紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检测试剂的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及紫杉醇免疫原、抗紫杉醇特异性抗体和紫杉醇检 测试剂。
【背景技术】
[0002] 紫杉醇（Paclitaxel)，其结构式如式（III)所示：
[0003]
【主权项】
1. 一种紫杉醇免疫原，其结构式如式（I )所示：
式中，R为连接基团-CO-(CH2)n-COO-, η是1至20之间的整数，优选R 为-CO-(CH2)2-C00-;载体为具有免疫原性的蛋白质或多肽，选自血清蛋白、血蓝蛋白或甲 状腺球蛋白中的一种，优选为血清蛋白，更优选为牛血清白蛋白。
2. -种如权利要求1所述的紫杉醇免疫原的制备方法，其特征在于包含以下步骤： ⑴将载体蛋白200mg溶解于50ml 0· 2M，pH 8. 5的磷酸缓冲液中； (2) 将如下化学品加入到小烧杯中搅拌溶解：200mg紫杉醇衍生物、3. 5ml二甲基甲酰 胺、3.5ml乙醇、7. Oml 10mM，pH 5.0的磷酸钾缓冲液、200mg 1-乙基-3-(-3-二甲氨丙基） 碳二亚胺、50mg N-羟基硫代琥珀酰亚胺，将这些化学品在室温下搅拌溶解反应30min ; (3) 将溶解好的溶液滴加至载体蛋白溶液中，并在2?8°C下搅拌过夜，得到抗原；将合 成好的抗原经过透析进行纯化，得到紫杉醇免疫原。
3. 根据权利要求2所述的紫杉醇免疫原制备方法，其特征在于所述的紫杉醇衍生物结 构式如式（II )所示：
上述R为连接基团-CO-(CH2)n-COO-, η为1至20之间的整数，优选η = 2。
4. 根据权利要求2-3任一项所述的紫杉醇衍生物，其特征在于由以下步骤合成： (1) 称取Ig紫杉醇、2g化合物A加入反应体系中，然后用20ml吡啶或者干燥的苯在连 续回流的玻璃烧瓶中进行孵育； (2) 将此反应混合物在70-80°C的回流温度下持续加热6小时，然后将反应混合物缓慢 冷却至室温，轻轻倒去多余的吡啶或苯； (3) 将剩余的有机成分在负压条件下持续通入氮气流使其蒸发干燥，得到干燥残留产 物； (4) 将步骤（3)得到的产物用蒸馏水配制的60%乙醇冲洗10次以上，获得重结晶物质 即为紫杉醇衍生物。 所述的化合物A为含有3-22个碳原子的烷二酸或相应的酸酐，优选为丁二酸酐。
5. -种抗紫杉醇特异性抗体，由权利要求1-2任意一项所述的紫杉醇免疫原免疫实验 动物后产生的完整抗体分子，或者为保留与紫杉醇特异性结合能力的抗体片段或抗体衍生 物。
6. 根据权利要求5所述的一种抗紫杉醇特异性抗体，其特征在于所述的完整的抗体分 子、抗体片段或抗体衍生物，为采用单一的紫杉醇免疫原对动物加强免疫所获得的多克隆 抗体，或者为免疫后经体细胞杂交获得的单克隆抗体；所述的实验动物为兔、山羊、小鼠、绵 羊、豚鼠或马的一种，优选为兔。
7. -种如权利要求5-6中任一项所述的抗紫杉醇特异性抗体的制备方法，其特征在于 包含以下步骤： (1) 用PBS将牛血清白蛋白-紫杉醇免疫原稀释至I. Omg/ml，得到抗原溶液，然后用 I. Oml抗原溶液与弗氏完全佐剂混合，对实验动物进行注射； (2) 2?3周后，再用I. Oml相同的抗原溶液与弗氏不完全佐剂对上述实验动物注射一 次，之后每隔四周注射一次，共计注射4次； (3) 对步骤（2)的实验动物取血，分离纯化得到效价为1:30000-1:50000的抗紫杉醇特 异性抗体。
8. -种紫杉醇检测试剂，含有权利要求5-7所述的抗紫杉醇特异性抗体和指示试剂， 所述的指示试剂选自酶试剂、放射性同位素试剂、荧光试剂或发光试剂中的一种，优选为酶 试剂；所述的酶试剂由紫杉醇酶标偶联物和酶底物组成，酶标偶联物优选为葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶-半抗原酶标偶联物，酶底物优选为葡萄糖-6-磷酸。
9. 一种如权利要求8所述的紫杉醇检测试剂的制备方法，其特征在于包含以下步骤： (1) 试剂A :将4. 036g、ll. 25mM氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸和I. 711g、ll. 25mM葡 萄糖-6-磷酸用IL 55mM、pH = 8. O的Tris缓冲液溶解制成均相酶底物；将权利要求5-7 中任一项所述的抗紫杉醇特异性抗体加到上述均相酶底物中，抗紫杉醇特异性抗体与均相 酶底物的体积比为1:100?1:10000 ; (2) 试剂B :将紫杉醇酶标偶联物加到120mM、pH = 8. 2的Tris缓冲液中，紫杉醇酶标 偶联物与Tris缓冲液的体积比为1:100?1:10000 ; 所述的抗紫杉醇特异性抗体与均相酶底物的体积比优选为1:400 ; 所述的紫杉醇酶标偶联物与Tris缓冲液的体积比优选为1:1500。
10. 根据权利要求8-9任一项所述的紫杉醇检测试剂，其特征在于所述的紫杉醇酶标 偶联物的制备方法包含以下步骤： (1)葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液的制备：称取15mg规格为100KU的葡萄糖-6-磷酸脱 氢酶，室温溶解于 12mL 含有 72.6mg 0.05M Tris、8mg 3.3mM MgClJPlOOmg NaCl 的溶液 中，pH = 9. 0 ;在溶液中加入225mg还原态的烟酰胺腺嗓呤二核苷酸、135mg葡萄糖-6-磷 酸以及0. 75mL卡必醇；再逐滴加入2mL二甲基亚砜； ⑵紫杉醇衍生物的激活：在无水状态下称取IOmg紫杉醇衍生物，溶解于600 μ L二甲 基甲酰胺中；使上述溶液温度降到-2?_8°C ;加入3 yL三丁胺；加入1.5 yL氯甲酸异丁 酯；-2?-8 °C搅拌30分钟； (3) 葡萄糖-6-磷酸脱氢酶与紫杉醇衍生物的连接：将步骤（2)激活的紫杉醇衍生物 溶液逐滴加入到步骤（1)溶解的葡萄糖-6-磷酸脱氢酶溶液中；2-8°C搅拌过夜； (4) 纯化产物：通过G-25凝胶层析柱纯化连接产物，获得的最终产物为葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶-半抗原偶联物，于2-8 °C下储存。
【专利摘要】本发明公开了一种紫杉醇免疫原及其合成方法，以及由该免疫原获得的抗紫杉醇抗体、检测试剂及其制备方法。本发明制备的紫杉醇免疫原，免疫原性高，可以诱导得到高效价的抗紫杉醇特异性抗体，并且与常见的62种药物无任何交叉反应；由该抗体制备得到的紫杉醇检测试剂，可以精确快速地确定样品中的紫杉醇含量。与市场上现有的检测试剂比较，本发明检测试剂具有操作简便、灵敏度高、特异性强、结果准确等优点，还能有效降低紫杉醇检测成本，有利于临床大规模推广使用。
【IPC分类】G01N33-577, C07K14-795, C07K14-47, C07K16-44, C07K14-765, G01N33-535
【公开号】CN104530222
【申请号】CN201410799415
【发明人】虞留明, 张华 , 涂建成, 李冬, 唐燕
【申请人】苏州博源医疗科技有限公司
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月20日