基因含有编码顺序的质粒的构建。科学(SCIENCE)196期1313页(1977年)。并有特殊改进，见例2。
总RNA浓度用260毫微米(NM)处光的吸收度测定〔吸收率260/230、260/280接近于2〕。这表明没有蛋白质及多糖的污染，产量约0.5-1毫克RNA/克组织。
多聚腺嘌呤核糖核酸(POLY(A)+RNA)用寡聚胸腺嘧啶核苷酸一纤维素(OLIGO DT-CELLULOSE)柱层析选出，按阿维夫(AVIV，H·)等人的方法，(见用OLIGO DT-纤维素柱析法纯化具有生物活性的珠蛋白MRNA)。刊在美国国家科学院学报(PROC·NAT·ACAD·SCI(USA))69期1408-1412页(1972年)。选出的POLY(A)+RNA在低温贮存于乙醇中，在这样条件下可以保证RNA的稳定度。
为证明POLY(A)+RNA含有EP信息(有功能性EP M RNA)，取一些OLIGO DT-纤维素选出的MRNA做体外翻译，用麦胚无细胞系统或首选MRNA依赖的兔网织细胞裂解系统进行翻译，按佩勒姆(PELHAM，H·R·B·等人方法，参见“来自网织细胞裂解物的高效的依赖MRNA的翻译系统”。刊在欧洲生化杂志(EUR J·BIOCHEM·)67期247-256页(1976年)。在POLY(A)+肾脏RNA中编码EP蛋白质的MRNA的存在，可由翻译产物的免疫沉淀证明。免疫沉淀试验按凯斯勒(KESSLER，S·W·)方法进行。参见“应用葡萄球菌蛋白A于免疫沉淀和分离细胞中的抗原”刊在“酶学方法”73卷442页(1981年)(METH·ENZYMOL·)。免疫沉淀试验用纯化的单克隆抗EP抗体的免疫球蛋白G(IGG)(标示为TAT)。这个特异性方法，在例4中描述。两个多肽用单克隆抗EP抗体沉淀，它们的分子量分别为29000和15000道尔顿(DOLTONS)(图1第2行)，这些多肽不被免疫前小鼠血清沉淀(图1第3行)，也不能在内源翻译和其它免疫沉淀样品测出(图1第6、7行)，多肽的分子大小小于天然EP。无论如何，在兔网织细胞裂解系统中，核糖核蛋白体在胞液中是游离的，内质网膜组织及膜结合酶是不存在的。翻译后的修饰，如糖基化也没有发生。所以可被抗EP特异性抗体沉淀的29000道尔顿的多肽可代表EP未糖基化的形式。这些多肽在组织中的存在，也由组织提取物与真正的EP一起用免疫吸印法证实。实践的细节在例4中描述。
按贝利(BAILEY)等人的方法，用羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳按分子大小分步分离得到的MRNA是富含EP MRNA的。参见“甲基汞做为可逆转变性剂用于琼脂糖凝胶电泳”。刊登在“生化分析”70-75页(1976年)(ANAL·BIOCHEM·)分离的核酸部分经过洗脱样品用于翻译，翻译产物接凯斯勒(KESSLER)前述的方法，用单克隆抗EP抗体免疫沉淀法检测EP的存在。
琼脂糖凝胶电泳分步分离RNA，其富含EP MRNA部分(图3第11部分)逆转录成32P-标记的CDNA，用于
定CDNA阳性菌落的杂交探针。逆转录(用禽类成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶)最好用T4激酶RNA磷酸化处理，因为可得到高比放射性活性(可达107计数/分钟/微克，CPM/ug并且不可能标记核糖体RNA及TRNA等单链杂质。
剩余的POLY(A)肾MRNA用做模板，以(OLIGO-DT(12-18)为引物，由AMV逆转录酶合成第一条缝。鉴于(1)有这样机会的情况很少，例如提供EP活性高的人肾样品。(2)从富含核酸酶的肾组织制备完整的多聚核糖体遇到了困难。所以构建了人肾CDNA文库。这个探索不仅承担了小量处理有限量的贵重的RNA，也允许筛选其它有医用兴趣的肾蛋白质，这样的CDNA文库当然也需要筛选大量EP克隆的重组体。
逆转录的最适条件高度地依赖于MRNA的特殊形式、逆转录酶的纯度、核酸酶的干扰、逆转录酶活性与MRNA的比例、底物浓度反应混合物的氢离子浓度(PH)及离子条件。这些都是影响转录有效性的重要因素。
最好的比例是每微克MRNA模板用6单位逆转录酶。氧钒基核糖核苷复合物加到转录反应混合物中，使污染的核酸酶失活。最好的反应条件在例5中说明，常用的逆转录方法按萊杰尔(RETZEL，E·F·)等方法，参见“禽类逆转录病毒的逆转录酶体外酶促合成脱氧核糖核酸”刊在“生化”杂志(BIOCHEM)19期513-518页(1980年)。
反应终了，模板RNA最好用CH3HG OH变性，以避免模板MRNA干扰双链CDNA(DS CDNA)的合成。
互补CDNA最好用大肠杆菌(E·COLI)DNA聚合酶1大片段(KLENOW)(不具有5′-3′外切酶活性)合成，按埃夫斯特拉底阿底斯(EFSTRATIADIS，A·)等人的方法，参见“珠蛋白基因体外酶促合成。刊在“细胞”杂志第7期279页(1976年)。以前一步骤得到的逆转录酶环做为引物。
共价连结第一第二条链的发卡环用S1核酸酶分开，所需S1酶量在予实验中以滴定法决定，用碱性琼脂糖凝胶电泳，可使DNA分子的大小能被肉眼所见。DNA聚合酶1大片段的产物，大小为CDNA分子的二倍，末端为平齐头的DS DNA为原来CDNA的两个分子。在此情况下，最适的S1核酸酶量为2.5单位/微克DS DNA。
本工作中60μg POLY(A)+RNA可得到5微克(μg)平齐头DS DNA。根据维拉可马索夫等的方法。参见“细菌克隆合成前胰岛素”刊在美国国家科学院学报(PROC·NAT·ACAD·SCI·U·S·A·)72卷3727页(1978年)。借同聚物DC∶DG尾端将DS DNA插入到PBR 322的PSTI限制性内切酶位点(定位在氨苄抗性基因)。有寡聚DC尾的CDNA和有寡聚DG尾的载体最好以1∶2比例退火。最好用PBR322，因为它具有做为克隆载体质粒的多用性，它是处于松驰控制下，并含有氨苄及四环素抗性基因，PSTI降解位点是在氨苄抗性基因上的单一降解位点，在PSTI位点克隆，使这个基因失活，因此得到的克隆是氨苄敏感的，另外如得到了质粒，仍应有四环素抗性。
重组质粒转化到E·COLI C 600中，C 600经CACI处理，使具有摄入DNA的能力，并经热休克，按MANDEL，M·等方法，参见“依赖钙的噬菌体DNA感染”刊在“分子生物学杂志”(J·MOL·BIOL·53期159页(1970年)。
用四环素抗性和氨苄敏感性筛选转化体，加上所述PSTI位点是在氨苄抗性基因上，转化体应是对氨苄敏感(AMPS)而对四环素有抗性(TETR)。
最好用E·COLI C 600做为受体菌，因为它是可大规模生长和纯化质粒的好菌株，而且用质粒载体与CDNA经DC∶DG同聚物尾端退火后，能高效转化。
为得到最大的转化率，细菌培养物应在对数生长期用CACL2处理，细胞密度在此期应为大约5×107细胞/毫升。转化前将细胞在冰中放12-24小时，可明显增加转化率。
最适转化反应比例是1-10ng CDNA与100μl细胞悬液。大量悬液或大量CDNA使转化率降低。最好用高级琼脂做为转化铺皿的基质。
虽然有数种方法可
定已插入EP DNA的重组质粒，克隆最好开始用菌落杂交筛选，用32P标记的由富含EP MRNA合成的CDNA为探针，再用纯化的单克隆抗EP抗体的IgG部分离原位菌落放射免疫测定(RIA)。
菌落杂交最好按常用的格鲁斯坦的方法，(GRUNSTEIN，E·ETAL)参见含特异基因的DNA克隆的分离方法”，刊在“美国国家科学院学报”(PROC·NAT·ACAD·SCI·(USA)72卷3961页(1975年)。这里采用小量法(为了节省供应很少的材料而维持方法的敏感性)，应用很小量的32P标记CDNA高比放射活性的探针，小的确硝酸纤维素滤膜，可允许一次筛选大量克隆，转化物的重复克隆，生长在小片滤膜上、裂解菌落、变性DNA(用碱处理)。用蛋白酶K处理细胞碎片、DNA经烘烤固定在滤膜上。DNA与探针杂交、仅与互补DNA结合，并允许阳性克隆由放射自显影鉴定。这个方法非常有效，在进一步筛选时可去掉95%克隆。
阳性克隆挑出，并在硝酸纤维膜上生长，用原位克隆RIA进一步筛选。这个方法需要抗原决定簇的表达，如插入到PBR 322的CDNA的表达产生融合多肽，此肽含有适当的为抗体EP所识别的抗原位点，能提供单克隆抗EP抗体，则RIA是一个很自然的运用来鉴定阳性克隆的筛选法。RIA是一个特别敏感的技术，仅需要小量的含有抗原决定簇的抗原，应用了常用的海尔滋曼(HELZMAN，D·M·)等方法参见“用CDNA表达文库直接免疫学筛选法鉴定编码鸡原肌球蛋白的克隆。”PROC·NATL·ACAD·SCI·(U·S·A)80卷31页(1983年)。
许多RIA操作上的改变是可能的(直接或间接用125I标记-抗EP或125l标记第二抗体)，抗体的结合能力和纯度极大地影响RIA的敏感性。因此，应避免用粗提腹水或仅部分纯化的抗体。
放射性碘化抗体试验最好使用乳糖过氧化物酶珠法进行。见玛沙罗米，J·J·文章，“酶法痕量碘化免疫球蛋白及其它蛋白质”。刊在“在化”杂志(BIOCHEM.J)113期299页(1969年)。
本工作鉴定了三个阳性克隆，标示为PEP 1，2和3，所有三个克隆一致与单克隆抗EP抗体7A7反应(125I标记及未标记)。
RIA阳性克隆在培养基上生长，分离质粒DNA，插入的CDNA分子的大小，由PSTI限制性内切酶酶解，6%聚丙烯酰胺凝胶电泳分万鉴定，φ×174噬菌体R.F DNA HAE Ⅲ酶解片段用为分子大小的标准，插入片段的大小，对PEP 1，2，3分别约为1400对600对和200碱基对。
进一步证明阳性克隆的确含有EP顺序，杂交筛选EP特异MRNA按帕恩斯(PARNES ET AL)等公开的方法完成参见尔鼠β-2-微球蛋白CDNA克隆相应于稀有MRNA的CDNA克隆的筛选方法，(PROC·NATL，ACAD·SCl·(U·S·A)78·2253(1981)，修改如下，质粒DNA按Ⅰmg/ml溶于水中，在0.25N的NaOH中热变性、中和、点样于硝酸纤维膜上，含有DNA的滤膜与POLY(A)+RNA杂交。想要得到清楚的结果建议用较大量的mRNA(2.5μg POLY(A)+RNA/μg质粒DNA)杂交筛选的MRNA的滤膜上洗下，按上述方法进行体外翻译，S-标记的翻译产物用SDS-PAGE和萤光图分析，所有三个克隆杂交选出的MRNA，指导合成分子量为150000，29，000，66，000及可能为92，000道尔顿的多肽。多肽鉴定最后的证明是用免疫吸印法及竞争性免疫沉淀法。从杂交选出的mRNA体外翻译产物的SDS-PAGE分离产物电泳转移到硝酸纤维素膜上(0.45微米孔径)用纯化的单克隆抗EP7A7抗体的IgG(由在抗EP专利申请中所述方法得到)做免疫吸印法，这个方法由托宾(TOWBIN，H·)等发表在“自聚丙烯酰胺凝胶到硝酸纤维素膜上蛋白质的电泳转移方法及应用”。(PROC，NAT·ACAD·SCl·(U·S·A)764350(1979)，在例9中详细叙述。竞争性免疫沉淀反应在过剩的未经标记的纯EP存在下进行，见例10。杂交法选出的，体外合成的29，000与15，000道尔顿多肽在免疫法印吸及免疫沉淀法中与抗EP反应，并与真正EP在结合抗体时发生竞争。
天然人尿EP的分子量是34，000的道尔顿，无论如何，全肾MRNA及杂交选出的MRNA的体外转录产物的免疫吸印及免疫沉淀法鉴定，都得到两个分子量为29，000和15，000道尔顿的多肽。自富含EP的肾癌样品组织提取物的免疫沉淀反应中，除34000道尔顿多肽外，也得到这两个多肽，34000道尔顿多肽的分子大小与天然糖基化EP一致。对比之下，29K多肽比予期的天然糖基化EP小。相信在依赖信息的兔网织细胞裂解系统的体外翻译中可解释以上所讨论的小分子量物质。杂交选出的可被单克隆抗EP特异性识别的29000道尔顿多肽被认为是EP未糖基化形式。15，000道尔顿多肽被认为是一个EP相关蛋白质，它与29000及34，000道尔顿多肽有明显的免疫学相关性并共有其一部分抗原决定簇。
自天然人尿EP的分子量判断，PEP1克隆的CDNA插入是在所编码分子大小的范围之内，而PEP2和PEP3克隆对编码EP全顺序来说是太短了，这些DNA在制备能表达的全长度人EP CDNA顺序中是有用的。
另外由限制性内切酶图谱决定的定位在MRNA 3′端的CDNA片段可用为MRNA逆转录的引物。由于3′引物是一个特异的EP CDNA片段，由这个逆转录反应合成的唯一的CDNA就是CDNA。逆转录的最好结果是期望产生全EP CDNA。
顺序测定是按照MAXAM，A·M等详细介绍的技术进行，“测定DNA顺序的一个新方法”(PROC·NAT·ACAD·SCI·(USA)74560(1977))和SANGER，F·等方法“用链末端终止剂测定DNA顺序”。(PROC·NAT·ACAD·SCI·745463(1977))。
下面举例说明本发明而不限定其范围。
琼脂糖和氧钒基-XTP′S复合物来自贝蒂斯塔实验室(BETHESDA RESEARCH LABORATORIES)(BRL)。
磷酸肌酸、亚精胺、必需氨基酸，N-2羟乙基哌嗪-N-2-乙基磺酸，小牛胸腺脱氧核糖核酸、溶菌酶、四环素、氨苄青霉素、二硫苏糖醇、乙二胺四乙酸盐、氯化高铁血红素，脱氧胆酸钠为SIGMA CHEMICAL CO·，ST·LOUIS MO的产品。
限制性内切酶，PBR 322质粒，大肠杆菌脱氧核糖核酸聚合酶I，S1核酸酶，噬菌体φX174 DNA-HAEⅢ降解物为NEW ENG LAND BIOLABS·BEVERLY，MASS产品。
硝酸纤维素膜来自MILLIPORE，BEDFORD，MASS。
蛋白酶K，小牛肝转移核糖核酸(TRNA)来自BOEHRINCER MANNHEIM BIOCHEMICAL，INDIANAPOLIS，INDIANA。
禽类成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶来自LIFE SCIENCES INC·ST·PETERSBURC，FLORIDA。
葡聚糖凝胶G-100(SEPHADEX G100)，蛋白A来自PHARMAC-IA，PISCATAWAY N·J·。
嗪〔双〕乙磺酸(PIPES)，去离子甲酰胺(DF)，异硫氰酸胍，氯化苷和肌氨酸衍生物来自FLAKA CHEMICAL CORP·，HANPPAUC-E，N·Y·。
牛血清白蛋白来自SCHWART-MANN BIO-CHEMICAL，SPRINC VALLEY，N·Y·。
寡聚DT-引物和寡聚二胸腺嘧啶核苷酸纤维素来自COLLABORATIVE RESEARCH，WALTHAM，MASS·。
〔35S〕-甲硫氨酸，125I一山羊抗小鼠lgG和乳糖过氧化物酶珠来自NEW ENGLAND NUCLEAL COMPANY，BOSTON，NA S·。脱氧核糖核酸酶来自WORSHINGTON FREEHOLD，N·J·。
硝酸纤维素膜来自SCHLEICHER & SCHULL，KEEHE，N·H·。
去利通X-100(TRITON X-100)来自EASTMAN KODAK，ROCHESTER，N·Y·。
例1 寻找高EP滴度的人肾样品用两年半以上的时间广泛检查了外科手术有EP活性的肾癌样品，所得到的肾切除的组织尽可能保持新鲜，分成正常及肿瘤部分，用灭菌的冰冷的磷酸盐缓冲生理盐水洗去血液和外部的物质，取一小部分另放，供EP生物测定及建立连续组织培养时使用。其余的很快在液氧中冰冻，并保存于-70℃，用于分离EP MRNA。组织提取物中EP的活性用人工缺氧致红细胞增多症的小鼠做体内测定。在液氮中将样品研成粉，制备组织匀浆用20mm磷酸钠PH7.8(等比例g/V)提取。提取物在30000×g下离心30分钟，除去细胞碎片，上清液用于生物测定。
研究了36个肾细胞癌新取物，两例具有高EP活性(0.9和0.3EP单位/毫升，六例具有中度活性(0.1至0.7EP单位/毫升)，其余的具有边缘值(＜0.1EP单位/毫升)或检测不出EP活性。自尸检样品得到正常肾组织提取物，总的说未能测出EP活性，但偶而有小于0.05单位/毫升的活性。肾癌样品中EP活性增高既在肾组织正常部分也在肿瘤部分均有发现。高EP生物活性的样品用于制备NRNA。
例2 功能性的人肾RNA的分离纯化具有红细胞增多及高EP活性(EP阳性，3.0单位/克组织)的肾癌病人的肾切除的样品从例1中选出。
肾组织正常部分及肿瘤部分均分别用于制备MRNA。
全人肾MRNA用胍/氯化铯法分离，按乌尔里克(ULRICH)等人办法。根据需要每批10克制备核糖酸。在粉碎器中将液氮冰冻的组织磨成粉状，加入5倍体积提取缓冲液，提取缓冲液含6M异硫氰酸，5mm枸椽酸钠PH.7.0，0.1Mβ-颈基乙醇，0.5%SarkOSYL，混合再匀浆三分钟，混合物通过22号针头切剪DNA，溶液在10000转/分钟下离心15分钟，收集上清液，加入氯化铯使溶液达0.4g/Ml，将此溶液小心放在5.7M CSCL含0.1M EDTA(PH7.5)的底液上面，成一薄层(3Ml底液，2Ml组织提取物)，在BECKMAN离心机用SW50.1离心管，2，5000转/分下，20℃离心16小时。RNA的沉淀溶于10mm TRIS-HCL PH7.4，5mm EDTA，1% SDS的缓冲液中用酚提取，然后用4∶1(V/V)的氯仿∶1-丁醇提取，最后用乙醇沉淀。
例3 选出POLY(A)+MRNA例2中的总RNA是经过OLIGO DT纤维素柱(0.9×10cm，床体积6.4Ml)选出的POLY(A)+RNA。将RNA悬于10mm TRIS-HCL，0.5M NACI缓冲液(PH7.4)，加到柱上。选择性吸附的POLY(A)+RNA用10mm TRIS-HCL，PH7.4，含1mm EDTA和0.1% SDS的洗液洗脱，用2倍体积乙醇于-20℃沉淀24小时。沉淀用70%乙醇洗，重溶于水，置于-20℃保存。一般每克肾组织中得到0.5-1毫克总核酸，每毫克总核酸可得到20微克POLY(A)+RNA。
例4 体外翻译及免疫沉淀体外翻译在依赖信息的兔网织细胞裂解系统中进行，用〔S〕一甲硫氨酸标记(NEW ENGLAN D NUCLEAR，1236 CI(居里)/MMOL(毫克分子))。裂解物用纯化的单克隆抗EP抗体的IgG(50Mg/Ml)予吸附，用固定的带有蛋白质A的金黄色葡萄球菌澄清，(250μg/Ml，IgG吸附，来自NEW E NGLAND中心，BOSTON，MA-RS·)反应混合物(25μl)含1-5μg/Ml POLY(A+)RNA，〔5〕-甲硫氨酸(NEN)55μCI(居里)，N-2-羟乙基
嗪-N-2-乙基磺酸(HEPES)20mm，PH7.6，KgG 80mm，乙酸镁(MCOAC2)1.3mm，网织细胞裂解系统10μl，37℃，保温1小时。标记的翻译产物用抗人EP单克隆抗体的IgG部分进行免疫沉淀，按凯斯勒(KESSLER)方法，用5到50μg IgG反应组份用小鼠血清予吸附，在10mm TRIS-HCL，PH8.2;0.15M NACL中4℃下保温24小时。加入100到200ml 10%固定的带有蛋白质A的金黄色葡萄菌，在4℃下保温培养1小时，收集免疫复合物。沉淀用50mm TRIS-HCL PH7.4;0.15M NACI;1mm EDTA;0.1%SDS，1%脱氧胆酸钠，1% TRITON X-100(缓冲液W)洗6次，并悬浮于电泳缓冲液中进行电泳分析。翻译产物和其免疫沉淀产物用SDS-PAGE分离，并用萤光图分析(图1)。鉴定出两个免疫特异性多肽，一个泳动于分子量29000道尔顿处，另一个约在15，000道尔顿处(行2)，这两个多肽不被小鼠免疫前的血清沉淀(行3)，在内源翻译及其免疫沉淀样品中未被测出(行6，7)。以上所讨论的，被单克隆抗EP抗体特异沉淀的分子量29，000的多肽，可能代表EP的未糖基化的形式。明显的具免疫学相关性的分子量为15，000的多肽，可能代表未糖基化EP的前体或降解片段。为证明这些多肽存在于原组织提取物中，进行了免疫吸印法。粗品及纯化的人尿EP也进行同样吸印法，以直接比较它们的免疫学特异性。分子量34000的单一多肽，从粗品及纯品EP中被吸印(图2B，第2和3行)，而在组织中测出了分子量为34000 29，000和16，000道尔顿的三个多肽。大小与真正的糖基化EP一致，小分子多肽是EP降解形式或未糖基化前体的可能候选者。免疫特异性多肽在组织提取物中及体外翻译产物中的存在，支持了它们做为EP相苄形式及有功能MRNA存在的鉴定。同样处理的那些未吸印的凝胶样品进行银染色，分析其总蛋白质(图2A)，及相关的EP特异性蛋白质(图2B)。单克隆7A7的免疫学特异性是自证的。这些结果说明，单克隆抗EP抗体识别天然的糖基化EP和它的前体片段。
本工作中应用的人EP单克隆抗体已制出，详细叙述见抗EP专利申请。
纯化IgG用于本工作中谈到的所有免疫沉淀法、免疫筛选法和免疫吸印反应。
例5 双链CDNA的合成和克隆Poly(A)+肾脏mRNA(20g)来自例3，用作CDNA酶促合成的模板。禽类成髓细胞瘤病毒AMV逆转录酶用于合成在Ol-igodT 12-18引物存在时CDNA的第一条链。条件为500升反应混合物用20克模板。反应混合物含Poly(A)+RNA模板，50mM Tris，PH8.3，10mM MgCl2，100mM KCl，140g/ml引物，1mM甲基羟汞(CH3HgOH)使RNA变性，30mMβ-巯基乙醇，1mM硫酸氧钒核糖核苷复合物，2mM各种脱氧核糖核苷酸，120单位逆转录酶。42℃下保温1小时。游离核苷酸用Sephadex G-100凝胶过滤除去。RNA模板用12mM CH3HgOH处理，使其变性。第二条CDNA链用E·Coli DNA聚合酶I Klenow大片段合成。反应体系含有100mM Hepes PH6.8，70mM KCl，7mM MgCl2，10mM DTT，22.5mMβ-巯基乙醇，每种脱氧核糖核苷酸各0.5mM，每2克CDNA用100单位大片段Kl-enow酶，反应于15℃下保温18小时，终体积为1ml。酚提取后，Sephadex G-100凝胶过滤，乙醇沉淀。CDNA用S1核酸酶处理，分开第二条链5′端的发卡环。所需S1酶量每次实验都需用碱性琼脂凝胶电泳予实验滴定。在本实验中最适浓度为每纳克(ng)双链CDNA用2.5单位S1核酸酶、反应混合物中还含有30mM醋酸钠(NaAc)PH4.6，300mM NaCl，3mM ZnSO4，在37℃下保温1小时。
CDNA用未端转移酶和脱氧嘧啶核苷三磷酸dCTP处理，于3未端加10-15个残基，PstI酶鲜的PBR322同样用末端转移酶及脱氧鸟嘌呤核苷三磷酸dGTP处理。反应混合物含有140mM二甲胂酸钾PH7.2、0.5mM COCl2、240mM dCTP或dGTP、1.5mg/ml牛血清血蛋白(BSA)和6000单位/毫升的末端转移酶。25℃下保温15分钟。CDNA由同聚物尾dc∶dG结合，插入到PBR322的PstI位点。寡聚(dc)尾的CDNA和寡聚(dG)尾的载体以1∶2比例于42℃保温2小时退火。重组质粒转化入CaCl2处理的E·Coli C600菌株并热休克。选择四环素抗性(TetR)氨苄青霉素敏或(AmPS)的转化株。
将1mlE·Coli C600过夜培养物接种于内装100ml肉汤的500ml三角瓶中。37℃震荡培养至密度约为5×107细胞/毫升。培养液于冰中冷却10分钟，再于4℃下，4000xg离心10分钟。弃去上清液，细胞悬浮于(原培养体积的1/5)冰冷灭菌的100mM CaCl2和20mM NaAC，PH6.5中。并将悬液于冰中放20分钟，再离心10分钟。弃去上清液，细胞重悬于(1/100原培养体积)冰冷经灭菌的0.1M CaCl2和20mM NaAc溶液中并于冰中放置20小时。
在10个管中分别加入100μl细胞悬液和1-10ng的载体。混合物于冰中放10-30分钟，每管中加入1ml肉汤，37℃震荡培养1小时，使细菌恢复生长并表达出对抗菌素的抗性。
在肉汤四环素平皿每1升溶液含10克bacto胰蛋白酶水解胨，5克酵母提取物，5克Nacl，3.5毫升(1M)NaoH和15克琼脂，25微克/毫升四环素)上和肉汤氨苄平皿(含100微克/毫升氨苄青霉素替代四环素)上筛选四环素抗性(TetR)和氨苄敏感(AmPS)的转化株。37℃下保温12-16小时后，菌落开始出现。转化频率在四环素抗性筛选平皿上，每微克CDNA为5×105个转化株。近于95%的转化株，具有四环素抗性及氨苄敏感性。
例6 EPmRNA富集及〔32P〕CDNA探针的合成羟甲基汞琼脂糖凝胶电泳POly(A)+RNA50μg于1.5%低熔点琼脂糖(BRL，Bethesda MD)，含12.5mM CH3HgOH电泳分段分离，40伏，15小时。以噬菌体φ×174Hae Ⅲ酶解物及Hela细胞核糖体RNA做为分子大小的标准物同时电泳，胶板浸入0.5M NH4AC中，并用溴乙锭染色。含有Poly(A)+RNA的胶段浸入100mMDTT中使RNA复性。胶行切成30份，每份中的RNA用可控微波加热法提取，酚提取、乙醇沉淀。分段分离的RNA部份做体外翻译及翻译产物的免疫沉淀反应，按例4中方法进行，以决定富含EPmRNA在凝胶上的部位。35S-标记的翻译产物及其免疫沉淀物用SDS-PAGE法分析。用抗EP7A7(图1，第4、5行)与翻译产物的免疫沉淀法测定，EPmRNA的主要部分存在于第11段中(图3第11行)。用核糖体RNA和φXDNA Hae Ⅲ片段做为标志，第11部分分子大小约相当于14，000bp。这一部分按照例5用于合成32P-标记的单链CDNA。得到比放射活性为107CPm/μg。32P-标记的CDNA用做初筛重组质粒的探针。
例7 CDNA文库的初筛选-原位菌落杂交例5中的TetR，AmPS转化株逐个挑出，并在硝酸纤维素膜(Millipae，4.5cm，含有100个方格)上生长。用12张滤膜，每张接种100个菌落，每个菌落在一个方格中。每张滤膜放在肉汤四环素平皿的表面，37℃保温20小时，用改良的菌落杂交法筛选转化株，用32P标记的CDNA为探针，CDNA是由按分子大小分级分离后富含EP信息的mRNA部分合成的。
载有菌落的滤膜，用0.4N NaoH处理，中和然后用蛋白酶K处理。DNA经80℃真空烘烤4小时以固定在滤膜上。12张滤膜一起杂交，在3毫升1×106CPm/ml的探针，50%去离子甲酰胺(DF)，0.75M NaCl，75mM枸椽酸钠溶液中，37℃下保温24小时。滤膜用0.3M NaCl，30mM枸椽酸钠，室温下洗6次(每次洗45分钟)，吸干、放射自显影。
典型的载有菌落杂交的滤膜结果见图4A。检测出两类阳性菌落。一类占总菌落的0.1-0.4%，与探针杂交很强，在放射自显影图上有微密斑点。第二类，占总菌落5%，与探针有不同程度的杂交，但明显的比第一类强度低。其它的菌落是阴性。经过予筛，在予选中的约95%的转化株在进一步的筛选中被除去。
例8 菌落的免疫学筛选和质粒DNA的定性按Helfman等人方法进行免疫学筛选。常用人EP单克隆抗体原位菌落放射免疫测定法(RIA)。细菌菌落生长于4.5cm硝酸纤维膜上，并如前所述在三氯甲烷CHCl3蒸气中裂解30分钟。每张滤膜在培养皿中用10ml裂解缓冲液处理，室温过夜，并缓缓地摇动。裂解缓冲液含3%BSA，50μg/ml溶菌酶2μg/ml DNase，在50mM Tris-HCl PH7.4，150mM NaCl(Tris/生理盐水)溶液中。滤膜用Tris/生理盐水溶液彻底冲洗，与5ml用Tris/生理盐水/3%牛血清蛋白溶液配制的纯化IgG7A7(1毫克/毫升)一起在室温保温1小时。滤膜用相同缓冲液洗6次，每次洗45分钟，除去非特异性吸附的抗体。结合的抗体与125I-标记亲合纯化的山羊抗小鼠IgG(1×106CPm/ml)保温1小时检测。滤膜用缓冲液ω彻底洗净(6-8次)，用于放射自显影分析。阳性克隆用125I-标记的单克隆抗EP抗体(2×106CPm/ml)直接克隆RIA法证明。同位素碘化反应用乳糖过氧化物酶方法进行，在所有R1A反应中，在滤膜上点上不同量的纯化EP做为抗原免疫检测特异性的对照。在这些对照中可测出小于1纳克(ng)的纯EP。
从菌落杂交得到的阳性重组体挑出，并生长在划好方格的硝酸纤维素膜上，编号登记，以供7A7做原位菌落RIA免疫学筛选用。这个方法依赖于插入到PBR322β-乳胺酶操纵子上的CDNA的表达，产生含有可被抗EP识别的有适当抗原位点的融合多肽。自1.4×105个转化株中鉴定出三个阳性克隆，这些克隆始终与7A7有反应，标示为PEP1，2和3。表示阳性克隆(PEP2)检测的有代表性的滤膜见图4B。阳性克隆均免疫特异性由125I标记7A7直接克隆R1A法证明。所有三个克隆的与125I7A7有阳性反应并一贯如此。分离了这些克隆的质粒DNA，并按下述方法定了分子大小。
用碱裂解方法制备质粒DNA是根据伯恩鲍依姆(Birnboim)，H·C·等人方法，参见“筛选重组质粒DNA的快速碱提取法”刊在“核酸研究”第7卷1513页(1979年)，(Nucl·Acids Res·)。在1M Nacl溶液中离心纯化，用SW50·1转头，20℃下以40，000转/分离心6小时。限制性内切酶解按厂家推荐条件进行。凝胶电泳用6%聚丙烯酰胺凝胶或1%琼脂糖凝胶。φX174RF DNA Hae Ⅲ酶解片段做为标准。PEP1、2和3插入片段的大小分别为1400，600，200个碱基对(bp)(图5，分别为第2，4和1行)。
例9 mRNA的杂交选交及体外翻译mRNA的选出按前述改进的帕恩斯(Parnes et al·)方法，将质粒DNA悬于水中(1mg/ml)，在0.25N的NaOH中96℃下加热2分钟，使其变性，速冷，用HCl中和，点到硝酸纤维膜上至饱和。滤膜在90℃下烘烤2小时，再与人肾POly(A)+RNA杂交，比例为每微克质粒DNA用2.5微克POly(A)+RNA。杂交在50℃下进行3小时，总体积100μl，含65%(V/V)的DF/20mM 1.4-哌嗪双乙磺酸(PIPES)，PH6.4/0.2%SDS/0.4M Nacl/每毫升100微克小牛肝tRNA。经杂交选出的mRNA用200μl水在100℃下洗脱90秒钟，再于液态氮中突然冰冻。洗脱液用乙醇沉淀，以10到20微克小牛肝tRNA做为载体。杂交选出的mRNA做体外翻译，35S-标记的翻译产物经SDS-PAGE分离鉴定和萤光图分析(图6)。如在图6A中所见，由PEP1，2和3选出的RNA都可以指导合成35S-标记的多肽(分别为第4，5，6行)。与凝胶上标准物的分子量相对照，这些多肽的分子量约为92，000、66，000、29，000和15，000道尔顿。92，000道尔顿的多肽区带，在内源翻译(0行)和PBR322选出的样品(第1行)中也可见到，但强度低得多，66，000、29，000和15，000道尔顿多肽在0行及1行中未测出，说明它们是EP特异性的。
这些多肽鉴定的最后证明是用如例10所述免疫吸印法及竞争性免疫沉淀法进行的。
例10 用免疫吸印法及竞争性免疫沉淀法检测体外合成的具有抗原性的蛋白质蛋白质的电泳转移如前述用Towbin等人的方法进行。使用0.45μm孔度的硝酸纤维素膜，转移于25mM Tris-HCl PH8.4/192mM甘氨酸/20%甲醇(V/V)溶液中进行，用TE50电源及Hoefer TE42转向装置以0.35安培电流电泳12小时，再在1安培下电泳3小时。电泳吸印物用Tris/生理盐水冲洗，在3%牛血清白蛋白/Tris/生理盐水中40℃下保温1小时，使其余的蛋白质结合位点饱和。然后与7A7(1mg/ml)一起在3%牛血清白蛋白/Tris/生理盐水中，室温下保温1小时，或4℃过夜。用Tris/生理盐水洗后，吸印物与125I标记山羊抗小鼠IgG(1.2×106CPm/ml)室温保温1小时。每100平方厘米的吸印物，用10ml抗体溶液。吸印物用ω缓冲液彻底洗涤6到10次，每次洗45分钟，最后自显影。结果见图6B。两个多肽分子量29，000和15，000可被抗EP免疫吸印，而分子量92，000及66，000多肽未被测出。在肾总POly(A)+RNA(第2、3行)及杂交选出mRNA(第4、5和6行)的翻译中，都是确实的。是否由于高分子量蛋白质转移的低效性或缺少抗原性的识别，需进一步研究。
杂交选择的翻译产物35S-标记的竞争性免疫沉淀反应，籍在免疫反应混合物中加入纯化的未标记的天然EP来进行。35S-标记的分子量29，000及15，000的多肽在无标记的EP时，则这些多肽的沉淀被抑制(第4和5行)。免疫前的小鼠血清不能沉淀这些多肽(第1行)，在内源性翻译中也测不出任何沉淀(第2行)。2μg未记的纯EP则抑制达90%以上(第5行)。结果说明，杂交选出的翻译产物29，000和15，000道尔顿多肽，可被单克隆抗EP7A7所识别，真正的EP在抗体结合反应中可与之竞争。
权利要求
1.一种多肽，其特征是与人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应。
2.根据权利要求
1所述的多肽，其特征是它由一个至少包含有为所述肽编码的DNA序列在内的一个DNA片段的生物体产生的。
3.根据权利要求
2所述的多肽，其特征是产生它的生物体被包含所述DNA的表达载体转化。
4.一种融合蛋白质，其特征是本质上它由能与抗人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽及生物体内源性蛋白质的一部分所组成。
5.一种DNA片段，其特征是含有给能与抗人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽编码的脱氧核糖核苷酸序列。
6.一种重组DNA分子，其特征是包含权利要求
5所述的DNA片段。
7.一种生物体，其特征是它被权利要求
6所述的DNA分子转化。
8.根据权利要求
8所述的生物体，其特征是它含有一个大肠杆菌种的细菌。
9.根据权利要求
6所述的重组DNA分子，其特征是在含有为上述肽编码的所说的DNA片段的DNA分子内，含有所说的DNA片段。
10.根据权利要求
9所述的重组DNA分子，其特征是，其编码的肽能以融合蛋白质形式表达。
11.根据权利要求
6所述的重组DNA分子，其特征是，这个重组DNA分子是一个从PBR322衍生出的一个杂交质粒。
12.根据权利要求
11所述的重组分子，其特征是其中所含的DNA片段是被插入到所说质粒的PstI(Providencia StuartiiI)切点。
13.根据权利要求
12所述的重组LNA分子，其特征是DNA片段通过同聚物dc∶dG尾端插入。
14.一种功能mRNA分子，其特征是它是携带人促红细胞生成素信息的纯化形式。
15.根据权利要求
14所述的功能mRNA，其特征是它由肾癌细胞衍生而来，肾癌又具有促红细胞生成素高滴度。
16.根据权利要求
15所述的功能mRNA，其特征是促红细胞生成素滴度大于1单位/克组织。
专利摘要
本发明涉及制造能与人促红细胞生成素单克隆抗体起免疫学反应的肽的方法，还涉及制造及其编码的DNA片段，含有这个片段的重组DNA分子、包含携带此DNA分子的表达载体及以此转化的微生物的方法。本发明也涉及这一系列方法得到的产品。
文档编号C12N15/00GK85101181SQ85101181
公开日1987年1月10日 申请日期1985年4月1日
发明者西尔维亚 申请人:纽约大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan