专利名称:微生物胆固醇酯酶制备工艺的制作方法
本发明属生物工程技术领域：
，特别是涉及一种利用微生物发酵技术制备胆固醇酯酶的工艺。胆固醇酯酶能够水解胆固醇酯为游离酯肪酸和胆固醇，分解得到的胆固醇进一步经胆固醇氧化酶、过氧化物酶催化的反应，可测定血清中总胆固醇的含量，反应过程如下
以上反应原理已普遍应用于临床诊断，是测定人血清中总胆固醇含量的准确、快速、灵敏的方法。在上述反应中，于37℃每分钟将1微克分子胆固醇酯分解成胆固醇和脂肪酸的酶量定为胆固醇酯酶的1个活力单位。1974年，Allain和Richmonds等人首先应用牛胰胆固醇酯酶，微生物来源的胆固醇氧化酶，辣根过氧化物酶等三酶偶联测定血清总胆固醇及游离胆固醇的含量，从而确立了酶法测定胆固醇含量的基础。但是，用牛胰生产胆固醇酯酶有许多缺点(1)原料来源受限制，(2)牛胰破碎后成份复杂，且含有胰旦白酶等蛋白水解酶类，给分离、提取胆固醇酯酶带来许多困难，(3)牛胰胆固醇酯酶的热稳定性差。能克服这些缺点而更适合于工业生产的是从微生物中获得胆固醇酯酶。日本、西德、美国已先后从细菌、诺卡氏菌、链霉菌、霉菌中发酵得到此酶。日本学者曾经从Pseudomonas菌属中发酵得到胆固醇酯酶(日本公开特许公报，昭54-113493)，其在培养基中加入油酸、亚油酸及其胆固醇酯时，该菌株能同时发酵生产胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶，在一般的碳源中，只能生产胆固醇氧化酶，同时发明了分离胆固醇酯酶和胆固醇氧化酶的方法(日本公开特许公报，昭54-138188)，但未见将二酶配制成酶联制剂的报道。
本发明的目的是采用简便的制备工艺从微生物中获得符合临床分析要求的胆固醇酯酶。
本发明的任务是以如下方式完成的将经过生理生化特征和形态培养特征鉴别为假单胞菌(Pseudomohas)的菌种(该菌种不管改用何种碳源或氮源只产生胆固醇酯酶，不产生胆固醇氧化酶)接种于以酵母膏，尿素为氮源;甘油为碳源;油酸、亚油酸及其胆固醇酯，或豆油、豆磷酯、卵磷酯、α-甘油磷酸等为诱导剂;以及各种无机盐的培养基中，在通气，搅拌的条件下，提高发酵产酶单位，发酵液经过分离、提取、盐析、柱层等步骤，制得胆固醇酯酶。用此酶配制而成的酶联试剂的稳定性，澄明度均明显优于用胰脏胆固醇酯酶配得酶联试剂。以此酶联试剂测定血清中总胆固醇含量数据与用胰脏酯酶配得的酶联试剂测定完全一致，且工艺简单，成本低。
实例一将冷冻管保存的Pseudomonas菌种接种在肉汤斜面培养基中，37℃培养，待菌体长好后，接种于含有0.2～0.5%酵母膏，0.5～1.0%甘油，0.05～0.15%K2HPO4，0.1～0.3%尿素0.05%KCl，0.05～0.15%MgSO4，0.2～0.5%豆油，PH6.7～7.2，50ml发酵培养基中，摇床230转/min，30℃培养36～40小时，培养结束，用3500转/min离心除去上清液，并用蒸馏水洗涤菌体，离心弃上清液，加入含表活性剂tritonX-100的tr;s-HCl缓冲液提取胆固醇酯酶，测得胆固醇酯酶发酵单位为0.2～0.4U/ml。
实例二用50L缶，将例一中的摇瓶种子接入装有含0.5～1.5%酵母膏，0.5～1.5%甘油，0.2～0.3%尿素，0.05～0.15%K2HPO4，0.02～0.05%KCl，0.02～0.05%MgSO4，0.1～0.2%油酸，0.1～0.2%卵磷酯，PH值为6.7～7.2，并经120℃，1.1Kg/cm2灭菌的30L培养基中，用1∶1V/V/min，30～33℃，培养30～40小时。
同实例一处理菌体得胆固醇酯酶提取液，测得胆固醇酯酶发酵单位200～400U/l。
提取液用40～60%饱和度的硫酸铵沉淀，沉淀溶解后所得粗酶用1MHAC溶液调PH至4.5，通入预先用PH4.5HAC缓冲液平衡好的甲基丙烯酸系弱酸性阳离子交换树脂D-20柱中，胆固醇酯酶被吸附，用6倍量同样的缓冲液洗涤柱，然后用PH5.2HAC缓冲液洗脱，胆固醇酯酶总收率67.5%，纯度提高20倍。
实例三用50L缶，将例一中的摇瓶种子接入装有含0.7～1.0%酵母膏，0.7～1.0%甘油，0.2%尿素，0.01%K2HPO4，0.05%KCl，0.05%MgSO4，0.2%油酸，0.2%卵磷酯，并经120℃，1.1kg/cm2灭菌的30L培养基中，用1.1U/U/min，31℃，培养30～36小时，所得胆固醇酯酶发酵单位为300～400U/l。
(4)文件名称 页 行 补正前 补正后说明书 3 15 阳离子交换树酯 阳离子交换树脂(如D-20 SLPI-400)3 23 用1.1U/U 用1.1V/Vmin，min，31℃，通气搅拌，31℃权利要求
书 1 6 在湿度30℃～ 在温度30℃～33℃，33℃1 倒1 换树酯吸附，换树脂吸附，
权利要求
1.一种利用微生物发酵技术制备胆固醇酯酶的工艺。其特征是将假单胞菌(Pseudomonas)经配方为0.5～1.5%酵母膏，0.5～1.5%甘油，0.2～0.3%尿素，0.05～0.15%K2HPO4，0.02～0.05%KCl，0.02～0.05%MgSO4及各种诱导剂0.2%～0.5%，PH6.7～7.2的发酵培养基，在湿度30℃～33℃，通气搅拌培养30～40小时，通过分离，提取，盐析、柱层获得胆固醇酯酶。
2.按权利要求
1所述的那种利用微生物发酵技术制备胆固醇酯酶的工艺，其特征是诱导剂采用的酯类是豆磷酯，卵磷酯，胆固醇油酸酯，胆固醇亚油酸酯及α-甘油磷酸，采用的油类为油酸，亚油酸，豆油。
3.按权利要求
1所述的那种利用微生物发酵技术制备胆固醇酯酶的工艺，其特征是提取方法采用表面活性剂triton X-100，提取胆固醇酯酶。
4.按权利要求
1所述的那种利用微生物发酵技术制备胆固醇酯酶的工艺，其特征是层析方法采用甲基丙烯酸系弱酸性阳离子交换树酯吸附，纯化胆固醇酯酶。
专利摘要
本发明属于生物工程技术领域：
。将假单胞菌(Pseudomonas)经培养，发酵得到有胆固醇酯酶活性的菌体，通过分离，提取，精制制备胆固醇酯酶。
用此酶制得的酶联试剂测定血清中总胆固醇含量，数据与用胰脏酯酶配制的酶联试剂完全一致。该酶联试剂质量，稳定性优于胰脏酯酶配制的酶联试剂，而且原材料易得到，工艺简单。
文档编号C12N9/18GK86102532SQ86102532
公开日1988年4月20日 申请日期1986年10月10日
发明者杨光礼, 陈璧佩, 张一闵, 秦克亮, 熊振平 申请人:国家医药管理局上海医药工业研究院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan