专利名称：喜树碱的聚合衍生物的制作方法
技术领域：
本发明涉及20-O-[甘氨酰基-氨酰基-甘氨酰基]喜树碱的聚合共轭物。我们的WO-95/10304描述和要求保护通过肽基间隔基与一种聚合物连接的喜树碱共轭物。我们现已发现，以氨酰基-甘氨酰基为间隔基的共轭物作为抗肿瘤剂具有特别的价值，与游离药物相比，被赋予了显著的抗肿瘤活性和降低了的毒性。
确切地说，本发明提供了式(1)的聚合共轭物，由下列组成(i)85至97mol％的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元，由式(3)代表
(ii)3至15mol％的20-O-(N-异丁烯酰基-甘氨酰基-氨酰基)喜树碱单元，由式(4)代表
其中n是2至8，-[O-CPT]代表式(2)的喜树碱残基
该残基在C-20位上连接，其中R1、R2、R3、R4和R5是相同或不同的，它们各自是氢，C1-C12直链或支链烷基，硝基，氨基，(CH2)aNR6R7，其中a是0至4，R6和R7是氢，或者R6或R7之一是氢而R6或R7的另一个是C1-C6烷基，或者NR6R7代表可选被C1-C6直链或支链烷基取代的哌嗪子基或N-烷基-哌嗪子基环，或者代表哌啶子基环，(CH2)aNHCOR8，其中a是如上所定义的，R8是C1-C8直链或支链烷基或如上的基团NR6R7，羟基或O-CO-R8，其中R8是如上所定义的或者代表1-哌啶子基环或1，4’-联哌啶，或者R2与R3共同代表残基O-(CH2)b-O，其中b是1或2，或者R4与R5代表残基(CH2)m，其中m是2至4，或者代表残基CH2-O-CH2或CH2NHCH2，以及(iii)0至12mol％的N-异丁烯酰基-甘氨酸或N-(2-羟基丙基)异丁烯酰基-甘氨酰胺单元，由式(5)代表
其中[Z]代表羟基或式-NH-CH2-CH(OH)-CH3残基。
式(1)的聚合共轭物可以表示为MAG-CPT(s)，也可以表示如下[(3)]x；[(4)]y；[(5)]z，其中(3)、(4)和(5)是如上所定义的各式单元，x是85至97mol％，y是3至15mol％，z是0至12mol％。
本发明化合物的优选实施方案是，其中式(4)中的-[O-CPT]是式(2)的喜树碱残基，选自—喜树碱[2aR1＝R2＝R3＝R4＝R5＝H]；—9-氨基喜树碱[2bR1＝R2＝R3＝R5＝H，R4＝NH2]；—9-硝基喜树碱[2cR1＝R2＝R3＝R5＝H，R4＝NO2]；—7-乙基-10-羟基喜树碱[2dR1＝R2＝R4＝H，R3＝OH，R5＝CH2CH3]；—7-乙基-10-[1，4’-联哌啶基]羰基氧基喜树碱[2eR1＝R2＝R4＝H，R3＝OCO-[1，4’-联哌啶基]，R5＝CH2CH3]；—7-亚甲基二甲氨基-10-羟基喜树碱[2fR1＝R2＝R4＝H，R3＝OH，R5＝CH2N(CH3)2]；和—7-[亚甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]-9，10-亚乙二氧基喜树碱[2gR1＝R4＝H，R2，R3＝O-CH2CH2-O，R5＝亚甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]。
优选地，式(1)的聚合共轭物含有由式(3)代表的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元的比例为90％或以上；更优选为90％。共轭物也可以含有3至10mol％由式(4)代表的单元，更优选为10mol％。优选地，式(1)共轭物不含式(5)残基，即z是0。
式(1)共轭物中式(2)活性喜树碱衍生物的含量可以是2至15％(重量/重量)，更优选为10％(w/w)。
可以通过下面的方法(这里称为途径I)进行本发明化合物的制备，该方法包括使式(6)的20-O-(氨酰基-甘氨酰基)喜树碱衍生物NH2-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](6)其中n和[OCPT]是如上所定义的，与聚合物(B)反应，该聚合物(B)基本上由下列成分组成85至97mol％如上所定义的由式(3)代表的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元，和3至15mol％由式(7)代表的N-异丁烯酰基-甘氨酰基衍生物单元
其中[Y]是一种活性酯的残基、优选为对硝基苯基酯，或羟基；并且可选地用1-氨基-2-丙醇置换残留的活性酯基团。
式(6)衍生物与式(B)聚合物的缩合反应，是在能够保持喜树碱与氨酰基-甘氨酰基间隔基之间的连接性质以及共轭物性质的条件下进行的。
由式(3)代表的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元和式(7)代表的N-异丁烯酰基-甘氨酸单元组成的式(B)聚合物，是通过N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺与N-异丁烯酰基-甘氨酸或N-异丁烯酰基-甘氨酸活性酯衍生物的共聚反应制备的，如《大分子化学》(Makromol.Chem.)178，2159(1977)所述。残基[Y]可以代表苯氧基，在苯基环上被一个或多个吸电子基团取代，例如硝基或卤素。优选地，残基[Y]代表对硝基苯氧基。
(6)与(B)生成本发明的式(1)聚合药物共轭物的反应通常可以在15至30℃的温度下进行，优选在室温下进行15小时；然后可以在室温下，在1-氨基-2-丙醇的存在下，使残留的活性酯基团进行氨解0.5至1小时。共轭物适宜用乙酸乙酯沉淀出来，将其溶于乙醇，用乙酸乙酯再次沉淀。
例如，在室温下，将浓度为15％(重量/体积)的其中[Y]代表一种活性酯残基的聚合物(B)的无水二甲基亚砜溶液用3％(w/v)20-O-(氨酰基-甘氨酰基)喜树碱衍生物(6)处理15小时。然后加入0.1％(w/v)1-氨基-2-丙醇，反应混合物在室温下保持1小时。可以用乙酸乙酯沉淀出聚合药物共轭物MAG-CPTs，收集，用乙酸乙酯洗涤，然后用绝对乙醇溶解，浓度为10％(重量/体积)，再次用乙酸乙酯沉淀，得到本发明的式(1)共轭物。
本发明聚合共轭物中喜树碱的含量通过HPLC或吸光度光谱学分析法测定。
式(1)化合物也可以通过下面的方法(这里称为途径II)制备，该方法包括式(8)的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺
与式(9)的20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(氨酰基)-甘氨酰基]喜树碱衍生物
其中n和[OCPT]是如上所定义的，之间的聚合反应，反应在能够保持喜树碱与甘氨酰基-氨酰基-甘氨酰基间隔基之间的连接性质以及共轭物性质的条件下进行。
(8)与(9)之间的反应通常可以在催化剂(例如2，2’-偶氮二异丁腈)的存在下，在非质子传递溶剂(例如二甲基亚砜)中，在50至70℃下、优选为60℃，进行6至24小时、优选为15小时。共轭物用乙酸乙酯沉淀出来，将其溶于乙醇，再次用乙酸乙酯进行沉淀。
例如，在60℃、氮气下，加热浓度为22％(w/v)的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺(8)与浓度为6％(w/v)的20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(6-氨基己酰)-甘氨酰基]喜树碱衍生物(9)的无水二甲基亚砜溶液，然后加入浓度为1.3％(w/v)的2，2’-偶氮二异丁腈。混合物在搅拌下保持24小时。之后，反应混合物在室温下冷却，共轭物适宜用乙酸乙酯沉淀出来，将其溶于乙醇，再次用乙酸乙酯进行沉淀，得到本发明的式(1)共轭物。
本发明也提供了如上所定义的20-O-酰氨基-甘氨酰基-喜树碱衍生物(6)和它们的盐衍生物。
本发明进一步提供了用于制备20-O-(氨酰基-甘氨酰基)喜树碱衍生物(6)的方法，该方法包括缩合如上所定义的式(2)残基与式(10)的N-保护的氨酰基-甘氨酰基衍生物R9-HN-(CH2)n-CO-Gly-[P](10)其中n是如上所定义的，R9代表一种氨基保护基团，例如Boc、FMOC、三苯基甲硅烷基、二苯基亚甲基或三苯基甲基，[P]是一种活性酯的残基，例如对硝基苯氧基或N-羟基琥珀酰亚胺基，得到由式(11)代表的化合物R9-NH-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](11)其中n、[OCPT]和R9是如上所定义的；以及从所得化合物中除去N-保护基团。
式(10)化合物的制备遵循文献已知的标准合成操作。合适的式(10)N-保护的-氨酰基衍生物包括6-N-(三苯基甲基)己酰基甘氨酰基对硝基苯基酯(10a)、6-N-(叔丁氧羰基)己酰基甘氨酰基对硝基苯基酯(10b)。
例如，可以在4-二甲氨基吡啶的存在下，在无水溶剂例如无水二甲基亚砜中，使喜树碱(2a)与摩尔过量的式(10)N-保护的-氨酰基衍生物反应，例如多达五倍摩尔过量或以上，尤其是2摩尔当量。
反应通常可以进行8至48小时。反应通常是在15至40℃的温度下进行。用一种适当的去保护剂除去临时的氨基保护基团R9，得到式(6a)的20-O-(氨酰基-甘氨酰基)喜树碱。因此，通过酸处理可以实现去保护，例如在10至30℃的温度下，用1.5N含水盐酸的乙酸溶液或90％含水三氟乙酸处理1至6小时；优选在室温下处理2小时。
本发明也提供了如上所定义的20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(氨酰基)-甘氨酰基]喜树碱衍生物(9)和它们的制备方法，该方法包括缩合如上所定义的式(6)喜树碱衍生物与式(7’)的N-异丁烯酰基-甘氨酰基
其中[Y’]是一种离去基团。例如，在当量碱例如三乙胺的存在下，使浓度为25％(w/v)的20-O-[氨酰基-甘氨酰基]喜树碱(6a)的无水二甲基亚砜溶液与13％(w/v)N-(异丁烯酰基-甘氨酰基)对硝基苯基酯((7’)，[Y’]＝对硝基苯酚)在室温下反应15小时。用沉淀法分离最终的衍生物，用色谱法纯化。
式(8)化合物和聚合物(B)是已知的，或者可以按照已知的合成方法制备。
所有式(2)喜树碱衍生物都是已知的，例如参见《医药研究评论》(Medicinal Research Reviews)17卷4期367-425，1997，或者可以利用熟知操作制备。
式(1)的与聚合物结合的共轭物的分子量在5,000至45,000范围内，优选为18,000至35,000。式(1)聚合药物共轭物是水溶性的，与游离喜树碱相比，显示出显著的抗肿瘤活性和降低了的毒性。
抗肿瘤活性通过i.v.途径比照游离药物试验了化合物A1对移植到裸鼠中的人结肠癌(HT29)的作用。发现A1是无毒的，在全部试验剂量下得到＞95％肿瘤抑制率，另外在试验结束(90天)时，异常大量的动物已无肿瘤存在，见表1。还比照游离7-乙基-10-羟基喜树碱(2d)在相同模型中试验了化合物A2的作用，发现其是有活性且无毒的，在40mg/kg的最高试验剂量下，得到98％肿瘤抑制率(表2)。
还通过i.v.途径试验了化合物A1对多种其他人肿瘤模型的作用A2780卵巢癌、MX1乳房癌、A549 NSC肺癌和M14黑素瘤。相对于对应的游离喜树碱(2a)而言，化合物A1具有更高活性，治愈了大量动物。
表3、4和5分别报告了对抗MX1乳房癌、A2780卵巢癌和M14黑素瘤的活性，与游离喜树碱进行了比较。化合物A1对抗这些肿瘤模型的活性非常高，按照q4dx6方案以1 5或20mg/kg反复i.v.给药，观察到对肿瘤生长的总抑制率达到总计7/7和8/8治愈了的小鼠。
还发现化合物A1在20mg/kg(iv q4dx6)下具有对抗NSC肺癌的活性，TI％为94，明显延缓肿瘤生长70天，这是用其他有用的化疗剂所从没有观察到的(表6)。
表1比较A1与(2a)对人结肠癌(HT29)的抗肿瘤活性。iv q4dx6治疗方案。
sc植入肿瘤断片。当可触摸到肿瘤时开始治疗。
在第37天计算TI％(肿瘤抑制％)。
ΔTGD接受治疗动物的肿瘤生长延缓—对照动物的肿瘤生长延缓。表2比较A2与(2d)对人结肠癌(HT29)的抗肿
肿瘤断片。当可触摸到肿瘤时开始治疗。
在第37天计算TI％(肿瘤抑制％)。
ΔTGD接受治疗动物的肿瘤生长延缓—对照动物的肿瘤生长延缓。
表3比较A1与喜树碱(
组的肿瘤生长延缓。无肿瘤肿瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表4比较A1与喜树碱(2a)对抗A2780人卵巢癌的抗肿瘤活性。
sc植入肿瘤断片，当可触摸到肿瘤时开始治疗。剂量以喜树碱等价量表示。TI％最后一次治疗后1周的肿瘤生长抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠数/总小鼠数。ΔTGD治疗组的肿瘤生长延缓。对照组的肿瘤生长延缓。无肿瘤肿瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表5比较A1与喜树碱(2a)对抗M14人黑素瘤的抗肿瘤活性。
sc植入肿瘤断片，当可触摸到肿瘤时开始治疗。剂量以喜树碱等价量表示。TI％最后一次治疗后1周的肿瘤生长抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠数/总小鼠数。ΔTGD治疗组的肿瘤生长延缓。对照组的肿瘤生长延缓。无肿瘤肿瘤植入后第90天治愈了的小鼠。表6比较A1与喜树碱(2a)对抗A549人NSC肺癌的抗肿瘤活性。<
sc植入肿瘤断片，当可触摸到肿瘤时开始治疗。剂量以喜树碱等价量表示。TI％最后一次治疗后1周的肿瘤生长抑制率。Tox因毒性而死亡的小鼠数/总小鼠数。ΔTGD治疗组的肿瘤生长延缓。对照组的肿瘤生长延缓。无肿瘤肿瘤植入后第90天治愈了的小鼠。
因此，本发明化合物可用于白血病和固体肿瘤的治疗，例如结肠、结肠-直肠、胃、卵巢、乳房、前列腺、肺、肾肿瘤以及黑素瘤。因此能够用这样一种方法治疗人，该方法包括将治疗有效量的本发明聚合共轭物对其给药。于是可以改善病人的病情。适用的剂量范围将取决于给药途径和所治疗患者的年龄、体重和病情。通常将式(1)聚合共轭物以胃肠外途径给药，例如肌内、静脉内给药或通过大丸剂注入。合适的剂量范围是1至1000mg喜树碱等价量每m2体表面积，例如10至100mg/m2。
可以将式(1)聚合共轭物与药学上的载体或稀释剂一起配制成药物组合物。通常，将它们配制成胃肠外给药的剂型，例如溶解在注射用水或生理盐水中。
下列实施例阐述本发明。
实施例1
N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯[10an＝5，R9＝Boc，P＝对硝基苯酚]的制备将盐酸甘氨酸乙酯(9.55g，68.4mmol)用二甲基甲酰胺(100ml)溶解，加入三乙胺(9.5ml，68.4mmol)，然后加入遵循我们的E.P.N°0673258中所述相同操作制备的N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基对硝基苯基酯(19g，54mmol)。反应混合物在室温下保持两小时，然后在减压下除去溶剂。将残余物用乙酸乙酯(300ml)溶解，按顺序用冷1N含水盐酸(3×200ml)、水(100ml)、5％碳酸氢钠水溶液(2×200ml)和水(2×200ml)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，然后在减压下除去溶剂。残余物从乙醚中结晶，得到N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基乙酯(15g；Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为乙醚，Rf＝0.3)，将其用乙醇(150ml)悬浮，在搅拌下用1N含水氢氧化钠(48ml，48mmol)处理。一小时后，向反应中加入1N含水盐酸(48ml，48mmol)，在减压下蒸馏。将残余物用无水四氢呋喃(200ml)悬浮，加入对硝基苯酚(6.53g，47mmol)，在0℃下冷却，然后加入1，3-二环己基-碳二亚胺(9.7g，47mmol)在四氢呋喃(100ml)中的溶液。在相同条件下静置反应过夜，然后在烧结玻璃漏斗上过滤。在减压下除去溶剂。残余物从乙醚中结晶，得到17.5g标题化合物(10a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(95/5v/v)，Rf＝0.34。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ1.34(s，9H，t-Bu)；1.0-1.7[m，6H，NH-CH2-(CH2)3-CH2-CO]；2.15(t，J＝7.2Hz，2H，NH-(CH2)4-CH2-CO)；2.85[q，J＝6.5Hz，2H，NH-CH2-(CH2)4-CO]；4.11(d，J＝5.5Hz，2H，CONHCH2COO)；6.70[bs，1H，NH-(CH2)5-CO]；7.40(m，2H，芳香2，6-H)；8.30(m，2H，芳香3，5-H)；8.43(t，J＝5.5Hz，1H，CONHCH2COO)实施例220-O-[(N-叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基]喜树碱[11an＝5，R9＝t-Boc，OCPT＝(2a)]的制备将喜树碱(2a；3.4g，10mmol)用二甲基亚砜(50ml)悬浮，用N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯(10a；6.3g，15mmol)和4-二甲氨基吡啶(2.4g，20mmol)处理。反应混合物保持24小时，然后加入另一部分N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯(6.3g，15mmol)。48小时后，反应混合物用二氯甲烷(500ml)稀释，用0.2N含水盐酸(2×250ml)和水(2×250ml)洗涤。有机相经无水硫酸钠干燥，然后在减压下除去溶剂。将残余物用二氯甲烷(100ml)溶解，加入乙醚(500ml)，在0℃下保持过夜，得到5g固体形式的标题化合物(11a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(95/5v/v)，Rf＝0.44。
实施例320-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱[6an＝5，OCPT＝(2a)]的制备将20-O-[(N-叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基]喜树碱(11a；5g)用90％含水三氟乙酸(40ml)处理一小时，然后在减压下除去溶剂。残余物用乙醚(300ml)研制，过滤出来。将固体溶于甲醇(200ml)，在减压下浓缩至小体积(50ml)，加入乙醚(300ml)。收集沉淀，得到3.9g标题化合物(6a)。
Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80/20/7/3v/v)，Rf＝0.83。
实施例420-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(6-氨基己酰基)-甘氨酰基]喜树碱[9an＝5，OCPT＝(2a)]的制备将20-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱三氟乙酸盐(6a；2.53g，4mmol)用无水二甲基亚砜(10ml)溶解，加入如《大分子化学》178，2159(1977)中所述制备的异丁烯酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯(1.32g，5mmol)和三乙胺(0.56ml，4mmol)。在室温下保持过夜后，将溶液倾入水(100ml)中，收集沉淀，用水(2×100ml)洗涤。固体物质经过硅胶快速色谱，使用二氯甲烷/乙醇混合物(95/5v/v)作为洗脱系统，得到2.2g标题化合物(9a)。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇(9/1v/v)，Rf＝0.62。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ0.90(t，J＝7.3Hz，3H，CH3-18)；1.1-1.6[m，6H，NHCH2-(CH2)3-CH2CO]；2.0-2.2[m，4H，CH2-19+NH-(CH2)4-CH2-CO]；2.95(q，J＝6.3Hz，2H，NH-CH2-(CH2)4CO)3.63(d，J＝5.8Hz，2H，CONH-CH2-CONH)；3.97(dd，J＝17.8，5.9Hz，1H，CONHCHaCHbCOO)；4.15(dd，J＝17.8，5.9Hz，1H，CONHCHaCHbCOO)；5.29(s.2H，CH2-5)；5.33[q，J＝1.6Hz，1H，CH3CH＝C(Ha)(Hb)]；5.48(s，2H，CH2-17)；5.69[m，1H，CH3CH＝C(Ha)(Hb)]；7.15(s，1H，H-14)；7.6-7.9(m，3H，H-10+H-11+NH-(CH2)5CO]；8.0(t，J＝5.8Hz，1H，CO-NH-CH2CONH)；8.15(m，2H，H-9+H-12)；8.32(t，J＝5.9Hz，1H，CO-NH-CHaCHbCOO)；8.69(s，1H，H-7).
实施例57-乙基-10-羟基-20-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱三氟乙酸盐[6bn＝5，OCPT＝(2d)]的制备将7-乙基-10-羟基喜树碱(2d，0.8g，2mmol)、N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯(10a；2.5g，6mmol)和4-二甲氨基吡啶用无水二甲基亚砜(30ml)溶解，在室温下搅拌下保持3天。之后将反应混合物倾入0.1N含水盐酸(500ml)，得到沉淀，收集之，然后将其溶于二氯甲烷(300ml)，用水(2×100ml)洗涤。分离有机相，经无水硫酸钠干燥，在减压下蒸发。残余物用90％含水三氟乙酸(40ml)处理三小时，然后在减压下除去溶剂，残余物经过硅胶快速色谱，使用二氯甲烷/乙酸/甲醇混合物(100/5/20v/v)作为洗脱系统。汇集含有标题化合物的级分，在减压下蒸发，得到1.02g(6b)，为三氟乙酸盐衍生物。Kieselgel板F254(Merck)上TLC，洗脱系统为二氯甲烷/甲醇/乙酸/水(80/20/7/3v/v)，Rf＝0.4。1H-NMR(200MHz，DMSO)δ0.89(t，J＝7.2Hz，3H，CH3-CH2-20)；1.1-1.5(m，9H，NH2-CH2-CH2-CH2-CH2-CH2+CH3-CH2-7)；1.80(s，3H，CH3-COOH)；2.10(m，4H，CH3-CH2-20+CH2-CONH)；2.53(t，6.8Hz，2H，CH2-NH2)；3.06(m，2H，CH3-CH2-7)；3.98，4.13(two-dd，J＝17.6，5.7Hz，2H，CONH-CH2-CO)；5.27(s，2H，CH2-5)；5.46(s，2H，CH2-17)；7.01(s，1H，H-14)；7.40(m，2H，H-9+H-11)；7.99(d，J＝9.8Hz，1H，H-12)；8.33(t，J＝5.7Hz，1H，CONH-CH2-CO)实施例6盐酸7-乙基-10-羟基-20-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱[6bn＝5，OCPT＝(2d)]的制备如实施例5所述，使7-乙基-10-羟基喜树碱(2d，0.8g，2mmol)与N-(叔丁氧羰基)-6-氨基己酰基-甘氨酰基对硝基苯基酯(10a；2.5g，6mmol)和4-二甲氨基吡啶反应。反应混合物用二氯甲烷萃取，得到粗物质，将其溶于1.5N盐酸和乙酸(20ml)混合物中。在室温下搅拌下放置一小时后，溶液蒸馏至小体积，加入乙醚(100ml)。收集沉淀，用乙醚(2×50ml)洗涤，得到1g标题化合物(6h)，为游离氨基衍生物。
实施例7通过途径I制备MAG-喜树碱[A1n＝5，OCPT＝(2a)]将如《大分子化学》178，2159(1977)中所述制备的聚合物前体B(R2＝对硝基苯氧基，2.58g，含有1.16×10-3当量对硝基苯基酯残基)用无水二甲基亚砜(15ml)溶解，加入20-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱三氟乙酸盐(6a；0.63g，1mmol)，然后加入三乙胺(0.14ml，1mmol)。反应混合物在室温下搅拌下保持22小时，然后加入2-丙醇胺(0.05ml)，混合物再搅拌下放置一小时。之后，反应混合物用乙酸乙酯(200ml)进行沉淀，搅拌下放置30分钟。在烧结玻璃漏斗上收集固体物质，用乙酸乙酯(200ml)和乙醚(100ml)洗涤，然后用乙醇(30ml)溶解。在搅拌下，醇溶液用磺酸型湿DOWEX-50(1.2g)处理30分钟，之后，滴加到正己烷(200ml)中。在烧结玻璃漏斗上收集沉淀，用乙醚洗涤，干燥至恒重，得到2.68g标题化合物(A1)。
重均分子量(Mw)19,800。多分散性(Mw/Mn)1.5。碱解后测定喜树碱含量为10％w/w。
实施例8
通过途径I制备MAG-(7-乙基-10-羟基喜树碱)[A2n＝5，OCPT＝(2d)]将如《大分子化学》178，2159(1977)中所述制备的聚合物前体(B)(R2＝对硝基苯氧基，2.58g，含有1.16×10-3当量对硝基苯基酯残基)用无水二甲基亚砜(15ml)溶解，加入7-乙基-10-羟基-20-O-(6-氨基己酰基-甘氨酰基)喜树碱三氟乙酸盐(6b；0.68g，1mmol)，然后加入三乙胺(0.14ml，1mmol)。反应混合物在室温下搅拌下保持22小时，然后加入2-丙醇胺(0.05ml)，混合物在搅拌下再放置一小时。之后，反应混合物用乙酸乙酯(200ml)进行沉淀，搅拌下放置30分钟。在烧结玻璃漏斗上收集固体物质，用乙酸乙酯(200ml)和乙醚(100ml)洗涤，然后用乙醇(30ml)溶解。在搅拌下，醇溶液用磺酸型湿DOWEX-50(1.2g)处理30分钟，之后，滴加到正己烷(200ml)中。在烧结玻璃漏斗上收集沉淀，用乙醚洗涤，干燥至恒重，得到2.68g标题化合物(A2)。
重均分子量(Mw)20,500。多分散性(Mw/Mn)1.87。碱解后测定7-乙基-10-羟基-喜树碱含量为10％w/w。
实施例9通过途径II制备MAG-喜树碱[A1n＝5，OCPT＝(2a)]将20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(6-氨基己酰基)-甘氨酰基]喜树碱(9a；1.26g，2mmol)、如《大分子化学》178，2159(1977)中所述制备的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺(8，4.4g，31mmol)和2，2’-偶氮二异丁腈(0.26g，1.6mmol)用无水二甲基亚砜(20ml)溶解，保持在60℃、氮气下，搅拌24小时。之后，反应混合物在室温下冷却，倾入乙酸乙酯(500ml)中。收集沉淀，用乙醇(50ml)溶解，加入乙酸乙酯(500ml)再次进行沉淀。收集固体，用乙酸乙酯乙醚(2×100ml)洗涤，得到5g标题化合物(A1)。
权利要求
1.聚合共轭物，由下列组成(i)85至97mol％的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元，由式(3)代表
(ii)3至15mol％的20-O-(N-异丁烯酰基-甘氨酰基-氨酰基)-喜树碱单元，由式(4)代表
其中n是2至8，-[O-CPT]代表式(2)的喜树碱残基
该残基在C-20位上连接，其中R1、R2、R3、R4和R5是相同或不同的，它们各自是氢，C1-C12直链或支链烷基，硝基，氨基，(CH2)aNR6R7，其中a是0至4，R6和R7是氢，或者R6或R7之一是氢而R6或R7的另一个是C1-C6烷基，或者NR6R7代表可选被C1-C6直链或支链烷基取代的哌嗪子基或N-烷基-哌嗪子基环，或者代表哌啶子基环，(CH2)aNHCOR8，其中a是如上所定义的，R8是C1-C8直链或支链烷基或如上的基团NR6R7，羟基或O-CO-R8，其中R8是如上所定义的或者代表1-哌啶子基环或1，4’-联哌啶，或者R2与R3共同代表残基O-(CH2)b-O，其中b是1或2，或者R4与R5代表残基(CH2)m，其中m是2至4，或者代表残基CH2-O-CH2或CH2NHCH2，以及(iii)0至12mol％的N-异丁烯酰基-甘氨酸或N-(2-羟基丙基)异丁烯酰基-甘氨酰胺单元，由式(5)代表
其中[Z]代表羟基或式-NH-CH2-CH(OH)-CH3残基。
2.根据权利要求1的聚合共轭物，它含有摩尔比例为90％的由式(3)代表的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元。
3.根据权利要求1的聚合共轭物，它含有10mol％由式(4)代表的单元。
4.根据权利要求1的聚合共轭物，其中不存在式(5)单元。
5.根据权利要求1的聚合共轭物，其中式(4)中的-[O-CPT]是式(2)的喜树碱残基，选自喜树碱、9-氨基喜树碱、9-硝基喜树碱、7-乙基-10-羟基喜树碱、7-乙基-10-[1，4’-联哌啶基]羰基氧基喜树碱、7-亚甲基二甲氨基-10-羟基喜树碱和7-[亚甲基-(4’-甲基哌嗪子基)]-9，10-亚乙二氧基喜树碱。
6.根据权利要求1的聚合共轭物，其中式(2)活性喜树碱衍生物的含量为10％(w/w)。
7.用于制备如权利要求1所定义的聚合共轭物的方法，该方法包括使式(6)的20-O-(氨酰基-甘氨酰基)喜树碱衍生物NH2-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](6)其中n和[O-CPT]是如权利要求1所定义的，与聚合物(B)反应，该聚合物(B)基本上由下列成分组成85至97mol％如权利要求1所定义的由式(3)代表的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺单元，和3至15mol％由式(7)代表的N-异丁烯酰基-甘氨酰基衍生物单元
其中[Y]是一种活性酯的残基或羟基；并且可选地用1-氨基-2-丙醇置换残留的活性酯基团。
8.用于制备如权利要求1所定义的聚合共轭物的方法，该方法包括式(8)的N-(2-羟基丙基)异丁烯酰胺
与式(9)的20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(氨酰基)-甘氨酰基]喜树碱衍生物
其中n和[OCPT]是如权利要求1所定义的，之间的聚合反应，反应在能够保持喜树碱与甘氨酰基-氨酰基-甘氨酰基间隔基之间的连接性质以及共轭物性质的条件下进行。
9.如权利要求7所定义的式(6)的20-O-酰氨基-甘氨酰基-喜树碱衍生物或其盐。
10.用于制备如权利要求7所定义的式(6)化合物的方法，该方法包括缩合如权利要求1所定义的式(2)衍生物与式(10)的N-保护的氨酰基-甘氨酰基衍生物R9-HN-(CH2)n-CO-Gly-[P] (10)其中n是如权利要求1所定义的，R9代表一种氨基保护基团，[P]是一种活性酯的残基，得到由式(11)代表的化合物R9-NH-(CH2)n-CO-Gly-[OCPT](11)其中n和R9是如上所定义的，[OCPT]是如权利要求1所定义的；以及从所得化合物中除去N-保护基团。
11.如权利要求8所定义的式(9)的20-O-[异丁烯酰基-甘氨酰基-(氨酰基)-甘氨酰基]喜树碱衍生物或其盐。
12.用于制备如权利要求11所定义的式(9)衍生物的方法，该方法包括缩合如权利要求7所定义的式(6)喜树碱衍生物与式(7’)的N-异丁烯酰基-甘氨酰基
其中[Y’]是一种离去基团。
13.药物组合物，包含一种药学上可接受的稀释剂或载体，以及如权利要求1至6任意一项所定义的聚合共轭物或如权利要求9和11所定义的式(6)或(9)化合物作为活性成分。
全文摘要
喜树碱的水溶性聚合共轭物包含通过式－Gly－(CH
文档编号C08F220/60GK1272796SQ98809774
公开日2000年11月8日 申请日期1998年9月22日 优先权日1997年10月3日
发明者F·安格露西, F·奥基, G·法琴, V·凯奥法, M·加麦, A·索拉托 申请人:法玛西雅厄普约翰公司