Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于肿瘤分子生物学的技术领域，具体涉及Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质 粒及其应用方法。
【背景技术】
[0002] Dystrophin(肌营养不良蛋白）基因是哈佛大学Kunkel教授在1986年通过定位 克隆技术克隆出来的，定位于人类Xp21. 1-21. 3,引起杜氏肌营养不良的致病基因。Dp71是 Dystrophin在非肌肉组织中表达最广泛的一类剪切本，它是由Dystrophin基因从位于62 号外显子和63号外显子中的启动子区始动基因的转录，翻译的蛋白。关于Dp71的研宄表 明，在胚胎发育的多能干细胞中可以检测到Dp71的表达，Dp71是胚胎发育期间首批可以检 测到的该基因家族成员。近年来的研宄表明：Dp71除了分布在细胞膜外，还在细胞核和细 胞浆内有一定量的表达。Dp71不同剪切本蛋白的研宄及其DAPC复合物在核内定位的证实 表明Dp71蛋白还具有更多的生物学功能涵待研宄。
[0003] 近年来，关于Dp71的研宄主要集中于PC12细胞，Dp71表达量的改变对于其他细 胞的生物学功能有何影响，尚没有任何研宄。PC12细胞的细胞核组成研宄表明，Dp71和核 纤层蛋白B，核膜蛋白emerin结合，形成细胞核相关结构，敲除Dp71可抑制PC12细胞的 增殖。Dp71还参与PC12细胞的细胞黏附等生物学行为。本发明通过使用Dp71发夹干扰 RNA(shRNA)质粒，转染A549肺腺癌细胞系，建立Dp71稳定削减的肺癌细胞系，通过研宄发 现，A549-Dp71AS细胞系表现为细胞增殖减慢，克隆形成率减低，浸润与侵袭能力下降。裸 鼠A549异体移植瘤实验结果显示，和转染了空白质粒的A549细胞株和空白A549细胞株相 比，A549-Dp71AS细胞系裸鼠异体移植成瘤率大大降低。本发明从细胞功能学水平和在体 动物水平证实了，削减A549肺腺癌细胞中的DP71蛋白的表达，可以从离体和在体水平降低 A549细胞的恶性度，抑制A549细胞体外的成瘤能力。
【发明内容】
[0004] 本发明的目的是通过探讨Dp71蛋白削减A549细胞在体与离体的生物学特性，进 而构建一种Dp71蛋白的发夹短发夹RNA干扰质粒，用于制备抑制肺癌的制剂。
[0005] 一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71 蛋白表达的siRNA的DNA片段，插入到短发夹RNA干扰载体中构建而成。
[0006] 上述质粒以人Dp71的mRNA序列为模板，以及载体启动子启动表达SiRNA对序列 的要求，设计合成能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段。
[0007]siRNA干扰的目标基因Dp71序列如下：
【主权项】
1. 一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，根据Dp71的序列设计能够产生 干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，插入到短发夹RNA干扰载体中构建而成。
2. 根据权利要求1所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于， 以人Dp71的mRNA序列为模板，以及载体启动子启动表达siRNA对序列的要求，设计合 成能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段。
3. 根据权利要求2所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，siRNA干扰 的目标基因Dp71序列如下： siRNA-1 ：CTTTAGCTGACCTGAATAA ； siRNA-2 ：GCACTTTAATTATGACATC ； siRNA-3 ：CCATGGATATCCTGCAGAT〇
4. 根据权利要求3所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，siRNA干扰 目标基因 Dp71 序列为 siRNA-2 :GCACTTTAATTATGACATC。
5. 根据权利要求3所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，选用的原始 质粒表达载体为PRNAT-U6. 1/Neo。
6. 根据权利要求5所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，DNA片段插 入到载体时的酶切位点为BamH I和Hind III。
7. 根据权利要求6所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于， 根据Dp71的序列设计能够产生干扰Dp71蛋白表达的siRNA的DNA片段，具体序列如 下： Dp71-shRNA-la 链序列： 5 ' -GATCCCGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGACTTTTTGGAT-3 ' Dp71-shRNA-lb 链序列： 5 ' -AGCTATCCAAAAAGTCTTTAGCTGACCTGAATAACTCGAGTTATTCAGGTCAGCTAAAGAC GG-3， Dp71-shRNA-2a 序列： 5 ' -GATCCCAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTTTTTTTGGAT-3 ' Dp71-shRNA-2b 序列： 5 ' -AGCTATCCAAAAAAAGCACTTTAATTATGACATCCTCGAGGATGTCATAATTAAAGTGCTTGG-3， Dp71_shRNA_3a 序列： 5 ' -GATCCCGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGCTTTTTGGAT-3 ' Dp71_shRNA_3b 序列： 5' -AGCTATCCAAAAAGCCCATGGATATCCTGCAGATCTCGAGATCTGCAGGATATCCATGGGC GG-3'。
8. 根据权利要求7所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，构建的三个 Dp71短发夹干扰质粒载体的序列见SEQ NO: 12-14。
9. 根据权利要求8所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒，其特征在于，构建的优选 短发夹干扰质粒载体的序列见SEQ NO: 13。
10. 权利要求1-9任一项所述的Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒的应用方法，其特征 在于，用于制备抑制肺癌的制剂。
【专利摘要】本发明公开了一种Dp71蛋白的短发夹RNA干扰质粒及其应用方法。首次成功构建了Dp71蛋白的短发夹RNA(Dp71-shRNA)干扰质粒，将其转染至肺腺癌细胞株A549中，构建稳定转染Dp71-shRNA质粒的细胞株。发现削减A549细胞中的Dp71蛋白可以抑制A549细胞的增殖，浸润，侵袭迁移，在体肺腺癌细胞株裸鼠移植动物模型也证实，削减A549细胞中的Dp71蛋白的表达，可以从在体水平抑制A549移植瘤的生长。而且发现削减Dp71蛋白的表达可能是通过降低laminB1,Bcl-2和MMP-2蛋白来达到抑制A549细胞的恶性程度。本发明将为肺癌的治疗提供新线索和途径，具有重大意义。
【IPC分类】C12N15-85, A61P35-00, A61K31-7088, A61P11-00
【公开号】CN104531760
【申请号】CN201410829769
【发明人】谭斯品, 谭思创, 陈志康, 谭晶, 文俏程
【申请人】中南大学
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年12月26日