多孔聚合物珠状载体高分子材料的生产装置的制作方法

文档序号:3708210阅读:458来源:国知局
专利名称:多孔聚合物珠状载体高分子材料的生产装置的制作方法
技术领域
本发明涉及一种通过单体相的相翻转悬浮聚合来生产一种珠状,交联,亲水性,对于带有亲核性基团的配体具有结合活性的混合聚合物的工艺。此外,本发明还涉及了对青霉素酰胺酶有高结合能力,且低膨胀系数的载体高分子材料以及它们的应用。
蛋白质,特别是酶的多孔高分子载体材料已被充分认识。其应用领域在医学范畴,例如借助青霉素酰胺酶使诸如青霉素G的β-内酰胺抗生素进行酶的分裂为6-氨基青霉烷酸(6-APA)。重要的发展目标首先是尽可能高的负载能力,但是也要有低膨胀率以及尽可能少的残余溶剂含量。生产时原则上应避免使用卤化溶剂。
DE-OS 2237316描述了一种通过含有自由基引发剂的单体混合物进行自由基聚合生产珠状交联的混合聚合物的工艺,该单体混合物含有一种对生物物质有结合活性的单体、一种交联用共聚单体和至少一种其它共聚单体,其中单体混合物在非极性有机液体中悬浮成滴并聚合。作为非极性有机液体特别合适的是脂肪族烃类,首选那些带8个或更多个C原子的。在实施例中使用正庚烷和四氯乙烯的混合物。单体相和连续有机相的比在1∶1和1∶10之间,但优选1∶1.5和1∶4之间的比。
DE-A 3106456描述了一种相对于DE-OS 2237316中聚合珠粒结合能力有改善的工艺。当载体高分子中交联单体含量高,和当由单体和稀释剂构成的单体相中含有溶剂混合物作为稀释剂时,可获得对蛋白质,特别是对青霉素酰胺酶特别高的结合能力。合适的混合物例如有水/甲醇或甲酰胺/甲醇。单体和稀释剂的比约为1∶2.6。有机连续相使用正己烷和四氯乙烯的混合物。实施例中单体相和连续有机相的比约为1∶2.8。单体混合物中50wt.%的交联剂组份以及应用水/甲醇作为稀释剂可得到具有作为青霉素酰胺酶活性测量的最高为125U/g的结合能力的载体高分子。
本发明的主题基于生产珠状,交联的混合聚合物的改进工艺。对此应放弃在有机连续相中使用卤化溶剂,同时在标准化条件(1g载体高分子材料负载1530个单位青霉素酰胺酶)达到至少220[U/g湿态]的对青霉素酰胺酶(EC 3.5.1.11)的结合能力。此外,聚合物珠在水中的膨胀率以膨胀系数表示(ml湿态/ml干态)的值不高于1.5。
解决此主题是通过一种由单体和稀释剂组成的单体相的翻转珠状聚合来生产珠状、交联、亲水的、相对于带亲核基团的配体具有结合活性的混合聚合物的工艺,其中作为单体含有a)5-40wt.%亲水性可自由基聚合的含乙烯基单体,室温下构成至少10%的水溶液,b)30-50wt.%可自由基聚合含乙烯基并附加官能基团的单体,它能在与配体的亲核基团发生类似聚合物的反应中引入共价键,c)20-60wt.%亲水性,交联,可自由基聚合的带两个或多个烯类不饱和可聚合基团的单体,并且附加一点,a)、b)和c)加入量总和为100wt.%,作为稀释剂使用甲醇和水的比为1∶1.0至1∶4.0的混合物,其中单体相在5-7个碳原子的脂肪族烃的有机溶剂组成的连续相中分散成滴状,单体相和连续相的比为1∶2.0至1∶4.0,这样在聚合引发剂和保护胶体存在下进行自由基聚合,并且单体和稀释剂的比为1∶1.7至1∶2.4。
应用本发明的工艺可得到一类新的载体高分子材料,它对青霉素酰胺酶的负载能力至少为220[U/g湿态],来自于1530个单位的青霉素酰胺酶与1g载体高分子材料的反应,膨胀系数至多为1.5。
不可预料的是,确定彼此不同的工艺参数会明显提高对青霉素酰胺酶的结合能力,但同时膨胀率下降。也令人惊喜的是,应用本发明的工艺,通过选择带5-7个碳原子的脂肪烃类有机溶剂,能放弃使用卤代烃,例如四氯乙烯,它目前为止主要用于相的密度平衡。
单体为保证单体混合物的亲水性,它的主要部分必须由亲水性单体组成。所谓的亲水性单体是指那些在室温下至少形成10%的水溶液,优选不含离子基团或不含通过加入酸或碱可离子化基团的单体。
单体a)是5-40,8-35,特别是9-12wt.%的亲水性可自由基聚合的带乙烯基的单体,它们在室温下形成至少10wt.%的水溶液。
作为单体a)特别合适的是丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺,其中优选甲基丙烯酰胺。其他的例子有不饱和可聚合羧酸的羟基烷基酯,如丙烯酸羟乙酯和甲基丙烯酸羟乙酯或N-乙烯基吡咯烷酮。
单体b)是30-50,优选35-45wt.%的可自由基聚合的带乙烯带和附加官能基团,优选环氧乙烷基团(环氧基团)的单体,它能在与配体的亲核基团发生类似聚合的反应中引入共价键。环氧乙烷基团特别适于连接配体得到生物活性。
优选的单体b)是甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或烯丙基缩水甘油醚。特别优选两种单体以大约同样的量同时使用。
单体c)是20-60,特别是25-55,特别优选40-55wt.%的亲水性,可交联,自由基聚合的带两个或多个烯类不饱和可聚合基团的单体。
优选的单体c)是N,N'-亚甲基-二(丙烯酰胺)或N,N'-亚甲基-二(甲基丙烯酰胺)。特别优选N,N'-亚甲基-二(甲基丙烯酰胺)。同样也可能使用0-10wt.%其它种交联,可自由基聚合的,带两个或多个烯类不饱和可聚合基团的单体。合适的是亲水性二(甲基)丙烯酸酯,例如聚氧化乙烯-二(甲基)丙烯酸酯。
单体a),b)和c)相加总量为100wt.%。
稀释剂单体相由单体a)-c)组成,它们溶解在必须是甲醇和水以1∶1.0至1∶40配比的混合物的稀释剂中。甲醇和水特别有利的混合比是1∶1.2至1∶2.5,特别是1∶1.3至1∶1.7。
单体和稀释剂的比单体和稀释剂的比特别严格。它必须在1∶1.7至1∶2.4的范围内,特别优选在1.9至2.1范围内。
连续相作为连续相合适的带4至7个C原子的脂肪烃有机溶剂。优选正庚烷,特别优选环己烷。
单体相/连续相的比单体相和连续相通过有机溶剂构成的比必须是1∶2.0至1∶4.0,优选1∶2.8至1∶3.3之间。
其它的工艺条件作为其它组分,悬浮的单体相含有以已知方法的聚合引发剂,优选无硫引发剂,特别优选4,4'-偶氮-二(4-戊酸),以及保护胶体(乳化剂),例如分子量(重均)为30,000至80,000的由95份甲基丙烯酸正丁酯和5份甲基丙烯酸-2-三甲基铵乙酯氯化物的混合聚合物。
此外珠状聚合(也称作悬浮聚合)按已知方法实施,通过例如先加入连续相和保护胶体,也存在引发剂的单体相在例如40-60℃下借助搅拌分散在有机相中,然后升温至60-70℃。水/甲醇混合物可以例如在近似完全共沸状态下保持多于6小时。混合料约反应3-5小时结束,然后冷却至室温。将形成的珠粒吸引出,例如真空干燥12小时,也可将珠状聚合物过滤,用水洗。优选在流化床干燥器内干燥,因为这样可特别有效地排除溶剂残余物。所得的聚合物珠(载体高分子材料)的大小为50-500μm,特别是120-250μm。所谓的结合能力是指酶的活性,它在载体高分子材料对某种酶的最大负载量下达到。本发明的载体高分子材料的重要应用领域是青霉素G借助E.coli的已结合的青霉素酰胺酶分裂为6-氨基青霉烷酸(6-APA)。结合能力作为青霉素酰胺酶的活性表示为每克载体聚合物珠上的单元数[U/g湿态]。本发明的载体高分子珠的结合能力按这种测量方法至少为220[U/g湿态]。
聚合物珠在水中的膨胀率通过膨胀系数[ml湿态/ml干态]表示。本发明的载体高分子珠的膨胀系数不大于1.5。
本发明的载体高分子材料可以用于在搅拌或连续流动反应釜中借助已有的环氧乙烷基团共价键合配体。这例如通过共价键从浓溶液中吸附蛋白质,特别是酶,在保持生物活性不变的情况下进行。此外,肽,氨基酸,β-内酰胺抗生素,脂类,核苷酸,多元核苷酸,低分子量亲核化合物或金属有机化合物也可与载体珠的环氧乙烷基团反应。
载有配体的聚合物珠可用于按已知方法立构专一性地合成手性物质,如氨基酸(d-苯基丙氨基,p-羟基-d-苯基丙氨酸,1-叔-白氨酸)或药物,例如异丁苯丙酸。同样,它们也作为青霉素G酶分裂为6-氨基青霉烷酸(6-APA),头孢菌素酶G分裂为7-氨基去乙酰基头孢菌素酸(7-ADCA)或头孢菌素C酶分裂为7-氨基头孢菌素酸(7-ACA)中的载体使用。本工艺的介绍参见已注册协会DECHEMA的1996年DECHEMA年会摘要,第一册。其它的应用领域是底物的专一性酶合成,例如上述分裂为羟氨苄青霉素和氨苄青霉素的产物。另外的应用领域是合成用于化学合成的纯化学品或基本产物(例如苹果酸)。聚合物珠也用于吸附色谱或凝胶渗透色谱的分离技术中。用于专一性吸附的聚合物珠负载抗血清的免疫球球蛋白组分或单克隆抗体。作为其它的使用领域有,使用负载酶或抗体的载体高分子材料作为体外疗法中从全血中排除血病原物质或有毒物质的吸附材料。
实施例(下面的测定方法对多孔载体高分子材料领域的专业人员是常用的,只是从完备性考虑只部分列出)E.coli的青霉素酰胺酶(=青霉素G-酰胺酶)的结合能力的测定(EC 3.5.1.11)a)载体高分子材料上青霉素酰胺酶的共价键合1g载体高分子材料加到5ml消毒的1M磷酸钾缓冲液(pH7.5)中的1530个青霉素酰胺酶单元,在23℃孵化48小时。
然后,聚合物珠加到烧结玻璃漏斗(孔隙率2或3)并用去离子水洗两次,接着用0.1M含0.05%4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲液(pH7.5)借助漏斗的抽吸洗两次。对所得的负载青霉素酰胺酶的珠的湿重加以测定。b)结合能力的测定250-300mg湿的用青霉素酰胺酶偶联的载体高分子材料(聚合物珠)加入37℃ 20ml 2%青霉素-G在0.05M pH7.5的,含0.05% 4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲液中的溶液。在均匀的搅拌下用0.5MNaOH滴定产生的游离苯基醋酸,保持pH值恒定在7.8约10分钟,记录NaOH的消耗量。
然后,聚合物珠如a)中一样借助从20ml 0.05M pH为7.5的,含0.05% 4-羟基苯甲酸乙酯的磷酸钾缓冲溶液中通过玻璃漏斗抽吸得到,这种测定重复两次。c)结合能力的计算测量曲线的线性范围(通常范围为1-5分钟)作为计算的基础并外推到10分钟的间隔。结合能力作为每克湿载体高分子材料的青霉素酰胺酶单位(U/g湿态)来说明。一个单位相应于每分钟μmol氢化青霉素G(μmol/min),这里110.5M NaOH与550μmol氢化的青霉素G相当(载体高分子材料的含水量大约恒定,因此忽略。)
下表列出了实施例1-3的重要实验参数和结果。
权利要求
1.一种通过由单体和稀释剂组成的单体相的相翻转珠状聚合生产珠状、交联、亲水性、对带亲核基团的配体有结合性的混合聚合物的工艺,其中含有的单体是a)5-40wt.%亲水性可自由基聚合的带乙烯基的单体,它在室温形成至少10%的水溶液,b)30-50wt.%可自由基聚合的带乙烯基和附加的官能基团的单体,它能在与配体的亲核基团发生类似聚合的反应过程中引入共价键,c)20-60wt.%可交联自由基聚合的带两个或多个乙烯类不饱和可聚合基团的单体,并且,a),b)和c)相加量总计为100wt.%,作为稀释剂使用甲醇和水以1∶1.0至1∶4.0配比的混合物,这里,单体相在带5-7个碳原子的脂肪族烃的有机溶剂形成的连续相中分散成滴状,其中单体相和连续相的比为1∶2.0至1∶4.0,这样在聚合引发剂和保护胶体存在下进行自由基聚合,并且单体和稀释剂的比为1∶1.7至1∶2.4。
2.权利要求1的工艺,其特征为,作为单体使用a)丙烯酰胺和/或甲基丙烯酰胺b)甲基丙烯酸缩水甘油酯和/或烯丙基缩水甘油醚c)亚甲基-二丙烯酰胺或亚甲基-二甲基丙烯酰胺。
3.权利要求1的工艺,其特征为,作为有溶剂使用环己烷。
4.按权利要求1至3中一项或多项的工艺可生产的载体高分子材料,其特征为,对E.coli的青霉素酰胺霉的结合能力至少为220[U/g,湿态],源于1530个单位的青霉素酰胺酶和1g载体高分子材料的反应,且其膨胀系数至多为1.5。
5.权利要求4的载体高分子材料的用途,用于结合蛋白质。
6.权利要求5的载体高分子材料的用途,用于结合酶。
7.权利要求5的载体高分子材料的用途,用于结合抗体。
8.权利要求4的载体高分子材料的用途,用在色谱中。
9.权利要求4的载体高分子材料的用途,用于合成药物。
10.权利要求4的载体高分子材料的用途,用于手性物质的立构专一性合成。
全文摘要
本发明涉及一种通过单体相的相翻转珠聚合来生产珠状,交联,亲水性,对带亲核基团的配体有结合活性的混合聚合物。本发明涉及对青霉素酰胺酶有高结合性的且低膨胀系数的载体高分子材料以及它们的应用。
文档编号C08F2/32GK1291200SQ99802632
公开日2001年4月11日 申请日期1999年2月1日 优先权日1998年2月5日
发明者C·梅尔, T·苏夫科, H-U·派特里持, R·莱克坦沃德, T·鲍勒 申请人:罗姆有限公司
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