一种快速灵敏的恶性疟原虫检测方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及体外诊断试剂技术领域，具体涉及一种快速灵敏的恶性疟原虫检测方 法。
【背景技术】
[0002] 疟疾是最严重的全球性公共健康问题之一，世界上超过一半的人口生活在疟疾流 行区。近年来我国输入性疟疾呈逐年上升趋势，2011年全国27个省（市、区）报告病例 数4479例，输入病例占66. 4%，死亡病例33例。湖南省报告148例，主要为恶性疟原虫 (Plasmodiumfalciparum,P.f)和间日痕原虫（Plasmodiumvivax，P.v)感染。目前我国仍 采用显微镜检法作为诊断疟疾的"金标准"，显微镜检法受镜检人员的主观判断及责任心影 响，极容易漏诊，延误治疗。为提升对疟疾病例的实验室复核和确诊能力，近年来以PCR为 基础的分子生物学诊断技术发展迅速。污染风险低、灵敏度及特异性高的Real-timePCR 需要昂贵的仪器及试剂，难以在基层疾控部门推广。
[0003] 以PCR技术为代表的分子生物学手段是现在广泛应用于疟原虫快速检测的技术。 而由PCR技术发展起来的实时荧光PCR技术以及基因芯片技术等是目前在疟原虫检测中使 用最广泛的分子生物学方法。实时荧光PCR技术是一种新的PCR方法，是在常规PCR反应 的基础上增加了能与扩增模板特异性结合的探针，与传统PCR相比，该方法无需对PCR产物 进行再处理，完全是在封闭状态下完成检测的全过程，具有实时、准确、快速等特点，但是由 于对设备要求较高，对工作人员的操作技术难度大，所以不适合快速，准确的检测。
[0004] 基因芯片是20世纪90年代发展起来的全新的微量分析技术，它采用微加工和微 电子技术将大量的人工设计好的基因片段有序地、高密度地排列在玻璃片或纤维膜等载体 上而得到的一种信息检测芯片。基因芯片可以同时固定大量的探针分子，理论上可以在一 次实验中检出所有潜在的致病原，也可以用同一张芯片检测某一致病原的各种遗传学指 标，这为平行检测多个菌种或同菌种内多个菌株提供了一条便捷的途径；同时检测的灵敏 度、特异性和快速便捷性也很高，因而在致病原分析检测中有很好的发展前景。
[0005] 基因芯片技术利用待检测样品的基因组序列设计针对各种微生物的特异探针，将 该探针（寡核苷酸）点样于芯片表面，同时在探针两侧设计PCR引物，在引物合成过程中对 其5'端进行荧光标记或在PCR过程中加入荧光标记的dNTP，这样利用PCR扩增的方法即可 得到标记有荧光染料的待检测靶标，然后用含有待检测样品特异探针的微阵列芯片与标记 的靶标杂交，荧光标记的DNA分子与芯片上相匹配的DNA序列发生杂交反应，使得芯片上的 点呈现出荧光信号，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某 些特定疟原虫。
[0006] 当前用于疟原虫检测的基因芯片检测已经有些应用于研宄，但是这些基因芯片的 探针点样多采用手工模式，操作复杂，并且增加了很多假阳性的机会。
[0007] 本发明整合了聚合酶链式反应（PCR)和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把 PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上。PCR反 应结束后可以直接加入杂交液进行杂交，操作简单，节省时间，另外灵敏度可以达到几十个Copy的DNA分子。
[0008] 本发明的检测方法可运用于恶性疟原虫快速灵敏的检测，作为血清学试验及镜检 法的可靠补充，提高检测的准确性和时效性，可大大地降低检测的周期。
【发明内容】
[0009] 本发明所要解决的技术问题是提供一种快速、灵敏的恶性疟原虫检测方法，本发 明能对恶性疟原虫基因进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检 验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的 阳性漏检问题，从而最大限度地防止疫情的发生和国外疟疾的传入。
[0010] 本发明针对恶性疟原虫特有基因，设计引物，在引物扩增区内设计能够区别其他 疟原虫及亲缘关系较近的物种的特异性探针，通过探针特异性验证、探针灵敏度实验、方法 特异性实验等证明该方法可以特异检测恶性疟原虫，与常规PCR方法比较，检测灵敏度明 显高于常规方法多重PCR扩增产物的检测最低检出限，不仅可以满足日常疫情安全检测的 要求，甚至可以满足临床样品的检测要求。
[0011] 本发明所提供的快速、灵敏的恶性疟原虫检测方法，包括如下步骤：
[0012] (1)血液样本DNA液提取；
[0013] (2)PCR扩增：
[0014] a.PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液，待测基因特异性正、反向引物，PCRGrade H20,PCRControl,DNA提取液；
[0015] b.将PCR反应液加入已含有待测基因特异性探针的芯片内，将芯片放入反应室内 进行扩增反应；所述的特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计，能够区别其他物种。特 异性探针点入芯片上。
[0016] 所述的待测基因为恶性疟原虫特有基因，分别是mdr基因、crt基因和18SrRNA基 因。
[0017] (3)杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂 交舱内杂交反应；
[0018] (4)清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测；
[0019] (5)结果判读。
[0020] 步骤（1)中所述的DNA提取可使用血液样本基因组DNA提取试剂盒提取DNA;取 50uL全血样本，按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA;
[0021] 步骤⑵中特异性引物和探针分别为：
[0022] mdr基因
【主权项】
1. 一种快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：包括如下步骤： (1) 血液样本进行DNA液提取； (2) PCR 扩增： a. PCR反应体系包括：PCR反应缓冲液，待测样本基因特异性正、反向引物，PCR Grade H20, PCR Control, DNA提取液； b. 将PCR反应液加入已含有待测基因特异性探针的芯片反应室内内，将芯片放入机器 进行扩增反应；特异性探针是根据特异性引物扩增区内设计，能够区别其他物种；特异性 探针点入芯片上； (3) 杂交：PCR扩增完后，将杂交反应液加入芯片，使杂交液和扩增液都进入到杂交舱 内杂交反应； (4) 清洗：杂交后的芯片用洗液冲洗，直接用荧光扫描仪检测； (5) 结果判读； 所述的待测基因为恶性疟原虫特有基因，分别是mdr基因、crt基因和18SrRNA基因。
2. 根据权利要求1所述的快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：所述的特异 性引物和探针分别为： mdr基因 Pfl-F:GTGTTGAAAGATGGGTAAAGAGCAGA(SEQ ID NO 1) Pfl-R:CGTACCAATTCCTGAACTCACTTGTTC(SEQ ID NO 2) Probe:GAACAAAAAGAGTACCGCTGAA(SEQ ID NO 3) crt基因 Pf2-F:GGTGGAGGTTCTTGTCTTGGTAAATG(SEQ ID NO 4) Pf2-R:CGGATGTTACAAAACTATAGTTACC(SEQ ID NO 5) Probe ：GTATTATTTATTTAAGTGTATGTGT(SEQ ID NO 6) 18SrRNA 基因 Lm2-F ：ATTGCTTTTGAGAGGTTTTGTTAC(SEQ ID NO 7) Lm2-R ：GCTGTAGTATTCAAACACAATGAAC(SEQ ID NO 8) Probe:CATAACAGACGGGTAGTCAT(SEQ ID NO 9)。
3. 根据权利要求1所述的快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤⑴中 所述的DNA提取可使用血液样本基因组DNA提取试剂盒提取恶性疟原虫DNA ;取50ul全血， 按照试剂盒说明书中的提取步骤提取DNA。
4. 根据权利要求1所述的快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤⑵中 所述的 PCR 反应体系为：2X Mater mix 12.5ul，PrimerD 2.5ul，PCR Grade H20 4ul，PCR Control lul,Sample 5ul〇
5. 根据权利要求1所述的快快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤（2) 中所述的PCR扩增的反应条件是：95°C预变性15min ;95°C变性15s，60°C退火40s，72°C延 伸30s，45个循环，72°C延伸lmin。
6. 根据权利要求1所述的快快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤（3) 中所述的杂交反应条件是：注入的杂交液为14. 5ul，反应时间为30min。
7. 根据权利要求1所述的快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤（2)所 述的PCR扩增与步骤（3)所述的杂交在芯片仪上完成。
8. 根据权利要求1所述的快快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：步骤（4) 中所述的清洗条件是：3000rpm，2min。
9. 根据权利要求1所述的快速灵敏的恶性疟原虫检测方法，其特征在于：芯片系统直 接检测血液中提取的DNA，检测的灵敏限为135copy DNA分子。
【专利摘要】本发明涉及一种快速、灵敏恶性疟原虫的检测方法。本发明的检测方法整合了聚合酶链式反应PCR和微阵列这两种强大的分子生物学技术，把PCR杂交的探针直接固定在微阵列中的杂交舱中，与PCR反应室在同一张芯片上；检测方法包括：血液样本DNA液提取，PCR扩增，杂交，清洗，结果判读。本发明能对恶性疟原虫进行快速灵敏的检测，通过本发明可大幅度提高进出口口岸一线检验检疫人员的检测效率，既可减少工作量、又可最大限度地解决传统检测方法可能存在的阳性漏检问题，从而最大限度地防止疟原虫疫情的发生。
【IPC分类】C12Q1-04, C12Q1-68, C12R1-90
【公开号】CN104531840
【申请号】CN201410705508
【发明人】田桢干, 张子龙, 李美, 王雪嵋, 李深伟, 曹敏, 汤林华
【申请人】中华人民共和国上海出入境检验检疫局
【公开日】2015年4月22日
【申请日】2014年11月26日