专利名称：新的糖胺聚糖和使用同样物质作为活性成分的药用组合物的制作方法
技术领域：
本发明涉及具有硫酸酯基团的糖胺聚糖，其中基本上除去了结合到组成该糖胺聚糖的葡糖胺残基6-位上的所有的硫酸酯基团并且其它硫酸酯基团的除去减至最低，涉及包含作为活性成分的糖胺聚糖的药用制剂，并且涉及产生糖胺聚糖的方法。
背景技术：
肝素为具有由糖醛酸(艾杜糖醛酸(IdoA)或葡糖醛酸(GlcA))残基和葡糖胺(GlcN)残基组成的二糖单位的重复结构作为主链的糖胺聚糖之一。肝素为其中糖醛酸残基的2-位羟基基团和葡糖胺残基的6-位羟基基团和2-位氨基基团的每一个经历了一定程度硫酸化作用的糖胺聚糖。因为肝素具有抗凝血酶Ⅲ(在下文也称作“ATⅢ”)结合位点(FEBS Lett.(1980)117，203-206)并与ATⅢ结合来抑制凝血酶作用，由此产生抗凝血作用，肝素长期以来广泛用作药物例如用于改善透析治疗结果等的抗凝血剂。最近，已发现肝素与多种生理活性因子相互作用。例如，肝素与脂蛋白脂肪酶相互作用(J.Biol.Chem.(1981)256，12893-12898)，并且对碱性成纤维细胞生长因子具有亲和性(J.Cell.Biol.(1990)111，1651-1659)。
在这样的情况下，注意力已经集中到在肝素中参与在肝素和特异的细胞生长因子或细胞因子之间的结合的结构域的结构上。此外，由于ATⅢ结合位点的存在并由此增加生理活性因子的相互作用，正在进行涉及由肝素的脱硫酸化作用为代表的、目的为降低抗凝作用的化学修饰的重要研究(J.Carbohydr.Chem.(1993)12，507-521；Carbohydr．Res.(1989)193，165-172；Carbohydr．Res.(1976)46，87-95；WO95/30424等)。
关于以上提到的肝素的脱硫酸化作用，近年来焦点在除去在肝素中结合到葡糖胺残基的6-位羟基基团上的硫酸酯基团(6-脱硫酸化作用)。作为脱硫酸化方法，能够提及的是使用溶剂分解的方法(WO95/30424)和使用硅烷基化试剂的方法(WO96/01278)。
用前一个方法，伴随除去在肝素分子中结合到葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团(6-O-硫酸酯基团)，结合在糖醛酸残基2-位羟基基团上的硫酸酯基团(2-O-硫酸酯基团)和结合在葡糖胺残基2-位氨基基团上的硫酸酯基团(N-硫酸酯基团)也被除去。因此，在使用前者方法以基本上除去所有6-O-硫酸酯基团的过程中，几乎所有的葡糖胺残基的N-硫酸酯基团和糖醛酸残基的2-O-硫酸酯基团也会失去。当如此修饰的肝素的葡糖胺残基2-位的氨基基团能够再次硫酸化时，糖醛酸残基的2-位再次硫酸化作用而不使葡糖胺残基的6-位硫酸化是困难的。
后一种方法优于前一种方法之处在于它使葡糖胺残基的6-O-硫酸酯基团更特异地除去。然而，用后一种方法如此得到的修饰的肝素，如通过酶二糖分析方法测定的有效二糖收率是低的，这意味着用这个方法仍然存在着问题，这在于这个方法中该结构鉴定可不足以应用于药用用途。此外，尽管修饰的肝素的抗凝血作用大大降低，它是存在的，而不可能得到其中该抗凝血活性已经完全消除的修饰的肝素。
由于肝素或其片段对多种生理活性物质具有亲和性并且该亲和性与这类物质的功能密切相关，已进行深入研究用来寻找和开发利用肝素或修饰的肝素的药物。然而，尽管做了这样的努力，它们在药物应用时仍然仅有效地用作血液抗凝血药物。
即集中在使用肝素应用在除抗凝血药物外的用途中，重要地是基本上消除其抗凝血作用和出血作用，并且对于使用其作为药用物质而言，必须使其“作为物质进行结构鉴定”成为可能。对于这些问题而言，必须进一步改进，并且要求解决这些遗留问题并使用肝素对生理活性物质的亲和性来提供安全和有用的药物。
本发明的公开作为针对解决以上问题的刻苦研究的结果，通过使用特殊的方法以影响糖胺聚糖例如具有硫酸酯基团的肝素的脱硫酸化作用，本发明人成功地制备了新的糖胺聚糖，其中基本上消除了其抗凝血作用和出血活性，而它对生物体的生物有利作用例如其对于生理活性物质的亲和性得到维持，并且不可鉴定的结构明显地降低到“该物质的结构鉴定”能够容易地完成的程度，这对于药物应用来说是重要的。因此，已经完成了本发明。
特别地，业已证实通过在硅烷基化试剂N-甲基-N-(三甲基甲硅烷基)三氟乙酰胺(在下文也称作“MTSTFA”)存在下，于吡啶中，将具有硫酸酯基团的糖胺聚糖在100℃或更高温度下加热处理来基本上除去葡糖胺残基上所有的6-O-硫酸酯基团，然后从反应混合物中蒸发吡啶，加入水并减压下浓缩，得到的糖胺聚糖在促进皮肤伤口愈合方面和治疗糖尿病皮肤溃疡方面是高度有效的，并且它具有果糖-1，6-二磷酸醛缩酶抑制活性，并且其抗凝血作用和出血活性已经消失。
另外，经过证实通过使用利用糖胺聚糖酶的酶二糖分析方法，能够容易地确定通过以上精确方法制备的糖胺聚糖结构，因为糖胺聚糖酶对糖胺聚糖具有良好的消化能力。这是与以前在鉴定修饰的肝素结构上的困难相比较的，该肝素已经通过经历多种类型的化学处理来修饰。使用由此作为药物结构能够进行鉴定的糖胺聚糖使得有可能提供高度安全的和有用的药物。
本发明人进一步发现糖胺聚糖对1，6-二磷酸果糖醛缩酶具有高度亲和性，该酶为糖酵解途径的关键酶，并且能够用作该酶的强力抑制剂。因此，提供新的1，6-二磷酸果糖醛缩酶抑制剂已经成为可能。
即本发明提供了如下内容。
1．具有包含了糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链和具有硫酸酯基团的糖胺聚糖(其中如同通过化学二糖分析方法测定的那样，基本上未检测到结合到主链的葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团，其中该糖胺聚糖用亚硝酸分解)与对硝基苯肼反应并通过高效液相色谱法分析，并且在2-位具有硫酸酯基团的糖醛酸残基的％(mol)相对于总糖醛酸残基不低于45％，该％(mol)从通过酶二糖分析方法得到的二糖组成来计算得到，在该方法中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通过高效液相色谱法分析。
2．具有包含了糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链和具有硫酸酯基团的糖胺聚糖(其中通过酶二糖分析得到糖胺聚糖的二糖组成，其中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通过高效液相色谱法分析)，总的2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基(enopyranosyl)糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于10％(mol)，并且2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于1.5％(mol)，并且有效的二糖收率不少于60％。
3．本条目2的糖胺聚糖，其中通过酶二糖分析方法得到二糖组成，总的2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不少于45％(mol)。
4．条目1至3中任何一个条目的糖胺聚糖(其中在该糖胺聚糖的13C-NMR谱分析中，使用糖胺聚糖在氧化氘中的5％溶液并且3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠作为标准物)在66.5至67.5ppm基本上未检测到峰并且在大约100ppm至102ppm的信号强度高于大约98.3ppm的信号强度。
5．包括如同在条目1至4中任何一个条目中定义的糖胺聚糖(在下文也称作“本发明的糖胺聚糖”)的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶抑制剂作为活性成分。
6．药用组合物包括作为活性成分的本发明的糖胺聚糖。
7．条目6的药用组合物，其为治疗组织损伤和溃疡的药物。
8．条目6的药用组合物，其为治疗皮肤疾病的药物。
9．条目8的药用组合物，其中该治疗皮肤疾病的药物为促进皮肤伤口愈合的药物或治疗皮肤溃疡的药物。
10．产生本发明糖胺聚糖的方法，该方法包括以下步骤(a)在MTSTFA存在下，在不低于100℃的温度下，在吡啶中加热具有包括糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的比啶可溶的糖胺聚糖的盐，在加热足够长的时间以至于如同通过化学二糖分析方法测定的那样，基本上不应该检测到结合到葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团，在该方法中该糖胺聚糖用亚硝酸分解，其与对硝基苯肼反应并通过高效液相色谱法分析。
(b)从在步骤(a)中得到的该反应混合物中蒸发吡啶，并且(c)把水加入到在步骤(b)中得到的该反应混合物中，然后减压下于常规温度下放置该混合物。
本发明实施方案现在将做如下描述。
在本发明中，“具有包含糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖”为具有糖醛酸残基和葡糖胺残基重复结构的肝素结构的糖胺聚糖中具有硫酸酯基团的糖胺聚糖，并且包括肝素、硫酸乙酰肝素和硫酸化透明质酸。“葡糖胺残基”也包括那些具有乙酰化氨基基团和硫酸化氨基基团的物质。1．本发明的糖胺聚糖按照本发明的一个方面，提供了具有包括糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖，其中如同按照化学二糖分析方法测量，基本上未检测到结合到主链葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团，在该方法中该糖胺聚糖用亚硝酸分解，与对硝基苯肼(也称作PNP-肼)反应并通过高效液相色谱法(在下文也缩写为“HPLC”)分析，并且在2-位具有硫酸酯基团的糖醛酸残基的％(mol)相对于总糖醛酸残基不少于45％，该％(mol)由通过酶二糖分析方法得到的二糖组成计算得到，其中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并且通过高效液相色谱法分析。更优选地该糖胺聚糖如下描述的那样具有不少于60％的有效二糖收率。
如同参照后面试验方法1描述的那样，以上提到的化学二糖分析方法指得是包括用亚硝酸分解所测量的物料、使产物与对硝基苯肼反应并且通过HPLC分析该产物的方法。
经检测在葡糖胺残基6-位羟基基团上基本上不结合有硫酸酯基团的描述通常意味着前面提到的化学二糖分析方法不可能检测到通过以上经常规HPLC化学处理而产生的ISMS(IdoA(2S)α1→4AnMan(6S)-PNP，这里4AnMan(6S)-PNP表示AnMan(6S)-CH=N-NH-PNP，并且AnMan(6S)表示2，5-脱水甘露糖-6-硫酸酯)的峰。详细地说，其能够通过作为一个指数来测量，该指数为本发明不具有6-硫酸酯基团的所有葡糖胺残基的数目相对于总葡糖胺残基数目的百分比，其由ISM(IdoA(2S)α1→4AnMan-PNP，这里AnMan-PNP表示AnMan-CH=N-NH-PNP，并且AnMan表示2，5-脱水甘露糖)的峰面积和ISMS的峰面积来计算。例如，不少于95％的可认为是意味着“基本上未检测到”并且100％是最优选的。对于降低抗凝血作用而言，优选地是在本发明糖胺聚糖结构中基本上不具有带有6-O-硫酸酯基团的葡糖胺残基。为了方便起见，在下文中这些葡糖胺残基6-位的脱硫酸作用的比例将称作“6-脱硫酸化比例”。
该6-脱硫酸比例也能从如同在实施例中描述的核磁共振谱所得到的信号强度来计算。以这样方式得到的结果基本上与前面提到的化学二糖分析方法得到的“6-脱硫酸化比例”相符。
在本发明糖胺聚糖的肝素结构中，结合到组分糖残基上的硫酸酯基团的位置和量能够由通过酶二糖分析方法检测不饱和二糖的组成(二糖组成)来计算，其中该糖胺聚糖以糖胺聚糖酶来消化并经过高效液相色谱法(使用糖胺聚糖酶的消化作用与HPLC的联合方法的酶二糖分析方法)分析。
“在2-位具有硫酸酯基团的糖醛酸残基相对于总糖醛酸残基的％(mol)”意指取作通过以下提到的通式表达的不饱和二糖100％总量[2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-OS”)、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-NS”)、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDihS-6S”)、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-US”)、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-di(6，N)S”)、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-di(U，N)S”)、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-di(U，6)S”)和2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖(在下文中称作“ΔDiHS-tri(U，6，N)S”)的总(摩尔数)]，其为前面提到的每一个在糖醛酸残基2-位具有硫酸酯基团的不饱和二糖的比例(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的总(摩尔数))如同按照使用以糖胺聚糖酶消化作用和HPLC的联合的酶二糖分析方法所测定那样的百分数。为了维持本发明糖胺聚糖治疗皮肤疾病的高度活性，该值通常不少于45％，优选不少于50％并且更优选不少于60％。使用酶消化作用和HPLC联合的二糖分析方法指的是在后面试验方法2中描述的酶消化作用和HPLC联合的酶二糖分析方法。 表1 通过以上缩写表示的这些结构也能以如下显示的那样来表达ΔDiHS-OSΔHexAl→4GlcNAc；ΔDiHS-NSΔHexAl-4GlcNS；ΔDiHS-6SΔHexAl→4GlcNAc(6S)；ΔDiHS-USΔHexA(2S)1→4GlcNAc；ΔDiHS-di(6，N)SΔHexAl→4GlcNS(6S)；ΔDiHS-di(U，N)SΔHexA(2S)1→4GlcNS；ΔDiHS-di(U，6)SΔHexA(2S)1→4GlcNAc(6S)；ΔDiHS-tri(U，6，N)SΔHexA(2S)1→4GlcNS(6S)。
在以上式中，ΔHexA代表不饱和己糖醛酸、GlcNAc代表N-乙酰葡糖胺，GlcNS代表N-硫酸化葡糖胺并且硫酸酯基团的结合位置在括号中显示。
通过酶二糖分析方法得到的数值反映了酶消化之前糖胺聚糖的硫酸酯基团的位置和数目。对于更准确的反映来说，该酶消化必须为更一致的和尽可能高的消化能力(酶消化能力(试验方法4如下描述))，通常不低于60％，优选不低于70％并且更优选不低于80％。
另外，借助酶二糖分析方法计算的糖胺聚糖的有效二糖收率显示了能够通过糖胺聚糖作为分析对象的方法鉴定的二糖单位的比例。作为结构鉴定容易性的指数的有效二糖收率通常不少于60％，优选不少于70％并且更优选地不少于80％。
“有效二糖收率”是表达为通过可鉴定的不饱和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的总峰面积与在上述二糖分析方法中使用HPLC检测到的不饱和二糖的总峰面积比值乘以酶消化能力的百分数的值。
在本发明的糖胺聚糖的情况下，含有在6-位具有硫酸酯基团的葡糖胺残基的不饱和二糖(ΔDiHS-6S、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的总和)不多于10％(mol)，优选不多于5％(mol)，并且ΔDiHS-tri(U，6，N)S不多于1.5％(mol)，优选不多于1％(mol)，并且更优选如通过酶二糖分析方法来分析的那样是不可测定的(在二糖组成中)。
当通过酶二糖分析方法分析时，通过使用以下提及的作为参照物的标准肝素计算的本发明的糖胺聚糖的6-脱硫酸比例正常不少于90％。
已知肝素显示与(亲和于)多种细胞因子(例如，成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、血管内皮细胞生长因子、转化生长因子、上皮生长因子、midkine、白细胞介素8、玻连蛋白、肝素结合脑细胞促分裂因子和肝素结合轴突生长晕促进因子等)存在相互作用，并且已知结合到该肝素结构上的硫酸酯基团在这样的相互作用中起主要作用。因为本发明的糖胺聚糖基本上没有葡糖胺残基的6-O-硫酸酯基团，尽管抗凝血作用、对在该作用中起主要作用的ATⅢ的亲和性和出血作用丧失了，肝素与上述细胞因子的相互作用(亲和性)则维持着。因此，在本发明糖胺聚糖中，为维持亲和性，在如同通过使用上述酶二糖分析方法得到的不饱和二糖的组成(二糖组成)中，具有结合在2-位氨基基团上的硫酸酯基团的葡糖胺残基的不饱和二糖(ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的总和)的％(mol)优选不少于65％(mol)，更优选不少于75％(mol)。并且如上所述，相对于总糖醛酸残基的具有2-O-硫酸酯基团的糖醛酸残基的％(mol)正常地不少于45％，优选地不少于50％，最优选地不少于60％。
此外，为了维持对细胞因子的亲和性，当3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠(在下文中缩写为“TSP”)作为使用氧化氘溶液(在以下实施例3中描述)的13C-核磁共振(NMR)谱的结构分析中用作参照物(0ppm)时，基本上应该在66.5至67.5ppm观察不到峰而在70.0至71.0ppm观察到峰是优选的，并且进一步优选的是当把大约98.3ppm、100ppm和102ppm的信号强度进行比较时，约100ppm和102ppm两处的信号强度应高于大约98.3ppm的信号强度。在本发明糖胺聚糖的最优选实施方案之一中，除了前面提到的特性以外，在96.5至97.0ppm的区域观察不到连续的峰。
本发明糖胺聚糖优选地对于促进前面提到的细胞因子的活性、特别是碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)(细胞增殖促进活性)的活性具有高度活性，并且如同通过用于测量促进bFGF活性的活性的方法测量的那样(其中通过使用NaClO3使培养的细胞经受细胞增殖抑制作用来测量促进bFGF活性的活性)，其优选具有相应于标准肝素或市售肝素的促进bFGF活性的活性不低于80％，更优选不低于90％(参见实施例中试验方法9的用于促进bFGF活性的活性的测量1)。此外，如同通过用于测量促进bFGF活性的活性的方法测定的那样(在该方法中不使用NaClO3培养细胞来测量促进bFGF活性的活性)，本发明的糖胺聚糖对于促进bFGF活性的活性也优选相应于不低于70％，更优选不低于80％，最优选不低于90％的标准品肝素或市售肝素的促进bFGF活性的活性(参见实施例中试验方法9，用于促进bFGF活性的活性的测量2)。
因为涉及到抗凝血活性和出血活性的肝素主链中的高硫酸化区域(硫酸化的簇)通过前面提到的二糖分析方法来检测为ΔDiHS-tri(U，6，N)S，在本发明糖胺聚糖中，ΔDiHS-tri(U，6，N)S不多于1.5％(mol)，优选不多于1％(mol)，最优选如同通过前面提到的酶二糖分析方法测定的那样在不饱和二糖组成(二糖组成)中检测不到ΔDiHS-tri(U，6，N)S。本发明这样的糖胺聚糖基本上丧失了抗凝血活性和出血活性。
如同通过使用凝胶过滤法测定的那样，本发明糖胺聚糖优选地具有3，000-30，000，更优选地具有5，000-20，000，最优选地具有7．000-16，000的平均分子量，但是其并不特别限制。
如上提到的那样，本发明糖胺聚糖基本上丧失了抗凝血活性和出血活性。即当在反应混合物中以最终30μg/ml的浓度加入本发明的糖胺聚糖，以APTT和TT的测量方法(试验方法5和6)来测量该活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(在下文也缩写为“APTT”)和组织促凝血酶原激酶时间(在下文也缩写为“TT”)时，APTT不超过50秒，并且以加入最终100μg/ml的浓度，TT不超过50秒。
此外，在使用牛ATⅢ测量抗凝血酶活性中(例如，在以下提到的试验方法(试验方法7)中描述在[抗凝血酶活性测量方法]中的方法)，提供50％抑制作用的浓度(IC50)优选地不少于50μg/ml，更优选地不少于100μg/ml。
由于本发明糖胺聚糖基本上丧失了如上提到的抗凝血活性和出血活性，并且具有优良的如在以下实施例中证实的促进伤口愈合活性和治疗皮肤溃疡活性，其可用作药物的活性成分。
当本发明糖胺聚糖也能以游离形式使用时，其优选地作为药学上可接受的盐来得到。这样的盐的实例包括例如那些选自碱金属盐如钠盐和钾盐、碱土金属盐如镁盐和钙盐、铵盐、胺盐如三丁基胺盐等药学上可接受的盐，但是碱金属盐尤其是钠盐为优选的。2．本发明的抑制剂本发明抑制剂为1，6-二磷酸果糖醛缩酶抑制剂，其特征在于包含作为活性成分的本发明糖胺聚糖。
以上所述的能够用作本发明抑制剂的活性成分的本发明糖胺聚糖对于称作控制糖酵解酶的反应速率的酶的1，6-二磷酸果糖醛缩酶(在下文缩写为“FPA”)显示高度亲和性并且具有抑制该酶反应的活性。因此，本发明糖胺聚糖能够抑制整个糖酵解途径，并且因而其能够用作糖酵解抑制剂尤其是FPA抑制剂的活性成分。
如同在以下提到的实施例中证实的那样，发现任何(1)本发明的糖胺聚糖、(2)相应于仅通过酯键结合于肝素糖醛酸残基2-位羟基基团上的硫酸酯基团从肝素上被除去的肝素的衍生物(2ODSH)和(3)相应于仅通过酰胺键结合于肝素的葡糖胺残基2-位氨基基团上的硫酸酯基团被从肝素上除去的肝素的衍生物(NDSH)显示对FPA的亲和性并且抑制FPA的活性。
尽管这些结果表明了肝素对抑制FPA显示了最高活性，也发现在(1)、(2)和(3)的物质中本发明糖胺聚糖显示最高的FPA抑制活性，(2)的衍生物显示第二高的抑制活性并且(3)的衍生物显示最弱的抑制活性。因此，这些实验结果表明在该肝素的结构中葡糖胺残基2-位氨基基团具有硫酸酯基团是最重要的，在该肝素的结构中糖醛酸残基2-位羟基基团结合有硫酸酯基团对FPA活性是第二重要的，最少涉及的硫酸酯基团是通过酯键结合于葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团。在这些发现的基础上完成了本发明，并且本发明抑制剂为含有作为活性成分的本发明糖胺聚糖的FPA抑制剂，该物质具有与肝素活性比较的、高的FPA抑制活性并且降低了肝素所显示的副作用如出血活性。
用作FPA抑制剂的活性成分的本发明糖胺聚糖优选地含有相对于组成糖胺聚糖主链的葡糖胺残基的总量不少于40％(mol)的2-位氨基基团硫酸化的葡糖胺残基。更详细地讲，在前面说到的酶二糖分析方法(二糖组成)中，含有具有2-位硫酸酯基团的葡糖胺残基的不饱和二糖(ΔDiHS-NS、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的％(mol)优选不少于40％(mol)，更优选不少于50％(mol)。另外，用作FPA抑制剂的活性成分的本发明的糖胺聚糖优选地含有相对于组成糖胺聚糖主链的糖醛酸残基的总量不少于45％(mol)的2-位羟基基团硫酸化的糖醛酸残基。更详细地讲，在前面说到的酶二糖分析方法(二糖组成)中，具有2-位硫酸酯基团的糖醛酸残基(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，6)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的％(mol)一般不少于45％(mol)，优选不少于50％(mol)。
如同在下列描述的实施例15中提到的条件下测定的那样，用作FPA抑制剂的活性成分的本发明糖胺聚糖对牛脑1，6-二磷酸果糖醛缩酶的同工酶A4和C4优选地分别具有少于0.4μg/ml和少于2.5μg/ml的Ki值。
本发明抑制剂能够用作治疗和预防伴随糖酵解途径代谢增进的疾病或失调的药物。这样的伴随糖酵解途径代谢增进的疾病或失调的实例包括例如疟原虫的感染等，并且含有本发明抑制剂的药物可认为对这样的疾病或失调呈现治疗或预防作用。3．本发明的药用组合物本发明的药用组合物的特征在于含有作为活性成分的本发明的糖胺聚糖。
因为上述本发明的糖胺聚糖基本上没有被当成副作用问题的抗凝血活性和出血活性，其能够作为药物给予生物体。
在本发明糖胺聚糖具有的生理活性中，特别显著地是促进组织损伤或溃疡愈合的活性，并且本发明的糖胺聚糖能够用作治疗(包括预防药物)创伤和组织溃疡的药物。以上所述的组织包括上皮组织例如皮肤、角膜和包括鼻腔粘膜和口腔粘膜的粘膜、缔结组织例如软骨和骨头和神经组织以及消化道和血管组织等。该创伤包括发生在上述组织中的疾病(例如通过外部力量引起的损伤、烧伤等)。在它们当中，本发明药用组合物的优选的实施方案为特别地促进伤口愈合或在皮肤上产生的溃疡的愈合的药物(治疗皮肤疾病的药物)，并且本发明药用组合物最优选的实施方案为促进皮肤伤口愈合的药物和治疗皮肤溃疡的药物。除了一般的溃疡以外，上述皮肤溃疡包括例如难治的溃疡例如下肢溃疡和褥疮性溃疡(也包括糖尿病性皮肤溃疡)。
因为本发明糖胺聚糖对于bFGF具有高度的亲和性并且如同在以下描述的实施例中证实的那样对于促进bFGF活性具有高度活性，除了以上提到的实施方案以外，本发明的药用组合物也能用在打算应用于被认为是涉及bFGF的紊乱和疾病的愈合的实施方案中，并且与含有已知的修饰肝素的药物相比较，其呈现更优良的作用。这样的紊乱和疾病的实例包括例如牙周疾病、心瓣再狭窄、癌症、涉及新血管形成的疾病(增生的视网膜炎、类风湿关节炎、牛皮癣等)、局部再灌注紊乱、炎症、多种循环器官疾病等。
此外，如同对于本发明抑制剂解释的那样，因为本发明糖胺聚糖具有FPA抑制活性，其能够用作治疗和预防伴随糖酵解途径代谢增进的疾病的药物。
因此，通过给予需要治疗皮肤疾病或者治疗或预防伴随糖酵解途径代谢增进的疾病的受治疗者有效量的本发明糖胺聚糖能够治疗皮肤疾病和治疗或预防伴随糖酵解途径代谢增进的疾病。
当本发明的药用组合物给予生物体时，依所考虑疾病的性质和严重性而定能够适宜地选择所使用的剂型和给药途径。例如，本发明糖胺聚糖能够作为其本身或以含有其它药学上可接受的载体、赋形剂、稀释剂等药用组合物的形式(例如外用制剂如溶液剂、混悬剂、软膏剂、硬膏剂、洗剂、糊剂、搽剂和贴片以及注射剂、栓剂、片剂、胶囊剂等)经过非肠道或口服安全地给予温血动物(例如人、小鼠、大鼠、仓鼠、兔、狗、猫、马等)。
当本发明糖胺聚糖用作治疗皮肤疾病的药物时，非肠道给药为特别优选的，并且适宜于这样给药的剂型包括上述外部制剂。能够通过(但不局限于)滴入、敷用、贴膏药等给药。
本发明糖胺聚糖在组合物中的配方量和给药量应依制剂的给药方案、剂型、患者的特殊情况、患者的体重等而定来单独决定，并且它们不被特别限制。然而，本发明糖胺聚糖的给药量通常为例如一天大约100μg/kg至大约100mg/kg。至于该制剂的给药次数，可为一天一次或者一天2-4次或更多。
待加入到本发明药用组合物中的本发明糖胺聚糖的量依该组合物的剂型而变化。例如其可为每单位组合物大约10μg至50mg，但是其应适宜地依剂型、患者的特殊情况等来控制。
已知通过小鼠(雄性和雌性)的急性毒性试验测量的正常肝素的50％致死剂量(LD50)对于口服给药不少于5，000mg/kg，对于皮下或腹膜内给药不少于2，500mg/kg，或者对于静脉注射给药不少于1，000mg/kg，并且目前其一般用作药物(抗凝血药)。因此，其安全性已经建立。
另一方面，当如同在以下实施例中指出的那样给予正常大鼠和患有遗传性糖尿病的小鼠时，用于本发明药用组合物的本发明糖胺聚糖显示无死亡。此外，本发明糖胺聚糖为在肝素基础上生成的物质，并且与肝素相比较显示极低的抗凝血活性和出血活性或基本上已经丧失这些活性。因此，能够说含有本发明糖胺聚糖的本发明药用组合物对于温血动物是高度安全的。4．本发明的生产方法本发明的生产方法为用于生产上述本发明糖胺聚糖的方法，并且包括如下步骤(a)在MTSTFA存在下，在不低于100℃的温度下，于吡啶中将具有包括糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖的吡啶可溶的盐加热足够长的时间以至于如同通过酶二糖分析方法测定的那样应该基本上检测不到结合于葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团，(b)从在步骤(a)中得到的该反应混合物中蒸发吡啶，并且(c)把水加入到在步骤(b)中得到的该反应混合物中，然后在减压下、于常规温度下放置该混合物。
本发明生产方法的实例解释如下。(a)在MTSTFA存在下，于不少于100℃的温度下，加热在吡啶中的肝素的吡啶可溶的盐的步骤在本发明生产方法中使用的“具有包括糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖的吡啶可溶的盐”优选为肝素的吡啶鎓盐，而不特别限制只要它为肝素的吡啶可溶的盐。这样的肝素的吡啶鎓盐能够通过例如使肝素钠盐经阳离子交换柱(如以Amberlite IR-120B(H+形式)树脂填充的柱(由ORGANO CORP生产))得到，其经蒸馏水平衡以转化为游离形式，并且将过量的吡啶加入到生成的酸部份中以调节其pH值到5至7，优选为5.5至6.5并且使该部份冷冻干燥。也可使用市售肝素的吡啶鎓盐。
在MTSTFA存在下，于吡啶中，使上述肝素的吡啶可溶的盐反应。用于该反应的MTSTFA正常地以肝素的吡啶可溶的盐的6至12倍的体积(w/w)，优选地为8至11倍的体积(w/w)的量加入。用于该反应的吡啶的量优选为以肝素的吡啶可溶的盐的5至150倍的体积(v/w)，更优选为10至120倍的体积(v/w)，最优选为15至110倍体积(v/w)，但是并不局限于这些量。
对于上述反应的温度优选为100-115℃，最优选地为108-112℃。当维持上述优选温度范围内的温度时，足够长的以至于通过以化学二糖分析方法测定到在葡糖胺残基6-位羟基基团上基本上无结合的硫酸酯基团的时间优选为90至150分钟，最优选为100至130分钟。此外，例如通过维持上述温度10-20分钟、25-35分钟或50-70分钟，其也可能分别制备具有大约50％、大约70％或大约90％的6-脱硫酸比例的糖胺聚糖。即在本发明生产方法中，可能通过如上描述的反应时间来精确控制6-脱硫酸化比例。
在完成上述反应之后，该反应优选地通过冷却该反应混合物来停止。例如这样的冷却通过室温下静置含有该反应混合物的容器或者以流动的水或冰来冷却。当并不特别限制用于冷却的方法时，其优选地通过冰冷却来达到目的。(b)蒸发吡啶的步骤从该冷却的反应混合物中蒸发吡啶。当通过任何已知的用于蒸发有机溶剂的方法蒸发吡啶时，其优选地通过减压下使用于25至37℃下的蒸发器来进行，因为其易于操作。通过蒸发使该反应混合物浓缩。至于该反应混合物的浓缩程度，其优选为该反应混合物浓度的7至25倍浓度，最优选为8至20倍浓度。术语“减压”通常意指10-2至10-4托的压力。(c)加入水并且在常温下于减压下放置的步骤向通过蒸发吡啶浓缩后的该反应混合物中加入水以分解结合到羟基基团上的MTSTFA和游离的MTSTFA。所加入的水量优选为相对于浓缩后的反应混合物的1.5至3倍量，最优选为1.8至2.5倍量。当如上描述的那样将水加入到该浓缩的反应混合物中时，在反应混合物中产生白色混浊。为了消除这样的白色混浊，加入水的浓缩反应混合物在常温下、减压下放置。通过使用蒸发器可实现常温下的减压，并且该减压优选地维持在25至37℃下直到白色混浊消失。该减压正常维持5至10分钟。像上述提到的减压一样，该减压优选为10-2至10-4托的压力，并且其优选为该浓缩的反应混合物由于减压而沸腾的压力。(d)其它步骤在前面提到的步骤(c)的处理之后，优选地从该反应混合物中除去MTSTFA的分解产物和有机溶剂。为此目的，能够使用已知方法，其包括使用透析、乙醇沉淀、阳离子交换柱等的方法。
当使用透析时，仅流动的水或者流动水和蒸馏水的组合能够用于透析的外部液体。当向流动的水中透析时，该透析正常地进行至少24小时，优选至少40小时，最优选48小时。当通过使用流动水和蒸馏水的组合进行透析时，该反应混合物能够向流动的水中透析，然后向蒸馏水中透析。在实施如上描述的向流动的水中透析之后，向蒸馏水中的透析正常地进行至少1小时，优选1.5至2.5小时。
从其中除去MTSTFA的分解产物和有机溶剂的反应混合物中，通过使糖胺聚糖沉淀的一般方法，能够以其盐的形式得到本发明的糖胺聚糖。
作为得到以盐形式的本发明糖胺聚糖的方法，能够提到例如包括通过使用用蒸馏水平衡的阳离子交换柱(例如，Amberlite IR-120B(H+形式)树脂填充柱(由ORGANO CORP.生产))将从所述透析得到的内部溶液分级分离以收集酸性部份，通过加入碱性水溶液(例如，碱金属氢氧化物或碱土金属氢氧化物的水溶液如优选地以浓度为0.1-2N的氢氧化钠水溶液、氢氧化钾水溶液、氢氧化镁水溶液和氢氧化钙水溶液)使该酸性部份的pH调节到8至10，优选8.5至9.5，将该部份向流动水中透析一般至少15小时，优选大约18小时，然后向蒸馏水透析一般1.5至2.5小时，并且使从透析中得到的内部溶液冷冻干燥的方法。通过这个方法，能够得到本发明糖胺聚糖的冷冻干燥产物。
如同需要通过适当地使用包括使葡糖胺残基2-位氨基基团或构成主链的糖醛酸残基2-位羟基基团硫酸化的方法和包括使构成组合主链的糖醛酸残基2-位硫酸酯基团释放的方法，具有在葡糖胺残基2-位和糖醛酸残基2-位不同程度硫酸化作用的本发明糖胺聚糖的改进的方案能够通过改变使本发明糖胺聚糖的这样的硫酸化程度来制备。
作为使该葡糖胺残基2-位氨基基团硫酸化的方法，例如，能够提到的是带有改进的Nagasawa等的方法(Carbohydr.Res.(1989)193，165-172)。即把本发明糖胺聚糖或其盐溶解在pH大约为9至10的碱性溶液(例如，碳酸钠溶液、氢氧化钠溶液、氢氧化钾溶液等)中，并且在50至55℃下，于6至24小时内另外加入固体磺酸三甲基铵或磺酸三乙基铵。
另外，作为使该糖醛酸残基2-位羟基基团硫酸化的方法，例如，也能够提到Nagasawa等(Carbohydr．Res.(1989)193，165-172)的方法，该方法与以上提到的方法相同并带有改进。即通过以常规方式的盐交换将本发明糖胺聚糖制备成为三丁基铵盐，并且将所得到的本发明糖胺聚糖的三丁基铵盐充分溶解于N，N-二甲基甲酰胺，并且在-10至0℃下，使其与5至20摩尔当量/(摩尔的游离羟基)的硫酸化吡啶反应1小时。然而，在这个方法中，与该糖醛酸残基2-位羟基基团的硫酸化一起，葡糖胺残基6-位硫酸酯基团也被硫酸化。因此，当使用该方法时，可优选地使该产物再次经历生产本发明糖胺聚糖的方法以释放该葡糖胺残基6-位的硫酸酯基团。
作为使该糖醛酸残基2-位硫酸酯基团释放的方法，能够提到例如Jaseja等的方法(Can.J.Chem.(1989)67，1449-1456)的部分改进的方案。即将本发明糖胺聚糖的钠盐溶于NaOH溶液并立即冷冻干燥。把所得到的冷冻干燥粉末溶于蒸馏水中，并且通过加入乙酸调节到pH6至8，优选pH6.5至7.5。然后，该溶液经历透析和冷冻干燥。
本发明糖胺聚糖的制剂优选地含有较少污染的内毒素。特别地，包含在1mg本发明糖胺聚糖制剂中的此污染的内毒素的量(内毒素活性)优选为(但是不局限于)不多于0.2USP内毒素单位(EU)，更优选不多于0.1EU，最优选少于0.05EU。
另外，当本发明糖胺聚糖的制剂用作药物原料时，为了确保安全性，本发明糖胺聚糖的制剂优选地具有吡啶的含量不多于200ppm，更优选地不多于150ppm，最优选地不多于100ppm。按照日本药局方，在药用制剂中的吡啶含量被调节至不多于200ppm。
附图的简介
图1显示了本发明糖胺聚糖(发明2)制备期间的13C-NMR谱的变化时间过程。图1(1)显示了标准肝素(标准H)的13C-NMR谱。图1(2)、(3)、(4)和(5)显示了在110℃下通过分别将保留时间改变为15、30、60和120分钟所得到的糖胺聚糖的13C-NMR谱(对照3、对照4、对照5和发明2)。在该图中，6S为具有6-O-硫酸酯基团的葡糖胺残基6-位碳原子的信号并且6为不具有6-O-硫酸酯基团的葡糖胺残基6-位碳原子的信号。
图2显示了本发明糖胺聚糖的13C-NMR谱(发明1)。
图3显示了本发明糖胺聚糖的13C-NMR谱(发明3)。
图4显示了本发明糖胺聚糖的13C-NMR谱(发明4)。
图5显示了对照组糖胺聚糖的13C-NMR谱(对照1)。
图6显示了对照组糖胺聚糖的13C-NMR谱(对照2)。
图7显示了本发明糖胺聚糖的促进健康皮肤伤口愈合的活性(发明2)。
图8显示了本发明糖胺聚糖促进糖尿病性皮肤溃疡愈合的活性(发明2)。
用于实施本发明的最佳方式从此以后，本发明将参照以下实施例更详细地进行解释。
首先将解释试验方法。试验方法1[通过使用化学二糖分析方法并且计算6-脱硫酸化比例来检测结合在葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团]根据Kariya等(Kariya等，J.Biochem.(1998)123，240-246)的方法，测定了受试物质的6-脱硫酸比例。即把100μl亚硝酸溶液(pH1.5)加入到1mg的样品中并且于室温下维持10分钟。用1N碳酸钠将该混合物调节至pH7.5，并且在其上通过惰性气流进行干燥。向该干燥产物中加入200μl蒸馏水和200μl含有1％PNP-肼的乙腈，并且在37℃下使该混合物维持30分钟以使得糖胺聚糖与PNP的偶合反应发生。然后，通过使用SepPak C-18筒形柱(Waters)部分纯化。通过IPRP-HPLC(离子对反相HPLC)分析该部分纯化的产物以证实ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)的峰存在或不存在。另外，计算ISM(IdoA(2S)-AnMan-PNP)和ISMS(IdoA(2S)-AnMan(6S)-PNP)的峰面积并且所得到的值根据下式用于计算6-脱硫酸化比例6-脱硫酸化比例=(B0×A1-A0×B1)/(B0(A1+B1))×100(％)其中，A0为当以下提到的标准肝素用作样品时的ISM的峰面积，B0为当以下提到的标准肝素用作样品时的ISMS的峰面积，A1为当受试物质(用作对待测物质例如标准肝素、本发明糖胺聚糖等的通用名称)用作样品时的ISM的峰面积，并且B1为当受试物质用作样品时的ISMS的峰面积。试验方法2[使用糖胺聚糖酶消化作用与高效液相色谱法联合的酶二糖分析方法](1)用糖胺聚糖酶的消化作用将1.0mg受试物质溶于220μl含有2mM乙酸钙的20mM乙酸钠(pH7.0)中。把糖胺聚糖酶(每一个肝素酶20mU，肝素酶Ⅰ和Ⅱ)加入其中，并且使之在37℃下反应2小时。(2)HPLC分析在下列条件下通过使用HPLC(Shimadzu公司，型号LC6AD)分析在以上(1)(20μl)中酶消化作用后的溶液。使用与已知方法(Kariya等，Comp.Biochem.Physiol．(1992)103B，473-479)相一致的离子交换柱(Dionex，CarboPac PA-1柱，φ4.0×250mm)，在每分钟1ml的流速下通过使用氯化锂梯度(50mM→2.5M)进行洗脱，并在232nm下测量吸收度。(3)计算二糖组成，在所有糖醛酸残基中的2-O-硫酸化糖醛酸残基的％(mol)和有效二糖收率从通过HPLC在以上(2)中检测的峰面积，通过测定每一个可鉴定的不饱和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的量来得到该二糖组成，并且计算每一个不饱和二糖的比例(％(mol))。在所有糖醛酸残基中的2-O-硫酸化糖醛酸残基的％(mol)作为在该糖醛酸残基2-位具有硫酸酯基团的不饱和二糖的比例来计算(ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的峰的总面积)，把通过HPLC鉴定的不饱和二糖的总量[ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S的峰的总面积]取作100％。
该有效二糖收率作为通过可鉴定的不饱和二糖(ΔDiHS-OS、ΔDiHS-NS、ΔDiHS-6S、ΔDiHS-US、ΔDiHS-di(6，N)S、ΔDiHS-di(U，N)S、ΔDiHS-di(U，6)S和ΔDiHS-tri(U，6，N)S)的总峰面积在以上二糖分析方法中通过HPLC分析检测的所有峰的总面积中的比例乘以根据以下试验方法4测量的酶消化作用的百分数来表示。试验方法3[分子量的测定]通过HPLC凝胶过滤分析了10μl含有3％(w/w)受试物质的溶液。所用的柱为TSK凝胶-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh公司，φ7.8×300mm)。通过使用0.2M氯化钠作为洗脱剂在0.6ml/分钟流速下洗脱该受试物质。将差示折光计(Shimadzu公司，AID-2A型)用于检测该受试物质。通过使用预先测定分子量的肝素(重均分子量)作为对照来计算该分子量(Kaneda等，Biochem.Biophys.Res.Comm.(1996)220，108-112)。试验方法4[用于酶消化作用的测量方法](1)糖胺聚糖酶的消化作用将1.0mg受试物质溶于220μl含有2mM乙酸钙的20mM乙酸钠(pH7.0)中。把糖胺聚糖酶(每一个肝素酶20mU，肝素酶Ⅰ和Ⅱ)加入其中，并且使之在37℃下反应2小时。(2)通过凝胶过滤分析使用HPLC凝胶过滤分析了根据以上(1)酶消化作用后得到的20μl溶液。所使用的柱为TSK凝胶-(G4000+G3000+G2500)PWXL(Tosoh公司，φ7.8×300mm)。通过使用0.2M氯化钠作为洗脱剂在每分钟0.6ml的流速下洗脱该受试物质。使用差示折光计(Shimadzu公司，AID-2A型)来检测该受试物质。该酶消化性作为相对于保留时间在40分钟(不饱和四糖)、41.5分钟(三硫酸化不饱和二糖)、42分钟(二硫酸化不饱和二糖)、43分钟(单硫酸化不饱和二糖)和45分钟(无硫酸酯基团的不饱和二糖)的总峰面积在保留时间41.5分钟(三硫酸化不饱和二糖)、42分钟(二硫酸化不饱和二糖)、43分钟(单硫酸化不饱和二糖)和45分钟(无硫酸酯基团的不饱和二糖)的总峰面积的百分数来计算。试验方法5[用于活化部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)的测量方法]用含有3.2％(重量)的构橼酸钠水溶液的注射器从大鼠下主动脉采集构橼酸钠水溶液9倍体积的血。在4℃下，以1，000×g将该混合物离心10分钟以得到血浆。将100μl血浆和100μl含有预先测定浓度的受试物质的生理盐水分散在测量杯中并在37℃下温育1分钟。然后，将100μl的预先已在37℃下维持5分钟的肌动蛋白(Yoshitomi制药工业有限公司的商品名)加入其中并在37℃下进一步温育2分钟。随后，通过加入已在37℃下预先维持的100μl的0.02M氯化钙溶液开始凝血作用。通过使用自动血液凝血测量仪(Baxter，型号AMELUNG KC10A)来测量凝血时间。试验方法6[用于凝血酶时间(TT)的测量方法]将100μl的根据对于上述APTT测量方法所解释的方法制备的血浆和100μl含有预先测定浓度的受试物质的生理盐水分散在测量杯中并在37℃下温育1分钟。然后，通过加入已在37℃下预先维持5分钟的100μl凝血酶(10U/ml，Yoshitomi制药工业有限公司)开始凝血作用。通过使用自动血液凝血测量仪(Baxter，型号AMELUNG KC10A)来测量凝血时间。试验方法7[用于抗凝血酶活性的测量方法]
在冷却状态下，把350μl含有150mM氯化钠、10mM氯化钙和0.1％牛血清清蛋白、100μl牛ATⅢ溶液的20mM Tris缓冲液(在同一缓冲液中为1U/ml)和100μl的两倍连续稀释的受试物质(样品)的水溶液三份溶液混合并且在37℃下温育2分钟。向该溶液中加入50μl牛凝血酶溶液(在蒸馏水中为50mU/ml)并且在37℃下温育5分钟。然后，向该混合物加入100μl的底物溶液(Boc-Val-Pro-Arg-MCA(peptide Laboratory，Boc意指叔丁氧基羰基，并且MCA意指7-氨基-4-甲基香豆素，70μM水溶液)，将该混合物搅拌并且在37℃下温育3分钟。随后，通过加入300μl的30％乙酸终止该反应。在激发波长350nm和荧光波长444nm下测量该反应混合物的荧光强度。使用蒸馏水的空白组1替代以上反应混合物组成中的样品并且空白组2由仅包含底物的反应混合物组成，并且该缓冲液以相同的方式处理，由此测量其荧光强度。
根据以下公式计算凝血酶活性抑制率，并且将在受试物质浓度下的抑制率绘制在半对数图中以得到呈现50％抑制作用的浓度(IC50)。
凝血酶活性抑制率=(1-(ΔFs/ΔFb))×100(％)其中，ΔFs代表(样品荧光强度-空白组1荧光强度)和ΔFb代表(空白组2荧光强度-空白组1荧光强度)。试验方法8[用于出血活性的测量方法]用乙醚麻醉大鼠，然后在每个给药部位用0.4ml含有0.2mg、0.4mg或0.8mg的每一种受试物质的生理盐水在其背上进行皮下给药。至于阴性对照组，每个给药部位用0.4ml生理盐水皮下给药。放血24小时后处死大鼠。除去围绕每个给药部位的皮肤并且通过使用游标卡尺来测量该皮下瘀斑的长短直径以计算面积。通过Dunnett氏多元比较试验来测量与阴性对照组的差异。试验方法9[用于促进bFGF活性作用的测量方法1(加入NaClO3)]将在含有10％牛血清的DMEM(Asahi Techno Glass)中传代培养的A31细胞(BALB/C小鼠3T3细胞)以5×104细胞/ml密度悬浮于含有20mM的NaClO3和2ng/ml人重组碱性成纤维细胞生长因子(hrbFGF，Promega)的DMEM-ITS培养基(由GIBCO BRL制备的ITS、10mg/l胰岛素、5.5mg/l运铁蛋白和6.7μg/l亚硒酸)中。以1μg/ml的最终浓度把每一种受试物质加入到该细胞悬浮液中。在96孔微量滴定板上的每一个孔中接种100μl的细胞悬浮液并且进行培养。培养3天后，每一个孔中加入20μl的Celltiter96AQ非放射性细胞增殖测试溶液(Promega)，并且在37℃下培养2小时。通过使用吸光计测量在492nm波长下的吸收以量化每一个孔中细胞增殖。通过将加入标准肝素时，细胞增殖率取作100，而阴性对照组的细胞增殖率(没有加入受试物质，仅加入作为溶剂的磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS))取作0，来计算加入每一种受试物质时的细胞增殖率。[用于促进bFGF活性作用的测量2(没有加入NaClO3)]将在含有10％牛血清的DMEM(Asahi Techno Glass)中传代培养的A31细胞(BALB/C小鼠3T3细胞)以5×104细胞/ml密度悬浮于含有2ng/ml的hrbFGF(Promega)的DMEM-ITS培养基(由GIBCO BRL制备的ITS、10mg/l胰岛素、5.5mg/l运铁蛋白和6.7μg/l亚硒酸)中。以20μg/ml的最终浓度把每一种受试物质加入到该细胞悬浮液中。在96孔微量滴定板上的每一个孔中接种100μl的细胞悬浮液并且进行培养。培养3天后，每一个孔中加入20μl的Celltiter 96AQ非放射性细胞增殖测试溶液(Promega)，并且在37℃下培养2小时。通过使用吸光计在492nm波长下测量吸收度来量化每一个孔中细胞增殖。通过将标准肝素加入时的细胞增殖率取作100，而阴性对照组(没有加入受试物质，仅加入作为溶剂的磷酸盐缓冲的生理盐水(PBS))的细胞增殖率取作0，来计算每一种受试物质加入时的细胞增殖率。[用于促进bFGF活性作用的测量3(没有加入NaClO3/原代培养细胞)]在乙醚麻醉下，把C57BL/6小鼠(9周龄，雌性，Charles River)背部毛刮净并在皮下植入预灭菌棉球(2个位置/小鼠)。10天后将这些棉球与肉芽组织一同移去。用青霉素/链霉素溶液(青霉素200U／ml，链霉素200μg/ml)洗涤棉球两次并用PBS洗涤一次。然后，除去覆盖在这些棉球上的膜。把棉球转移到包括含有0.1％胶原酶和0.25％胰蛋白酶的溶液的试管中，并且在37℃下于恒温器中振摇1小时。该处理过的溶液通过细胞渗滤器(φ=70μm)筛分。在其中加入含有10％牛血清的RPMI1640培养基(Iwaki)，轻微搅拌该混合物并以2，000×g离心3分钟。用相同的培养基将得到的细胞洗涤三次，并且以密度为1×105细胞/ml再悬浮于相同的培养基中并接种到10cm培养皿上。次日，除去未附着的细胞并在CO2孵育器中于37℃下培养这些细胞直到得到分会合状态。
通过使用0.25％胰蛋白酶和0.05％EDTA溶液从培养皿中分离分会合的细胞。通过离心洗涤该细胞并以密度为5×104细胞/ml悬浮于含有0.1％透析的牛血清的Basal MF/S-MEM培养基(Gibco)中。在96孔微量滴定板上的每一个孔中分散100μl的细胞悬浮液。另外，把50μl溶有4μg/ml的hrbFGF(Promega)的Basal ME/S-MEM培养基和50μl溶有发明2的Basal ME/S-MEM培养基分散到每一个孔中，并且在CO2孵育器中于37℃下将细胞培养3夭。在完成培养之后，向每一个孔中加入15μl细胞计数溶液(Dojin)并且把该培养物继续培养3小时。然后，在450nm下测量该培养基的吸收度。使用仅有Basal ME/S-MEM培养基作为溶剂但是未加入发明2的样品作为阴性对照组。加入溶有标准H以替代发明2的BasalME/S-MEM培养基的样品用作阳性对照。
参照实施例1[实施例中用作对照的标准肝素]作为标准肝素，使用源于猪小肠的肝素(来自SPL的市售产品)。该肝素具有以下理化性质。(1)根据以上试验方法2，通过二糖分析方法得到以下二糖组成(％(mol))(其有效二糖收率85.5％)。
表2 (2)抗凝血活性为160IU/mg。(3)通过以上试验方法3测得平均分子量在13，000至15，000Da范围内。(4)通过以上试验方法4测得酶消化活性为89.8％。(5)当使用含有3μg/ml标准H的溶液时，通过以上试验方法5的APTT测量方法测得APTT不少于200秒。(6)当使用含有1μg/ml标准H的溶液时，通过以上试验方法6的TT测量方法测得TT不少于600秒。
以后，该标准肝素仅称作“标准H”。
参照实施例2制备对照糖胺聚糖1(已知物质1)按照在WO96/01278的实施例中描述的方法，制备对照糖胺聚糖1(在下文中简单称作“对照1”)。即把以常规方式由标准H作为吡啶鎓盐制备的200mg肝素吡啶鎓盐(在下文中称作“HepP”)加入到并溶解在20ml无水吡啶中。向该溶液加入4ml(大约4g，20倍重量的HepP)的MTSTFA并且在95℃下将该混合物搅拌2小时。然后，向该混合物中加入20ml水并且使用Millipore超滤膜(Millipore)透析该混合物。在100℃下加热该透析溶液直到白色混浊消失。随后，通过加入NaOH(1N)将该溶液调节至pH9，向流动水的透析进行18小时并且对蒸馏水透析进行2小时。冷冻干燥该透析溶液以得到130mg的粉末状对照1(钠盐)。
参照实施例3制备对照糖胺聚糖2(已知物质2，溶剂分解+N-再硫酸化作用)按照在WO95/30424的实施例1中的描述，制备对照糖胺聚糖2(在下文中简单称作“对照2”)。即加入50mg的HepP并溶解在10ml水中。用90ml二甲基亚砜稀释该溶液，并在热水浴上于100℃下将该混合物搅拌72小时。向其加入5％碳酸氢钠50ml并将该混合物冷却。然后，每次12小时向1L 0.1M乙酸钠溶液透析两次并且向蒸馏水彻底透析。
向该透析溶液中加入浓度为0.1M的碳酸钠水溶液和另外5摩尔当量的吡啶/SO3并且于60℃下将该混合物搅拌24小时。在24小时期间，每8小时加入5摩尔当量的吡啶/SO3两次。然后，向流动水透析该溶液18小时并向蒸馏水透析2小时。过滤该透析溶液并冷冻干燥以得到47.5mg的粉末状对照2(钠盐)。
实施例1[制备本发明糖胺聚糖等]在以下表3中描述的每一个反应条件下将HepP和MTSTFA加入到吡啶中，并且搅拌该混合物，加热和温育一定的时间。在冰上冷却含有该反应混合物的容器。然后，减压下通过使用旋转蒸发器浓缩该混合物10倍，并且然后向其中加入2倍体积的蒸馏水。另外，减压下通过使用旋转蒸发器放置该混合物直到白色混浊消失，并向流动水透析48小时和对蒸馏水透析2小时。该透析溶液通过以Amberlite IR-120B(H+形式)树脂(ORGANO CORP.)填充的柱(用蒸馏水平衡)，并且仅有酸性部份集中在收集的部份中。通过加入NaOH(1N)将该酸性部份调至pH9，向流动水透析18小时并且向蒸馏水透析2小时。冷冻干燥该透析溶液以得到每一个作为粉末的靶制剂(钠盐)。
得到的制剂(本发明1至4的糖胺聚糖(发明1至4)和对照的糖胺聚糖3至6(对照3至6))和用于每一个制剂的条件显示在表3中。
表3 *蒸汽夹套用于加热不同的反应规模用于发明1至4。与发明2相同的反应规模用于对照3至5，但是改变反应时间以得到对照组。以对于发明2的相同量的HepP用于对照6，但是以20倍的量使用作为硅烷基化试剂的MTSTFA并且降低该反应温度以得到该对照组。
按照试验方法3测量平均分子量。结果揭示对于所有的物质而言大约为12，500Da并且发现该分子量基本上一直未降低。
实施例2(1)酶消化性按照在试验方法4中描述的方法测量标准H、发明1至4和对照1、2和6的酶消化性。也按照在试验方法1(表4)中描述的方法计算除了标准H以外的物质的6-脱硫酸化比例。显示在表4中的对照1的6-脱硫酸化比例引用自WO96/01278中所给出的值。
表4 *在WO96/01278中给出的6-脱硫酸化比例。
这揭示了在本发明糖胺聚糖(发明1至4)和对照2中得到高的酶消化性和高的6-脱硫酸化比例。(2)二糖组成按照在试验方法2(表5)中描述的酶二糖分析方法测量了对标准H、发明1至4和对照1、2和6的二糖组成。
表5 注0表明该值低于检测限。单位％(mol)。
结果，通过使用溶剂解的脱硫酸化方法制备的对照2呈现了明显不同于其它物质的二糖组成。也发现本发明糖胺聚糖与标准H、对照1和对照6相比较具有较少的6-位硫酸酯基团。另外，本发明的糖胺聚糖特征在于未检测到三硫酸化的不饱和二糖(ΔDiHS-(U，6，N)triS)。
实施例3内毒素浓度的测量使用Toxicolor-LS-50M仪(Seikagaku公司)通过比色定量测定本发明糖胺聚糖制剂中所污染的内毒素。Toxicolor-Et-2(Seikagaku公司)用作标准内毒素。
即按照用于描述在实施例1中的制备发明2的方法，通过使用无内毒素仪器、吡啶和蒸馏水来制备发明5。然后，将50μl的(1)的水溶液(其中发明5稀释成浓度为2mg/ml)和(2)含有0.212EU/mL内毒素的(1)的水溶液各分散在无内毒素的微量滴定板的孔中。相似地，将(3)含有0.424EU/mL的Et-2作为标准溶液的水溶液50μl和(4)50μl蒸馏水(无内毒素)作为空白的每一个分散在无内毒素的微量滴定板的孔中。将含在Toxicolor-LS-50M仪中的50μl主要反应物加入分散有(1)至(4)的每一个孔中，并且迅速将该板置于孔读数器SK601(购买自Seikagaku公司)上。在37℃下30分钟反应期间内测量在405nm的测量波长下和492nm的对照波长下的吸收度的时间过程(mAbs/min)以得到绝对校准曲线，该曲线用于计算内毒素的浓度。
因为发明5本身具有针对LAL试剂的抑制活性或活性过强是可能的，按照以下等式由相应于加入的内毒素单位量的测量值得到加入收率，并且通过与其相乘来校正实际测量值。
{(加入的测量值)-(未加入的测量值)}/(加入内毒素的浓度)由此得到的在发明5的10mg/ml水溶液中的内毒素活性为0427EU/ml。即发明5的污染的内毒素量为0.0427EU/mg。因此，这揭示了作为药用制剂具有污染了足够低的内毒素量的本发明糖胺聚糖制剂仅能通过本发明制备方法来制备。
实施例4吡啶含量的测定测量了残留在本发明糖胺聚糖中吡啶的含量。即将发明3(20mg)加入到5N的NaOH(1ml)中，并且把该溶液超声处理5分钟。向该溶液中加入1ml二甲基醚并且剧烈搅拌该混合物2分钟。然后，以3，000×g将该溶液离心10分钟以分离成上层(1)(有机层)和下层(1)(水溶液层)。向该下层(1)中加入1ml二甲基醚并再次剧烈搅拌该混合物。然后在如上相同的条件下离心该溶液以分离成上层(2)(有机层)和下层(2)(水溶液层)。弃去下层(2)。合并上层(1)和上层(2)以得到2ml提取液(1)。
向如上描述的得到的提取液(1)中加入400μl的2N HCl并且剧烈搅拌该混合物2分钟。以3，000×g将该混合物离心10分钟以分离成上层(3)(有机层)和下层(3)(水溶液层)。弃去上层。向下层(3)中加入5 N的NaOH(800μl)和另外300μl的二氯甲烷，然后剧烈搅拌该混合物2分钟。以3，000×g将该溶液离心10分钟以分离成上层(4)(水溶液层)和下层(4)(有机层)。弃去上层(4)。通过气相层析法来分析1μl的下层(4)。
将GC-18APFSC(Shimadzu公司)用于该气相层析法并且使用DB-5ms(φ0.25mm(I.D.0.5μm)×30mJ&W)作为柱。氦用作流动相。在80℃下将流速设置成22cm/sec并且使该柱在80℃下维持1分钟。然后，该柱加热炉温度以每分钟10℃的速度增至120℃用于洗脱。通过使用FID(火焰离子化检测器)在300℃下进行检测。通过分析在浓度分别为20、40、60、80和100ppm下的1μl含有吡啶的甲醇来建立校准曲线。将发明3的水分含量设置为10％以便计算。对于发明3而言，吡啶含量的提取和量化进行两次。结果，该吡啶含量两个测量值为73.1ppm和70.3ppm。两个数值可考虑低于200ppm，其为对药物制剂的吡啶含量的调控值。
实施例5[通过13C-核磁共振谱的结构分析]通过13C-核磁共振谱(13C-NMR)分析标准H、发明1至4和对照3至5(标准H图1(1)，发明1图2，发明2图1(5)，发明3图3，发明4图4，对照3图1(2)，对照4图1(3)，对照5图1(4))。型号为QE300(GE)的NMR光谱仪用于该13C-NMR谱。以氧化氘制备每一个受试物质的5％(w/v)溶液。在80℃的测量温度下，采用60°的脉中宽度和90，000次的积分数，当TSP(Wako纯化学工业有限公司)用作标准(0ppm)(作为内标物)时，通过使用显示51.66ppm化学位移的甲醇进行测量。标准H、发明1至4的信号的化学位移如下(表6)。
表6 单位ppm
13C-NMR的结果显示在69.1ppm(具有硫酸酯基团的6-位碳原子的信号)和62.6至63.0ppm(不具有硫酸酯基团的6-位碳原子的信号)检测到该葡糖胺残基的C-6的信号。通过使用以上信号强度和信号强度比例，6-位未硫酸化的葡糖胺残基(6-位无硫酸化GlcN比例)的比例和基于每一个样品(发明1至4和对照3至5)的标准H的葡糖胺残基6-位脱硫酸化比例(de-6S比例)的计算结果显示如下。
表7 注0*表示该值为低于测量限。
如从这些结果显而易见的是，当在以上脱硫酸作用的条件下于110℃温育时通过大约2小时的反应得到几乎100％的6-位脱硫酸作用。
通过使用如上所述13C-NMR光谱来分析对照1和对照2。对于对照1而言，在靠近发明1至4的那些的位置检测到每一个碳原子的峰位置，但是在67ppm和96.5至97.0ppm(连续)检测到发明1至4和标准H的任何一个中未观察到特征峰(图5)。因为在对照3、对照4和对照5中(在制备发明2中通过改变反应时间得到的物质)未观察到这些特征峰，这揭示了对照1具有不同于本发明糖胺聚糖的结构或通过改变6-位脱硫酸化反应时间得到的物质。
至于对照2，发现在70.0至71.0ppm范围内未观察到其对标准H和发明1至4所观察到的糖醛酸3-位碳原子的峰(图6)。另外，当对该肝素结构所观察到的大约98.3ppm、100ppm和102ppm的峰进行比较时，大约98.3ppm的峰是最高的，其成为图表的特征。这些结果也证实对照2也具有不同于本发明糖胺聚糖的结构。
实施例6[抗凝血活性的测量](1)活化的部分组织促凝血酶原激酶时间(APTT)的测定按照在试验方法5中描述的方法测量标准H、发明2、对照4和对照5的APTT(表8)。结果，发现在标准H、对照4和对照5中APTT被延长，而发明2显示对延长APTT几乎无作用。因为对照1和对照6的6-位脱硫酸比例介于对照4和对照5的脱硫酸比例之间，预期它们的抗凝血活性将介于对照4和对照5之间。
表8 注-表示“未测定”。单位秒(2)凝血酶时间(TT)的测定按照在试验方法6中描述的方法测定标准H、发明2、对照4和对照5的TT(表9)。结果，发现在标准H、对照4和对照5中TT被延长，而发明2显示对延长TT无作用。因为对照1和对照6的6-位脱硫酸比例介于对照4和对照5的脱硫酸比例之间，预期它们的抗凝血活性将介于对照4和对照5之间。
表9
注-表示“未测定”。单位秒(3)抗凝血酶活性的测定按照在试验方法7中描述的方法测定标准H、发明2和对照1的抗凝血酶活性(表10)。这些结果揭示与标准H和对照1相比发明2的抗凝血酶活性基本上被降低。
表10
实施例7[本发明糖胺聚糖的出血活性]按照在试验方法8中描述的方法测定标准H和发明2的出血活性(表11)。这些结果揭示发明2完全丧失出血活性。
表11
注-表示“未测定”。
实施例8[本发明糖胺聚糖对健康皮肤伤口的促进伤口愈合活性]通过使用健康大鼠检查本发明糖胺聚糖对健康皮肤伤口的促进伤口愈合活性。即把健康大鼠进行背部刮毛，并且通过使用φ8mm眼科环锯将该皮肤解剖至皮下区域。经使用眼科剪刀和镊子移去皮肤以在大鼠背上建立两个有缺陷的伤口。然后，制备每一个含有0.5％(重量)的标准H、发明2或对照4的油膏剂，并且每天涂敷0.1g每一种膏剂以比较基于愈合面积的伤口愈合程度。乙醚麻醉下使大鼠保持静止，然后以恒定不变的焦距拍摄这些缺陷部分的照片。通过使用成像分析系统在这些正片上测定皮肤缺陷部分以进行测量。通过从在建立该缺陷部分之后的面积迅速减去每一次测量的面积来得到每一个愈合面积。通过Tukey氏多重比较试验进行统计学分析。结果，从通过涂敷使用发明2制备的膏剂至上述组动物中观察到明显的促进皮肤伤口愈合活性(图7)。
实施例9[本发明糖胺聚糖的促进糖尿病性皮肤溃疡的愈合活性]通过使用患有遗传性糖尿病的小鼠(db/db小鼠(雌性)日本Clare)检查本发明糖胺聚糖的促进糖性尿病皮肤溃疡的愈合活性。即将患有遗传性糖尿病的小鼠进行背部刮毛，并且通过使用φ8mm眼科环锯将该皮肤解剖至皮下区域。经使用眼科剪刀和镊子移去皮肤以在其背部建立两个有缺陷的伤口。然后，每天滴入50μl的溶有1％(w/w)的标准H、发明2或对照4的生理盐水以比较伤口愈合程度。乙醚麻醉下使大鼠保持静止，然后以恒定不变的焦距拍摄这些缺陷部分的照片。通过使用成像分析系统在这些正片上测量皮肤缺陷部分以进行测量。通过从在建立该缺陷部分之后的面积迅速减去每一次测量的面积来得到每一个愈合面积。通过Tukey氏多重比较试验进行统计学分析。结果，其揭示了发明2从给药开始到第11天后统计学显著的促进愈合，尽管前7夭在任何受试物质中未发现到显著的差异。
实施例10[本发明糖胺聚糖对bFGF亲和性的测量]测量了本发明糖胺聚糖对细胞增殖因子的亲和性。即将0.2mg的发明2溶于100μl的50mM碳酸氢钠缓冲液(pH8.5)中。向其中加入含有74μg的NHS-LC-生物素(琥珀酰亚胺基-6-(生物素酰胺)-己酸酯，Pierce)的水溶液，并且使该混合物在室温下反应30分钟。随后，向该溶液中加入2.5倍体积乙醇，并经离心收集沉淀的和生物素酰化的发明2。将生物素酰化的发明2固定在抗生物素酰化的传感器嵌片(BIAcore AB，SA)上。使溶于液相的bFGF与传感器嵌片表面发生接触，然后通过两种方法分析发明2和bFGF之间的相互作用，这两种方法为亲和性和动力学分析与稳态分析方法，两者都使用表面胞质基因效应。
结果，通过前一种分析方法得到的缔合速度常数(Ka)对于用作对照的标准H和发明2分别为1.3(M-1S-110-6)和1.0(M-1S-110-6)。对于标准H和发明2的解离速度常数(Kd)分别为4.8(S-1103)和5.3(S-1103)。由这些结果计算的解离常数(KD)对于标准H和发明2分别为4.1nM和4.3nM。
通过后一种分析方法得到的解离常数(KD)对于标准H和发明2分别为23nM和24nM。
从这些结果中显而易见地是发明2对bFGF的亲和性基本上与标准H的亲和性相同。
实施例11[本发明糖胺聚糖的促进bFGF活性的作用的测量(加入NaClO3)]按照在试验方法9中描述的[对促进bFGF活性的作用的测量1]测量了发明2的促进bFGF活性的作用。相似地，按照相同方法也测量了对照1和对照2的促进bFGF活性的作用。结果，发现发明2具有与标准H相同程度的促进bFGF活性的作用(表12)。也发现对照1与标准H相比较具有大约26％的促进bFGF活性的作用，即不多于发明2的作用的1/4。提示通过13C-NMR揭示的结构差异引起促进bFGF活性的作用的差异。
表12
实施例12[本发明糖胺聚糖的促进bFGF活性的作用的测量2(未加入NaClO3)]按照在试验方法9中描述的[对促进bFGF活性的作用的测量2]测量了本发明(发明2)糖胺聚糖的促进bFGF活性的作用。对照2用作比较对照组。结果，发现发明2具有与标准H相同程度的促进bFGF的活性作用(表13)。这也揭示了对照2的促进bFGF活性的作用不多于发明2的一半。
表13
实施例13[本发明糖胺聚糖的促进bFGF活性的作用的测量3(未加入NaClO3/原代培养细胞)]按照在试验方法9中描述的[对促进bFGF活性的作用的测量3]测量了本发明(发明2)糖胺聚糖在原代培养细胞上对bFGF活性的促进作用。标准H用作比较对照组。结果，发现发明2在原代培养细胞上与具有75％的标准H的促进bFGF活性的作用(表14)。
表14
实施例14[本发明糖胺聚糖对果糖-1，6-二磷酸醛缩酶亲和性的测量]通过亲和色谱法测量了其为呼吸作用中糖酵解途径的关键酶的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶(在下文称作“FPA”)与本发明糖胺聚糖之间的亲和性，其中使用了按照Sasaki等(J.Chromatogr.(1987)400，123-132)的方法制备的亲和凝胶载体填充的FPLC的柱。该亲和凝胶载体制备如下。将200mg的发明2溶于5ml的2M磷酸盐缓冲液(pH7.2)中，并把5g氨基琼脂糖凝胶粉末悬浮在该溶液中。将15mg的NaB(CN)H3加入到该混合物中，室温下充分搅拌该混合物并使之反应24小时。在反应完成后，过滤含有该偶合产物的凝胶并以水洗涤3次以完全脱盐。把该脱盐凝胶悬浮在5ml的0.2M的CH3COONa溶液中，并向其内加入2.5ml乙酸酐，使之在0℃下反应30分钟并然后在室温下反应30分钟。在该反应完成后，洗涤该生成的凝胶以完全脱盐。
把A4醛缩酶、C4醛缩酶和其杂化型醛缩酶的混合物上样到用凝胶载体装填的柱上，在所述凝胶载体上用含有1mM EDTA和0.5mM2-巯基乙醇的10mM的Tris-HCl(pH7.5)固定和平衡。通过使用线性浓度梯度的NaCl(0至1.0M)洗脱该吸附的部份，该NaCl由两种溶液所形成15ml含有1mM EDTA和0.5mM 2-巯基乙醇的10mMTris-HCl(pH7.5)和15ml含有1.0M NaCl、1mM EDTA和0.5mM 2-巯基乙醇的10mM Tris-HCl(pH7.5)。通过在220nm下测定吸收度来进行检测，并且测量相应于最高洗脱峰的NaCl浓度。
相似地，以通过使用以下物质代替发明2制备的载体来进行亲和色谱，这些物质包括(1)标准H、(2)肝素衍生物(在下文也称作“2ODSH”)，该衍生物通过Jaseja等的方法(Can.J.Chem.(1989)67，1449-1456)并带有部分改进处理标准H以除去通过酯键结合在构成标准H的主链的糖醛酸残基2-位羟基基团上的硫酸酯基团来得到和(3)肝素衍生物(在下文也称作“NDSH”)，该衍生物根据Inoue和Nagasawa的方法(Carbohydr.Res.(1976)46，87-95)处理标准H以除去通过酯键结合在构成标准H的主链的葡糖醛酸残基2-位氨基基团上的硫酸酯基团并且使该产物N-乙酰化来得到。测量所得到的最高洗脱峰的NaCl浓度以便比较亲和程度。
结果，发现从标准H固定的凝胶载体中以大约0.37M洗脱该FPA活性部份，同时从固定发明2、2ODSH或NDSH的凝胶载体中以0.31至0.33M洗脱该活性部份。即人们发现这些物质具有几乎与标准H相同水平的FPA亲和性。
实施例15[本发明糖胺聚糖的果糖-1，6-二磷酸醛缩酶抑制活性的测量]测量了本发明糖胺聚糖的FPA抑制活性。当以上的酶作用在作为底物的1，6-二磷酸果糖(在下文称作“F-1，6-P2”)上时，该酶将底物分解为磷酸二羟丙酮(在下文称作“DHAP”)和3-磷酸甘油醛(GAL-3-P)。当其作用在作为底物的1-磷酸果糖(在下文称作“F-1-P”)上时，它将底物分解成为DHAP和甘油醛(GAL)。因此，使用F-1，6-P2和F-1-P作为底物，当在丙糖磷酸异构酶存在下该3-磷酸甘油脱氢酶系统偶合时，通过在340nm下测量吸收度的变化来测量NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)量的变化，并且因此将所生成的DHAP还原为3-磷酸甘油。
按照Blostein和Rutter的方法(J.Biol.Chem.(1963)238，3280-3285)进行测量。即把最终浓度为0.4至4μg/ml([Ⅰ])的发明2加入到20ml的0.1M甘氨酰甘氨酸缓冲液(pH7.5)中，该缓冲液含有50mMF-1，6-P2的钠盐、0.1MF-1-P单环己基铵盐、4mg的NADH和500μg的3-磷酸甘油脱氢酶/丙糖磷酸异构酶复合物溶液。通过加入5至50μl的FPA(在衍生于牛脑的五种FPA同工型中的A4醛缩酶(A4同工型)和C4醛缩酶(C4同工型)，0.005至0.02单位)到该反应混合物中来起动该反应。从在25℃的温度条件下于340nm下每单位时间吸收度的减少来计算该反应速率(v)。从这些结果，以1/v相对于[Ⅰ]作图(Dixon曲线)并由[Ⅰ]的截距值来计算每一种情况的Ki值。
至于FPA的单位(活性单位)，1单位定义为在以上反应系统中于25℃下每分钟裂解1μmol底物的酶的量。该特异活性定义为每mg蛋白中单位的数目。
作为以上抑制活性测量的阴性对照组，通过使用硫酸软骨素A(Seikagaku公司)和硫酸软骨素C(Seikagaku公司)替代在以上实施例14中描述的发明2、2ODSH和NDSH来测量该抑制活性。
结果，发明2呈现FPA抑制活性(表15)。此外，发现发明2的抑制模式为竞争性抑制。
从这些结果上看，提示发明2能够用作有效的FPA活性抑制剂，并且因为例如其抑制糖酵解途径的代谢增进的作用，所以其可用作药物例如预防疟原虫感染的药物。
表15
注-表示“未测量”。
实施例16[药用组合物的实施例](1)注射剂(溶液剂)将发明2(钠盐)的冷冻干燥产品(30mg/ml)以最终浓度为5mg/ml溶于5％甘露醇水溶液中。将该溶液经历灭菌过滤，并且以每安瓿2ml的量充入安瓿中以生产注射剂(溶液剂)。(2)软膏剂将100mg发明2(钠盐)的冷冻干燥产品、4g矿物油、8g凡士林、60mg羟苯甲酸甲酯/羟苯甲酸丙酯混合物、1g非离子表面活性剂和30g纯化水均匀混合并充入容器中以生成软膏剂。
工业应用本发明提供了与常规修饰的肝素相比较具有相当容易被鉴定的结构、对生物体具有优良活性的并且无抗凝血活性和出血活性的新的糖胺聚糖。其也提供了用于对生物体具有活性的该糖胺聚糖的药物。
权利要求
1．具有包含糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链和具有硫酸酯基团的糖胺聚糖(其中如同通过化学二糖分析方法测定的那样，基本上未检测到结合到主链上葡糖胺残基6-位羟基基团上的硫酸酯基团，其中该糖胺聚糖用亚硝酸分解)与对硝基苯肼反应并通过高效液相色谱法分析，并且在2-位具有硫酸酯基团的糖醛酸残基的％(mol)相对于总糖醛酸残基不低于45％，该％(mol)从通过酶二糖分析方法得到的二糖组成来计算得到，在该方法中糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通过高效液相色谱法分析。
2．具有包含糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖，其中，在通过酶二糖分析方法得到的糖胺聚糖的二糖组成中，其中该糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并且通过高效液相色谱法分析，2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖的总数不多于10％(mol)，并且2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖不多于1.5％(mol)，并且有效二糖收率不少于60％。
3．权利要求2的糖胺聚糖，其中，在通过酶二糖分析方法得到的该二糖组成中，2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-D-葡萄糖、2-乙酰氨基-2-脱氧-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖和2-脱氧-2-磺氨基-4-O-(4-脱氧-2-O-磺基-α-L-苏阿-己-4-烯吡喃糖基糖醛酸)-6-O-磺基-D-葡萄糖的总数不少于45％(mol)。
4．权利要求1至3中任何一项的糖胺聚糖，其中在该糖胺聚糖的13C-NMR谱分析中，使用5％糖胺聚糖在氧化氘中的溶液并且使用3-(三甲基甲硅烷基)丙酸钠作为标准物，在66.5至67.5ppm基本上检测不到峰并且在大约100ppm至102ppm的信号强度高于大约98.3ppm的信号强度。
5．1，6-二磷酸果糖醛缩酶抑制剂，它包括如在权利要求1至4中任何一项定义的作为活性成分的糖胺聚糖。
6．药用组合物包括如在权利要求1至4中任何一项定义的作为活性成分的糖胺聚糖。
7．权利要求6的药用组合物，它为治疗组织创伤和溃疡的药物。
8．权利要求6的药用组合物，它为治疗皮肤疾病的药物。
9．权利要求8的药用组合物，其中该治疗皮肤疾病的药物为促进皮肤伤口愈合的药物或者为治疗皮肤溃疡的药物。
10．生产如在权利要求1至4中任何一项定义的糖胺聚糖的方法，该方法包括以下步骤(a)在N-甲基-N-三甲基甲硅烷基三氟乙酰胺存在下，在不低于100℃的温度下，将具有包含糖醛酸残基和葡糖胺残基的二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖的吡啶可溶的盐在吡啶中加热足够长的时间以至于如同通过化学二糖分析方法测定的那样应该基本上检测不到葡糖胺残基6-位羟基基团上结合的硫酸酯基团，在该分析方法中该糖胺聚糖用亚硝酸分解，与对硝基苯肼反应并通过高效液相色谱法分析，(b)从在步骤(a)中得到的该反应混合物中蒸发吡啶，并且(c)将水加入到在步骤(b)中得到的该反应混合物中，然后减压下于常规温度下放置该混合物。
全文摘要
提供了具有包含了糖醛酸残基和葡糖胺残基二糖重复结构的主链并且具有硫酸酯基团的糖胺聚糖,其中如同通过化学二糖分析方法测定的那样;基本上检测不到在主链上葡糖胺残基6－位羟基基团上结合的硫酸酯基团,在该方法中该糖胺聚糖用亚硝酸分解,与对硝基苯肼反应并通过高效液相色谱法分析,并且2－位具有硫酸酯基团的糖醛酸残基的%(摩尔)相对于总糖醛酸残基不少于45%,该值从通过酶二糖分析方法得到的二糖组成来计算,其中该糖胺聚糖用糖胺聚糖酶消化并通过高效液相色谱法分析。该糖胺聚糖能够用作药物的活性成分。
文档编号C08B37/00GK1286699SQ99801643
公开日2001年3月7日 申请日期1999年8月2日 优先权日1998年7月31日
发明者苅谷丰, 高野良, 龟井加惠子, 原三郎, 女屋纯一, 堀祐辅 申请人:生化学工业株式会社