盐地碱蓬rav基因及包括该基因的重组载体的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于分子生物学和生物技术领域。涉及一种盐地碱蓬基因及包括该基因的 重组载体。
【背景技术】
[0002] 土壤盐渍化是世界农业生产面临的严重问题之一，盐胁迫是限制植物生长发育的 重要因子。随着近年来国家对盐碱地的开发和利用日益重视，对抗盐基因的分离与功能研 宄成为生物学的热门研宄方向。创制耐盐作物品种是在环球工业化大背景下取得粮食产量 稳定持续增长的重要手段之一，但是由于缺乏对作物耐盐的分子机理以及与耐盐有关基因 的了解，阻碍了耐盐作物的培育。随着对植物盐胁迫应答的分子机理研宄不断深入，特别是 以拟南芥为研宄对象，植物在盐胁迫条件下的离子平衡和耐盐反应调节途径的研宄取得了 突破性的进展。目前，对抗盐基因的分离和应用是当前利用基因工程方法进行抗盐作物培 育的首要任务。
[0003] 盐地碱蓬（Suaedasalsa，简称S.sa)又名翅碱蓬、黄须菜，为藜科 (Chenopodiaceae) -年生草本真盐生植物，肉质化真盐生植物，生长于海涂或盐场的盐滩 之上，具有耐盐碱、耐旱、耐涝等特性。盐地碱蓬在我国分布极为广泛，多数生于滨海洼地以 及渠岸或田边轻度盐碱化土壤，具有抗盐碱和耐海水的特点，是广阔滩涂土地的一种指示 植物。盐地碱蓬在改善并利用盐碱地、降低土壤盐分、减少土壤水分蒸发、促进植物抗盐机 制研宄、提供抗盐种质资源和抗盐基因工程等方面有着非常重要的意义。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种盐地碱蓬RAV基因。
[0005] 本发明的第二个目的是提供盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质。
[0006] 本发明的第三个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的重组载体。
[0007] 本发明的第四个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞。
[0008] 本发明的第五个目的是提供含盐地碱蓬RAV基因的用途。
[0009] 本发明的技术方案概述如下：
[0010] 盐地碱蓬RAV基因，是SEQIDNo. 1所示的核苷酸序列。
[0011] 盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，是SEQIDNo. 2所示的氨基酸序列。
[0012] 含盐地碱蓬RAV基因的重组载体，含有盐地碱蓬RAV基因。
[0013] 含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，将含盐地碱蓬RAV基因的重组载体导入到农杆 菌菌株中，得到转化宿主细胞。
[0014] 盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。
[0015] 实验证明，含盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐的功能得到了明显的提 升。
【附图说明】
[0016] 图1盐地喊逢RAV基因克隆电泳不意图。
[0017] 图2盐地碱蓬RAV插入表达载体pK2GW7 (I)后示意图。
[0018] 图 3pK2GW7 (I)_S.saRAV转化C58 农杆菌后PCR结果。
[0019] 图4pK2GW7Q_S.saRAV转化拟南芥后，T3纯合体半定量PCR测定表达水平结果。
[0020] 图5盐地碱蓬RAV转基因拟南芥T3纯合体抗盐实验效果照片。其中的1为未经 盐水处理野生型拟南芥；2是用lOOmMNaCl处理野生型拟南芥；3是用lOOmMNaCl处理RAV 低表达量拟南芥；4是用lOOmMNaCl处理RAV高表达量拟南芥。
[0021] 图6盐地碱蓬RAV转基因杨树半定量PCR测定表达水平结果。
[0022] 图7盐地碱蓬RAV转基因杨树抗盐实验效果。其中的1为未经盐水处理野生型杨 树；2是用lOOmMNaCl处理野生型杨树；3是用lOOmMNaCl处理RAV低表达量杨树；4是用 lOOmMNaCl处理RAV高表达量杨树。
【具体实施方式】
[0023] 实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条 件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0024] 下面通过具体实施例对本发明作进一步的说明，本发明的实施例是为了使本领域 的技术人员能够更好地理解本发明，但并不对本发明作任何限制。
[0025] 实施例1
[0026] 1.盐地碱蓬RAV基因的克隆：（盐地碱蓬简称S.sa)
[0027] 从五周盐地碱蓬整株幼苗（取自天津市滨海新区北塘口东海路沿线）中， 使用植物RNeasyPlantMiniKit(TransgeneCode#EP101_0150rxns)提取总 RNA，并且利用EasyScriptFrist-StrandcDNASynSgesisSuperMix(Transgene Code#AE301-03100rxns)反转录出cDNA。根据NCBI数据库中的RAV基因序列保守区设计 简并引物SEQIDNo. 3 :
[0028] 5,-GTCGTCAAAATTCAAAGGCGT-3,和SEQIDNo. 4 :
[0029]5'-CTGCATATTTCTTGGGTATCTCA-3'，然后利用RACE-PCR技术 (Introgen,FirstChoice?RLM_RACEKitwithManual)获得盐地喊蓬RAV基因全长cDNA序 列，其具体步骤如下：
[0030] l)cDNA第一链的合成
[0031] 用反转录试剂盒TaKaRaRNAPCRKit(AMV)Ver. 3. 0,以盐地碱蓬总RNA为模板， Oligo(dT)为引物，在AMV逆转录酶的作用下合成cDNA第一链，反转录体系如下：
[0032]
【主权项】
1. 盐地碱蓬RAV基因，其特征是SEQ ID No. 1所示的核苷酸序列。
2. 权利要求1的盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，其特征在于所述蛋白质是SEQ ID No. 2所示的氨基酸序列。
3. 含盐地碱蓬RAV基因的重组载体，其特征在于含有权利要求1所述的盐地碱蓬RAV 基因。
4. 含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，其特征是将含盐地碱蓬RAV基因的重组载体导入 到农杆菌菌株中，得到转化宿主细胞。
5. 盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。
【专利摘要】本发明公开了一种盐地碱蓬RAV基因及包括该基因的重组载体，盐地碱蓬RAV基因，是SEQ ID No.1所示的核苷酸序列。盐地碱蓬RAV基因编码的蛋白质，是SEQ ID No.2所示的氨基酸序列。含盐地碱蓬RAV基因的重组载体含有盐地碱蓬RAV基因。含盐地碱蓬RAV基因的宿主细胞，是将含盐地碱蓬RAV基因的重组载体导入到农杆菌菌株中，得到转化宿主细胞。盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐性能的用途。实验证明，含盐地碱蓬RAV基因增强杨树或拟南芥耐盐的功能得到了明显的提升。
【IPC分类】C07K14-415, C12N15-84, C12N1-21, A01H5-00, C12N15-29
【公开号】CN104531722
【申请号】CN201510022757
【发明人】王洁华, 魏志蓉, 罗翠, 王蕊, 杨少辉
【申请人】天津大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2015年1月16日